Name: 观察和量化纤维细胞介导的纤维素凝胶压实 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-16T13:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 37 s
Description: 了解纤维细胞介导的纤维素凝胶压实机制，利用延时显微成像技术观察48小时内纤维重组与基质重塑动态过程。该方法结合数字图像相关分析，为组织工程和再生医学研究提供重要的细胞-基质相互作用数据。

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感谢 George Giudice 和 Steven Eliason 捐赠人真皮成纤维细胞，感谢 Ramesh Raghupathy 在菌株追踪算法方面提供的帮助。&#160;本研究工作得到了美国教育部国家急需领域研究生资助奖学金（GAANN P200A120071）的支持。

1. 模板制备
在Parafilm上制备一个模板，用于确定每个外植体的位置，按照所需的几何形状排列（图1A和1B）。每个外植体之间间隔约1-2 mm。此距离对应于在外植体之间形成纤维定向排列的理想间距。用胶带将模板固定在盖玻片上待制备样品区域的下方。
2. 灭菌
实验前，使用70%乙醇彻底清洁生物反应器的所有组件，并在紫外光下灭菌2-3小时。若使用其他容器替代生物反应器，则应采用适当的灭菌技术。有关使用玻璃底培养皿的说明，请参见步骤4.12。
3. 纤维蛋白凝胶制备
在生物反应器各组件灭菌后，于盖玻片表面浇铸一层薄薄的纤维蛋白凝胶。制备用于生成 6.6 mg/ml&#160;纤维蛋白凝胶的纤维蛋白原和凝血酶储备溶液的详细步骤见 Sander et al.13&#160;。Ye et al.19 提出的制备 3.3 mg/ml&#160;纤维蛋白凝胶的类似方案也可在 JoVE 网站上查阅。
<ol>
	<li>在离心管中将 0.017 ml&#160;的荧光微珠原液与 0.149 ml&#160;DMEM 混合，配制浓度为每毫升 1000 万个微珠的 DMEM 微珠溶液。该溶液用于辅助追踪凝胶的位移。</li>
	<li>对该悬浮液进行超声处理 10 分钟&#160;，以充分分散微珠并使溶液均一化。</li>
	<li>纤维蛋白原溶液 — 在一个 15 ml 离心管中，将 0.22 ml 纤维蛋白原原液与 0.44 ml 20 mM HEPES 缓冲液混合，然后加入步骤 3.1 中制备的含微珠的 DMEM 溶液 0.1667 ml。</li>
	<li>凝血酶溶液 — 在另一个 15 ml 离心管中，将 0.0328 ml 凝血酶原液、0.131 ml 20 mM HEPES 缓冲液和 0.00246 ml 2 M CaCl2 混合。</li>
	<li>用移液器将凝血酶溶液（步骤 3.4）与纤维蛋白原溶液（步骤 3.3）上下吹打 5–10 次，使其充分混合均匀。尽量避免产生气泡。为减少气泡生成，混合过程中注意不要将移液器完全排空。</li>
	<li>加入凝血酶后溶液会迅速形成凝胶（约 30 秒）。应尽快将混合液滴加至盖玻片上，并在室温下静置使其充分聚合。</li>
	<li>密封生物反应器，插入加热模块，并将热电偶连接至温度控制器。将凝胶在 37 °C 条件下孵育 15–30 分钟。</li>
</ol>
4. 细胞外植体制备
<ol>
	<li>移除含有真皮成纤维细胞的 T-75 培养瓶中的培养基。</li>
	<li>用约 5 ml&#160;磷酸盐缓冲液（PBS）小心冲洗表面，以去除血清蛋白。加入 1 ml 胰蛋白酶-EDTA 溶液，孵育 3 分钟，或直至细胞脱落。</li>
	<li>待细胞脱落后，将细胞悬液在离心机中以 200 × g 离心 5 分钟。弃去上清液，并将沉淀重悬于适量 DMEM 培养基中，使最终细胞浓度为 2000 万细胞/ml。</li>
	<li>在细胞离心过程中，将生物反应器从加热块和热电偶上断开。将生物反应器转移至生物安全柜中，并按照无菌操作技术小心打开盖子。</li>
