观察和量化纤维细胞介导的纤维素凝胶压实

该程序的总体目标是观察和分析细胞基质相互作用对纤维蛋白凝胶系统中纤维重排列和基质重塑活动的影响。这是通过首先聚合，将含有微珠的三维纤维蛋白凝胶聚合到环境受控生物反应器内的盖玻片上来实现的。第二步是制备高度浓缩的细胞悬液，用于将成纤维细胞或 X 外植体簇定位为凝胶表面的几何图案。

接下来，在 48 小时内，使用微分干涉造影显微镜每 15 分钟对样品进行一次成像。最后一步是使用数字图像相关性测量纤维蛋白重组和重塑的程度，其形式为来自凝胶不同区域的应变。最终，这种外植体系统允许将细胞排列成简单的几何图案，这使得可视化和探测细胞驱动基质重塑和纤维重排列的机制变得更加容易。

这种方法可以回答机械生物学领域的关键问题，例如非常空间和时间的机械线索对细胞行为有什么影响，以及这些变化在周围组织基质中产生的变化。在这个过程中演示的是 Arabic de Jesus，我实验室的一名研究生将纤维蛋白原在 37 摄氏度下轻轻溶解到预热盐水中过夜，制成每毫升 33.3 毫克的储备溶液。在 perfil 上准备一个模板，以按照所需的几何空间布置每个 x 外植体的位置。

每个点相距约 1 至 2 毫米。该距离对应于在外植体之间产生纤维对齐的理想间距。接下来，使用 70% 乙醇彻底清洁生物反应器的所有组分，并将清洁后的组分放在组织培养罩的紫外线下 2 到 3 小时，然后再进行。

反应器的组件消毒后，将模板贴在 60 毫米直径的盖玻片区域下方，使用胶带制备样品。接下来，准备微珠悬浮液，然后准备纤维蛋白原和凝血酶。储备液将 0.017 毫升微珠储备液和 0.149 毫升 DMEM 混合到微量离心管中，以达到每毫升 1000 万个珠子的浓度。

然后对悬浮液进行超声处理 10 分钟，以分散微珠并使溶液均质化。将 0.22 毫升纤维蛋白原溶液加入 0.44 毫升 20 毫摩尔堆缓冲液中，并在 15 毫升离心管中加入 0.1667 毫升微珠溶液。轻轻混合组分，然后将试管放在单独的 15 ml 离心管中的冰上。

混合在一起。32.8 微升凝血酶以每毫升 25 单位溶解在盐水中。131 微升 20 毫摩尔堆缓冲液和 2.46 微升 2 摩尔氯化钙。

接下来，小心地混合制备的凝血酶和纤维蛋白原溶液，上下吹打 5 到 10 次，直到溶液均匀分布。混合时不要完全排出移液器，以尽量减少将气泡引入混合物中。尽快将混合溶液移液到盖玻片上 8 毫米见方的 PDMS 模具中，让凝胶在室温下聚合。

添加凝血酶将使溶液在聚合后约 30 秒内快速凝胶化，密封生物反应器并准备细胞外植体，以开始使用胰蛋白酶从 T 75 培养瓶中收获 70% 至 90% 汇合的人真皮成纤维细胞，并以 200 倍 G 的速度旋转 5 分钟。将生物反应器转移到生物安全柜中，并在无菌条件下小心地取下盖子。然后吸出培养基，在含 10% FBS 的 DMEM 中将细胞沉淀重悬至每毫升 2000 万个细胞的最终浓度。

接下来，通过将细胞加载到微量移液器中并将 0.3 微升细胞悬液注入聚合纤维蛋白凝胶中来制备外植体。按照模板上的模式，每个解释应包含大约 6， 000 个单元格。将外植体定位在凝胶上后，密封生物反应器。

接下来，插入加热块并将热电偶连接到温度控制器。将温度控制器设置为 37 摄氏度，并将凝胶孵育 1 小时，让细胞沉淀并附着在纤维蛋白基质上。然后在大约 5 毫升的 DMEM 中，用 5% 二氧化碳调节 2 到 3 小时，并补充 10% 胎牛血清、1% 青霉素、链霉素、0.1% 两性霉素 B 和 10 μg/mL，抑肽酶直接进入生物反应器室。

然后重新密封生物反应器。使用注射器通过入口上的倒钩接头输送额外的 5 毫升二氧化碳条件培养基，以完全填充生物反应器，小心地去除形成的任何气泡，使用填充额外 5% 二氧化碳条件培养基的 10 毫升或 30 毫升注射器设置注射泵。将注射器直接连接到生物反应器盖上的入口，并配有诱饵锁无菌管路。

将注射泵的灌注速率设置为每分钟 0.01 毫升。然后将修改后的管子连接到两个出口，并将两端放入 100 毫升烧杯中。要收集废液，请使用实验室千斤顶设置入口和出口进料的高度，这样生物反应器供应中就不会产生压差。

在整个实验过程中，将新鲜的 5% 二氧化碳条件培养基添加到生物反应器中。为了保持 pH 值、营养物质供应和清除废物，一个装满培养基的 10 毫升注射器将持续约 16 小时。将 20 XDIC 物镜放置在显微镜的视窗下方，并确保偏振器分析仪和棱镜都就位。

然后打开成像软件。将物镜聚焦在三个 x explan之间的区域，并将该位置的 X、Y 和 Z 坐标保存在成像软件中。要对 x 解释之间和周围的整个区域进行成像，请选择获取大图像的选项并指定区域的大小。

这将允许在指定区域周围采集多个图像并创建一个大型平铺图像，将光强度和曝光时间设置为尽可能低的值。这将有助于避免光毒性引起的细胞死亡，同时仍能提供足够的分辨率来区分细胞、微珠和纤维蛋白纤维。请注意，在这个特定的实验中，由于凝胶中光散射珠的高密度，纤维蛋白纤维不可见，降低珠子密度或凝胶厚度以观察纤维蛋白纤维。

接下来，开始应变跟踪。首先创建或下载自定义 MATLAB 代码，然后使用整个凝胶中的微珠作为参考点配准图像。注册图像将确保每次获取的图像都是在完全相同的位置拍摄的。

通过每 15 分钟捕获平铺图像，在 ex解释之间观察到纤维重新排列。在 48 小时内，从平铺图像中提取各个区域，并使用应变跟踪算法进行分析。为了测量微珠位移等值线的局部应变，显示了与带子相对应的纤维重新对准区域中最大主应变的分布。

一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在大约三到四个小时内完成。在此程序之后，可以执行其他方法，例如胶原蛋白和细胞骨架蛋白的荧光标记以及细胞迁移的定量，以回答其他问题，例如组织重塑涉及哪些机械生物途径，以及这些过程如何被各种生化物质调节。