观察与定量成纤维细胞介导的纤维蛋白凝胶收缩

本实验的总体目标是观察并分析细胞-基质相互作用对纤维蛋白凝胶系统中纤维重排及基质重塑活动的影响。该目标通过以下步骤实现：首先，在环境可控的生物反应器内，将含有微珠的三维纤维蛋白凝胶在载玻片上进行聚合；第二步，制备高浓度的细胞悬液，用于将成纤维细胞或X外植块以特定几何图案定位在凝胶表面。

接下来，在48小时内每15分钟使用微分干涉相差显微镜对样品进行成像。最后一步是通过数字图像相关技术，测量凝胶不同区域中以应变形式表现的纤维蛋白重组和重塑程度。最终，这种外植体系统可使细胞排列成简单的几何图案，从而更易于观察和探究细胞驱动基质重塑及纤维重新排列的潜在机制。

该方法可以解答机械生物学领域的一些关键问题，例如，特定的空间和时间机械信号对细胞行为会产生何种影响，以及这些影响如何导致周围组织基质发生相应变化。本实验流程中将由我实验室的研究生阿拉伯·德耶稣（Arabic de Jesus）进行演示。将纤维蛋白原在37摄氏度的预热生理盐水中轻轻溶解，过夜孵育，以制备浓度为33.3毫克/毫升的储备溶液。在Perfil上制备模板，用于按照期望的几何间距布置每个x型组织块的位置。

每个点之间的距离约为一到两毫米。此距离对应于在组织块之间产生纤维排列的理想间距。接下来，使用70%乙醇彻底清洁生物反应器的所有组件，并在接种前将清洁后的组件置于组织培养罩的紫外线下照射两到三小时。

在对生物反应器的各个组件进行灭菌后，使用胶带将模板固定在直径为60毫米的盖玻片下方待制备样品的区域。接下来，依次制备微珠悬浮液、纤维蛋白原和凝血酶。储备液的配制方法为：取0.017毫升微珠储备液与0.149毫升DMEM加入微型离心管中，混合均匀，得到浓度为每毫升1000万个微珠的工作液。

随后超声处理悬浮液10分钟，以分散微珠并均质化溶液。取0.22毫升纤维蛋白原储备液，加入0.44毫升20毫摩尔的HEPES缓冲液和0.1667毫升微珠溶液至一个15毫升离心管中。轻轻混匀各组分，然后将该离心管置于冰上，放入另一个15毫升离心管中。

混合在一起：32.8 µL 的凝血酶，溶解于生理盐水中，浓度为每毫升 25 单位；131 µL 的 20 毫摩尔 HEPES 缓冲液，以及 2.46 µL 的 2 摩尔氯化钙。

接下来，用移液器将配制好的凝血酶和纤维蛋白原溶液上下吹打5到10次，轻轻混匀，直至溶液分布均匀。混合过程中尽量避免产生气泡，移液时不要将移液器中的液体完全排空。尽快将混合溶液加入到盖玻片上8毫米见方的PDMS模具中，室温下静置，使凝胶发生聚合。

加入凝血酶后，溶液将在聚合后约30秒内迅速形成凝胶。密封生物反应器，并开始收获细胞。使用胰蛋白酶从T75培养瓶中收获70%至90%融合度的人类皮肤成纤维细胞，并以200 × g离心5分钟。将生物反应器转移至生物安全柜中，在无菌条件下小心移除盖子。随后吸除培养基，并将细胞沉淀重悬于DMEM中，终浓度为每毫升2000万细胞，含10% FBS。

接下来，通过将细胞加载到微量移液器中，并向已聚合的纤维蛋白凝胶内注入 0.3 µL 细胞悬液来制备外植体。按照模板上的分布模式，每个外植体应包含约 6,000 个细胞。在外植体定位至凝胶上后，密封生物反应器。

接下来，插入加热模块并将热电偶连接到温度控制器。将温度控制器设置为37摄氏度，孵育凝胶1小时，以使细胞沉降并附着于纤维蛋白基质。然后，将约5毫升经5%二氧化碳预平衡2至3小时的DMEM培养基，补充10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素、0.1%两性霉素B以及10微克/毫升抑肽酶，直接加入生物反应器腔室中。

然后重新密封生物反应器。使用注射器通过进样口的带刺接头加入额外的五毫升含二氧化碳预平衡培养基，以完全充满生物反应器，并小心去除形成的气泡。设置一个注射泵，配备装有额外5%二氧化碳预平衡培养基的10毫升或30毫升注射器。通过鲁尔锁扣连接的无菌管路将注射器直接连接到生物反应器盖上的进样口。

将注射泵的灌注速率设置为 0.01 毫升每分钟。然后将改造过的管路连接到两个出口端口，并将管路末端放入一个 100 毫升的烧杯中。为收集废液，使用实验室升降架调节进液和出液管路的高度，以避免生物反应器供液系统中产生压力差。

在整个实验过程中，持续向生物反应器供应含5%二氧化碳的预平衡培养基。为维持pH、提供营养并清除代谢废物，一支装有培养基的10毫升注射器大约可持续使用16小时。将20倍DIC物镜置于显微镜观察口下方，并确保偏振器、检偏器和棱镜均已正确就位。

然后打开成像软件。将物镜聚焦在三个 x explan 之间的区域，并在成像软件中保存该位置的 X、Y 和 Z 坐标。为了对 x explan 之间及周围整个区域进行成像，请选择获取大视野图像的选项，并指定该区域的大小。

这将允许在指定区域周围获取多张图像，并拼接成一幅较大的 tiled 图像。将光强和曝光时间设置为尽可能低的值，以帮助避免因光毒性引起的细胞死亡，同时仍能提供足够的分辨率来区分细胞、微珠和纤维蛋白纤维。请注意，在本实验中，由于凝胶内光散射微珠的密度较高，纤维蛋白纤维不可见；可降低微珠密度或凝胶厚度，以便观察纤维蛋白纤维。

接下来，开始进行应变追踪。首先创建或下载自定义的 MATLAB 代码，然后利用凝胶中全程分布的微珠作为参考点对图像进行配准。图像配准可确保每次获取的图像都在完全相同的位置采集。

通过每15分钟拍摄一次平铺图像，观察到离体样本中纤维的重新排列。在48小时的时间段内，从平铺图像中提取各个区域，并使用应变追踪算法进行分析。为了测量局部应变，根据对应于束带区域的纤维重新排列范围内的微珠位移等高线图，显示了最大主应变的分布情况。

一旦掌握，若操作得当，该技术可在大约三到四小时内完成。在此步骤之后，可进一步开展其他方法，例如胶原蛋白和细胞骨架蛋白的荧光标记，以及细胞迁移的定量分析，以回答更多问题，例如：哪些力学生物学通路参与了组织重塑过程，以及这些过程如何受到各种生物化学物质的调控。