	<li>使用移液器将 0.3 µl 细胞悬液按照模板上的图案点样至已聚合的纤维蛋白凝胶表面，以制备组织块。每个组织块应包含约 6,000 个细胞。确保使用低体积移液器吸头（0.1–10 µl）。</li>
	<li>在 37 °C 条件下孵育 1 小时&#160;，使细胞沉降并附着于纤维蛋白基质。</li>
	<li>保持生物反应器开放状态，直接向反应器腔室中加入约 5 ml&#160;DMEM 培养基，该培养基需添加 10% 胎牛血清（FBS）、1% 青霉素-链霉素、0.1% 两性霉素 B 和 10 mg/ml&#160;抑肽酶。DMEM 含有碳酸氢盐缓冲体系，需 5% CO2&#160;以维持中性 pH 值。由于生物反应器未提供 CO2，使用前需将培养基置于含 5% CO2&#160;的培养箱中预平衡 2–3 小时&#160;。抑肽酶是一种丝氨酸蛋白酶抑制剂，广泛用于减缓纤维蛋白降解20。</li>
	<li>重新密封生物反应器。使用注射器通过入口端的卡套接头缓慢注入额外 5 ml&#160;经 5% CO2&#160;预平衡的培养基。缓慢加样，确保生物反应器腔室完全充满，并小心去除反应器内形成的气泡。</li>
	<li>在整个实验过程中持续向生物反应器供应新鲜的、经 5% CO2 预平衡的培养基，以维持 pH 值、提供营养并清除代谢废物。使用装有 10 ml&#160;或 30 ml&#160;经 5% CO2&#160;预平衡培养基的注射器连接注射泵。通过鲁尔锁紧式无菌管路将注射器直接连接至生物反应器盖上的入口端口。拆下雄性接头，并将管路连接至生物反应器上的卡套接头（参见 图&#160;1C）。</li>
	<li>设定灌注速率为 0.01 ml/min。将改造后的管路分别连接至两个出口端口，并将管路末端置于 100 ml&#160;烧杯中以收集废液。</li>
	<li>使用实验室升降台调节进液和出液管路的高度，以避免生物反应器内产生压力差（参考 图&#160;1D）。</li>
	<li>若无生物反应器，可在 35 mm 玻璃底培养皿中制备样品，并使用玻璃盖片。应选择盖玻片尺寸与所用物镜组匹配的培养皿。在培养皿中制备的样品应置于 37 °C、5% CO2 的培养箱中维持培养。 
	注意：聚苯乙烯会偏振光，干扰微分干涉相差（DIC）成像，因此若需进行 DIC 成像，应使用玻璃盖片。相差成像可作为替代的成像方式。在培养箱与显微镜之间转移培养皿将导致图像配准困难。若图像未能准确配准，则第&#160;6 节中计算的应变值将不准确。</li>
</ol>
5. 时间序列成像
<ol>
	<li>样本制备完成后，重新密封生物反应器，重新连接加热模块和热电偶，并将生物反应器温度设定为 37 °C。</li>
	<li>将生物反应器放置在显微镜载物台的电动平台上。将 20X&#160;DIC 物镜移至观察窗下方。若无高精度电动载物台，也可使用较低倍率的物镜。确保偏振器、检偏器和棱镜均处于正确位置。此外，也可采用相差显微镜对样本进行成像。</li>
	<li>打开成像软件。</li>
	<li>调节物镜焦距，聚焦于三个外植体之间的区域。</li>
	<li>在成像软件中保存该位置的坐标（x、y 和 z）。</li>
	<li>为了对三个外植体之间及周围区域进行完整成像，选择获取大视野图像的选项，并设定所需成像区域的大小。该功能将自动采集指定区域周围的多幅图像，并拼接形成一幅覆盖更大样本区域的拼接图像。</li>
	<li>设定曝光时间和光照强度为尽可能低的数值，以避免光毒性引起的细胞死亡，同时仍能提供足够的分辨率以区分细胞、微珠和纤维蛋白纤维。</li>
</ol>
6. 应变追踪
有关所用菌株追踪软件的详细信息和操作说明（图&#160;2），请参见 Raghupathy et al.21&#160;。该算法为定制的 MATLAB 代码，可从 <a href="http://www.license.umn.edu/default.aspx">http://www.license.umn.edu/default.aspx</a> 下载。请注意，微分干涉差（DIC）图像通常具有足够的纹理特征用于应变追踪。添加微珠的目的是对计算得到的应变场进行验证。如果要进行应变追踪，则必须确保所获取的图像位于完全相同的位置，以实现图像配准。未配准的图像将产生虚假的应变结果。

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</ol>

无利益冲突声明。

本方案旨在观察和量化细胞介导的细胞外基质（ECM）重塑过程中所涉及的力学机制。此类过程是多种生物学现象的基础，并在组织工程2,22、减少瘢痕形成1,23以及理解病理性组织重塑12,24等方面具有重要意义。使用延时微分干涉差（DIC）显微镜技术，可解析并量化由细胞牵引力引起的纤维蛋白纤维的位移与排列情况。此处观察到的重组现象是重塑过程的第一阶段，其组织模式与胶原蛋白中观察到的模式一致11。重组之后，将伴随发生纤维蛋白降解与细胞外基质合成的共同作用。重塑过程中的重组阶段通常持续数小时至数天，而合成阶段则需要数周时间才能完成13。本文所描述的系统可连续运行数周，因此可被调整用于监测这些后期事件。
对该技术的可能改进包括改变外植体的位置、数量和大小，以创建不同的几何形状并观察排列模式的差异。外植体也可通过将其置于纤维蛋白层之间，而非表面，包埋于凝胶内部。其他改进方法可能涉及使用其他可形成纤维的凝胶替代纤维蛋白，例如胶原蛋白，或添加其他细胞外基质蛋白，如纤连蛋白或透明质酸。
...

研究细胞-基质相互作用的重要工具之一是细胞接种的胶原凝胶1,2。该凝胶提供了一种三维环境，相较于传统的二维培养，更接近组织的体内特性，更有利于理解细胞行为3。早期研究发现，当成纤维细胞均匀分布于胶原凝胶中时，细胞会迅速聚集胶原纤维并使凝胶收缩致密4,5。在自由漂浮的凝胶中，收缩性成纤维细胞在凝胶完全收缩后很快进入静息状态1,6,7。而在边界受限的凝胶中，成纤维细胞则保持在活跃的合成状态8&#160;，并根据凝胶几何形状和外部约束条件产生纤维定向排列5,9。细胞活性的差异似乎源于细胞通过整合素对凝胶内胶原纤维施加牵引力时所产生的内部张力（或张力缺失）。
该技术的一种变体涉及将成纤维细胞外植块（i.e.&#160;细胞团）以一定间距置于胶原凝胶中，观察细胞-基质相互作用以及外植块之间纤维逐渐定向排列的现象（有时称为类韧带样条带）10-12。外植体系统的主要优势在于，它可将细胞排列成简单的几何图案，从而更易于观察和探究细胞驱动纤维重排的潜在机制。这些排列模式——主要取决于细胞牵引力、细胞空间分布、凝胶几何形状以及凝胶所受机械约束之间的相互作用——对于理解组织的全局结构、力学功能及局部力学微环境具有核心意义13。
在组织工程领域，一种制备具有力学功能的工程化组织的策略是调控细胞收缩过程中形成的纤维排列模式，使工程化组织的纤维取向与天然组织相似14,15。这种有序排列被认为对于工程化组织重现天然组织复杂的力学行为至关重要。该策略的一种改进方法是用纤维蛋白凝胶替代胶原凝胶16。纤维蛋白凝胶在收缩过程中会形成与胶原凝胶相似的纤维排列模式。随着时间推移，纤维蛋白被降解，并被细胞合成的细胞外基质（ECM）所取代，而新生成的ECM会沿初始纤维蛋白的纤维排列方向进行沉积。与基于胶原凝胶构建的组织相比，由此获得的工程化组织具有显著改善的力学性能17。
纤维蛋白凝胶中的排列过程及后续重塑事件以一种复杂且尚未被充分理解的方式进行。为了更好地表征这些相互作用及其对细胞行为和细胞外基质（ECM）重塑的影响，我们开发了一种基于组织块法的实验流程。在该方法中，将成纤维细胞组织块以不同的几何模式放置于纤维蛋白凝胶表面。凝胶被置于一个环境可控、安装在显微镜上的生物反应器中18，并通过延时微分干涉差（DIC）显微镜监测凝胶收缩和纤维重新排列的过程。利用定制算法对位移场进行量化分析。这些实验所获得的数据对于多种生理与病理过程具有广泛意义，包括优化组织工程策略、促进伤口愈合以及治疗病理性组织重塑。

<table><tbody><tr><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8630</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4648</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gibco</td><td>11965-092</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2942</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0887</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sigma-Aldrich</td><td>223506</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen</td><td>3000</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lonza</td><td>DE14-701F</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Molecular Probes</td><td>F8858</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GIBCO</td><td>A10483-01</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GIBCO</td><td>11430-030</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fisher-Scientific</td><td>SS264-1</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3428-25MG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biotense Bioreactor</td><td>ADMET</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ti-Eclipe 显微镜</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>#0 35 mm 玻璃底培养皿</td><td>MatTek</td><td>P35G-0-20-C</td><td></td></tr><tr><td>#0 35 mm 玻璃顶培养皿</td><td>MatTek</td><td>P35GTOP-0-20-C</td><td></td></tr><tr><td>塑料鲁尔接头，带鲁尔端的PVC管</td><td>Cole-Parmer</td><td>30600-65</td><td></td></tr></tbody></table>

观察与定量成纤维细胞介导的纤维蛋白凝胶收缩

Observing and Quantifying Fibroblast-mediated Fibrin Gel Compaction

嵌入胶原蛋白和纤维蛋白凝胶中的细胞会附着于凝胶纤维并对其施加牵引力。这些力可导致凝胶微结构的局部和整体重组与重新排列。该过程以一种复杂的方式进行，部分取决于细胞的位置、凝胶的几何形状以及对凝胶施加的力学约束之间的相互作用。为了更好地理解这些变量如何产生整体纤维排列模式，我们采用延时微分干涉差（DIC）显微镜结合环境可控的生物反应器，观察几何排布的外植体（成纤维细胞簇）之间的收缩过程。随后利用定制的图像处理算法分析图像，获得应变分布图。通过该技术获取的信息可用于探究多种细胞-基质相互作用的力学生物学特性，这对于理解伤口愈合、疾病发展以及组织工程应用中的相关过程具有重要意义。

组织重塑是一个复杂的过程，部分由细胞与周围基质之间的相互物理作用所驱动。细胞会重新排列周围的纤维，并在纤维网络中产生张力。纤维的取向和力学环境反过来又调控细胞行为，从而使细胞和基质共同发生全局性重排，形成重塑后的组织。在本实验中，最初呈圆形形态的外植块细胞开始向凝胶内延伸，并黏附于纤维蛋白纤维上（图 3）。细胞施加的牵引力通过凝胶传播，诱导纤维沿外植块之间的轴线方向平行排列。数小时内，“带状”结构变得可见（图 3A）。应变测量结果也表明，最大应变出现在垂直于外植游戏副本轴线的方向上（图 3D 和 图 3E）。该区域的应变最高，是因为此区域的纤维可自由地向轴线方向移动。
本方案为研究细胞诱导的基质重塑以及纤维取向对细胞行为的影响提供了一个简便的模型。利用细胞外植体可简便地控制细胞簇的空间分布即 外植体）。外植体还能集中细胞产生的作用力，从而在较小区域内快速形成纤维排列，便于成像观察。随后利用对外植体及其周围区域拍摄的高分辨率拼接图像...

采用延时显微镜和图像处理技术，在环境可控的生物反应器中对成纤维细胞介导的凝胶收缩及纤维蛋白纤维重排进行为期48小时的观察与分析&#160;时期。

嵌入胶原和纤维蛋白凝胶中的细胞会附着于凝胶纤维并对其施加牵引力。这些力可导致局部和整体的……

本实验的总体目标是观察并分析细胞-基质相互作用对纤维蛋白凝胶系统中纤维重排及基质重塑活动的影响。该目标通过以下步骤实现：首先，在环境可控的生物反应器内，将含有微珠的三维纤维蛋白凝胶在载玻片上进行聚合；第二步，制备高浓度的细胞悬液，用于将成纤维细胞或X外植块以特定几何图案定位在凝胶表面。接下来，在48小时内每15分钟使用微分干涉相差显微镜对样品进行成像。最后一步是通过数字图像相关技术，测量凝胶不同区域中以应变形式表现的纤维蛋白重组和重塑程度。最终，这种外植体系统可使细胞排列成简单的几何图案，从而更易于观察和探究细胞驱动基质重塑及纤维重新排列的潜在机制。该方法可以解答机械生物学领域的一些关键问题，例如，特定的空间和时间机械信号对细胞行为会产生何种影响，以及这些影响如何导致周围组织基质发生相应变化。本实验流程中将由我实验室的研究生阿拉伯·德耶稣（Arabic de Jesus）进行演示。将纤维蛋白原在37摄氏度的预热生理盐水中轻轻溶解，过夜孵育，以制备浓度为33.3毫克/毫升的储备溶液。在Perfil上制备模板，用于按照期望的几何间距布置每个x型组织块的位置。每个点之间的距离约为一到两毫米。此距离对应于在组织块之间产生纤维排列的理想间距。接下来，使用70%乙醇彻底清洁生物反应器的所有组件，并在接种前将清洁后的组件置于组织培养罩的紫外线下照射两到三小时。在对生物反应器的各个组件进行灭菌后，使用胶带将模板固定在直径为60毫米的盖玻片下方待制备样品的区域。接下来，依次制备微珠悬浮液、纤维蛋白原和凝血酶。储备液的配制方法为：取0.017毫升微珠储备液与0.149毫升DMEM加入微型离心管中，混合均匀，得到浓度为每毫升1000万个微珠的工作液。随后超声处理悬浮液10分钟，以分散微珠并均质化溶液。取0.22毫升纤维蛋白原储备液，加入0.44毫升20毫摩尔的HEPES缓冲液和0.1667毫升微珠溶液至一个15毫升离心管中。轻轻混匀各组分，然后将该离心管置于冰上，放入另一个15毫升离心管中。混合在一起：32.8 µL 的凝血酶，溶解于生理盐水中，浓度为每毫升 25 单位；131 µL 的 20 毫摩尔 HEPES 缓冲液，以及 2.46 µL 的 2 摩尔氯化钙。接下来，用移液器将配制好的凝血酶和纤维蛋白原溶液上下吹打5到10次，轻轻混匀，直至溶液分布均匀。混合过程中尽量避免产生气泡，移液时不要将移液器中的液体完全排空。尽快将混合溶液加入到盖玻片上8毫米见方的PDMS模具中，室温下静置，使凝胶发生聚合。加入凝血酶后，溶液将在聚合后约30秒内迅速形成凝胶。密封生物反应器，并开始收获细胞。使用胰蛋白酶从T75培养瓶中收获70%至90%融合度的人类皮肤成纤维细胞，并以200 × g离心5分钟。将生物反应器转移至生物安全柜中，在无菌条件下小心移除盖子。随后吸除培养基，并将细胞沉淀重悬于D

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Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

观察和量化纤维细胞介导的纤维素凝胶压实

本视频展示了体外血管生成实验的方案，该实验可重现血管生成的多个阶段。展示了出芽、管腔形成、分支和吻合——血管生成的关键特征——的时间推移图像。...

优化的纤维蛋白凝胶珠管形成实验用于血管生成研究

在本视频中，我们演示了用于制备适用于细胞培养的柔性、细胞外基质（ECM）包被基底的实验技术，这些基底可用于牵引力显微镜检测，并可用于观察细胞外基质刚度对细胞行为的影响。...

用于量化细胞收缩的投诉基质的制备

本视频展示了用于评估细胞外基质刚度依赖性的定量延时显微镜技术 单核细胞增生李斯特菌...

定量延时显微镜技术用于评估细胞外基质刚度依赖性细菌扩散

该模型系统始于含有肌成纤维细胞的纤维蛋白凝胶，可用于以非破坏性方式实时研究内源性胶原蛋白的（再）组织过程。该模型系统具有高度可调性，可结合不同细胞来源和培养基添加剂使用，并能轻松适应特定研究需求。...

利用肌成纤维细胞构建纤维蛋白基组织工程支架并施加约束与应变以诱导细胞和胶原的重排

本文介绍了用于研究因疾病状态导致的正常与异常血凝块结构之间形态学差异的实验技术，包括血液样本制备、共聚焦显微镜观察以及溶血速率分析。...

正常与疾病状态下纤维蛋白凝块结构的实验与成像技术研究

本文介绍一种利用患者来源的手术切除纤维血管组织进行三维原生组织表征和离体培养，以研究增殖性糖尿病视网膜病变病理生理学的实验方案。该离体培养模型还可用于测试或开发新的治疗方法。...

增殖性糖尿病视网膜病变中纤维血管并发症的离体组织培养模型

获得成纤维细胞的纯种群体对于研究其在伤口修复和纤维化中的作用至关重要。本文详细描述了一种从正常和损伤的小鼠心脏中分离成纤维细胞和肌成纤维细胞的方法，并通过免疫荧光、逆转录PCR（RTPCR）、荧光辅助细胞分选以及胶原凝胶收缩实验对细胞的纯度和功能特性进行表征。...

成年心脏成纤维细胞与肌成纤维细胞的分离与鉴定

本方法涉及在允许活细胞共聚焦显微镜观察的同时，对嵌入硅橡胶中的三维软水凝胶进行单轴拉伸。文中展示了对外部和内部水凝胶应变以及纤维取向的表征。所开发的装置与实验方案可用于评估细胞对不同应变条件的响应。...

活体显微成像下三维水凝胶的可控应变

本文介绍了一种用于在具有双极的多孔板中平行培养48个组织的工程化结缔组织的制备方案，适用于机制研究、疾病建模和筛选应用。该方案适用于来自不同器官和物种的成纤维细胞，并以人原代心肌成纤维细胞为例进行了演示。...

用于筛选应用的成纤维细胞来源人源化工程化结缔组织

本文介绍了如何使用3D生物打印光可调水凝胶来研究细胞外基质硬化和成纤维细胞活化。...

3D生物打印光可调水凝胶以研究成纤维细胞活化

机械分离的基质血管组分（SVF）与纤维蛋白水凝胶联用，可为具有多种适应症的活性脂肪来源基质细胞提供一种简便且高效的载体，适用于组织工程或伤口愈合等用途。本文介绍了一种用于转化研究和临床应用的机械法SVF（mSVF）-纤维蛋白水凝胶构建物的制备方法。...

机械分离基质血管组分与纤维蛋白水凝胶的联合应用：一种处理方案

了解纤维细胞介导的纤维素凝胶压实机制，利用延时显微成像技术观察48小时内纤维重组与基质重塑动态过程。该方法结合数字图像相关分析，为组织工程和再生医学研究提供重要的细胞-基质相互作用数据。

观察与定量成纤维细胞介导的纤维蛋白凝胶收缩

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