Name: 通过双折射和触摸诱发逃逸反应分析斑马鱼幼鱼骨骼肌缺陷 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-13T13:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: 了解利用双折射和触摸诱发逃逸反应评估斑马鱼幼鱼骨骼肌完整性的非侵入性方法。该技术可快速分析大量样本并监测肌肉缺陷，为神经肌肉疾病研究提供可靠的活体评估手段。

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我们感谢Behzad Moghadaszadeh在双折射图像定量分析方面提供的出色帮助。本研究由美国肌肉萎缩症协会（MDA201302）和美国国家关节炎与肌肉骨骼及皮肤病研究所（R01 AR044345）资助，同时也得到了A Foundation Building Strength、Cure CMD以及AUism慈善基金会的慷慨支持。VAG由美国国家关节炎与肌肉骨骼及皮肤病研究所的K01 AR062601项目资助，LLS由美国国家神经疾病与卒中研究所的F31 NS081928项目资助。

1. 在体 通过双折射分析骨骼肌结构
<ol>
	<li>在下午喂食后，将所需斑马鱼品系的雄鱼和雌鱼分开放入交配笼中。
	<ol>
		<li>通过较大的腹部和略带蓝/白色的体色区分雌性，通过较纤细的体型和粉/黄色的色调区分雄性。</li>
		<li>采用单对交配（一雄一雌）的成功率可能仅为约50%。为提高成功率，建议将一只雄性与2–3只雌性共同交配。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第二天早晨在光照开始后不久移除鱼缸隔板，让鱼类不受干扰地产卵。</li>
	<li>当水族箱底部产有足够数量的受精卵时，使用滤网收集卵。</li>
	<li>将胚胎转移到深型培养皿中，用鱼水冲洗过滤筛，并将亲代鱼放回鱼缸。将盛有胚胎的培养皿置于28.5 °C培养箱中。</li>
	<li>当天晚些时候或次日早晨清除无法存活的卵和碎片，并将胚胎放回培养箱中继续培养。</li>
	<li>胚胎/幼鱼在受精后3至7天（dpf）达到观察双折射现象的适宜年龄，因为在3 dpf之前观察结果可能因对比度不足而受限。野生型胚胎在受精后48至60小时（hpf）从绒毛膜中孵化，随后身体轴线逐渐伸直。孵化较晚的野生型或突变型胚胎可能需要人工去绒毛膜处理。
	<ol>
		<li>用尖头镊子轻轻撕开绒毛膜，然后将其倒置，使胚胎脱出。</li>
		<li>让去壳胚胎在开始检测前充分伸直。</li>
		<li>用三卡因（鱼水中含0.04%）麻醉胚胎，以利于其正确摆放。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将解剖显微镜配备可旋转的偏振镜头，以调节偏振光的角度（图1A).</li>
	<li>将去壳并麻醉的胚胎直接放置在显微镜载物台上位于上层偏振片下方的第二个偏振片上，沿胚胎体轴的侧向摆放。第二个偏振片应置于显微镜载物台上的上层偏振片下方。图1B在整个双折射检测过程中，请勿使用塑料培养皿，因为塑料不适合作为折射光传播的介质。</li>
	<li>旋转上层透镜，使目标胚胎保持在视野中，直至两个透镜的偏振轴相互垂直（呈90°），背景完全变暗。</li>
	<li>检测的最佳结果取决于鱼类在两个偏振镜头之间的摆放方向。移动鱼类，确保其尽可能平躺。
	<ol>
		<li>如果鱼体发生弯曲，只有呈平坦取向的节段才能透过偏振光并表现出双折射现象。在此情况下，应测量平坦区域的双折射，并记录野生型鱼相应区域的双折射值例如.&#160;野生型和突变型鱼的第1至第10体节。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>观察鱼类的双折射表型。
	<ol>
		<li>具有高度有序骨骼肌的野生型鱼表现出明亮的双折射现象，因为平行于肌丝的光线折射率高于垂直于这些结构的偏振光。</li>
		<li>骨骼肌排列紊乱、提示为非变性性肌病或发育缺陷的鱼类通常表现出双折射的整体性减弱。</li>
		<li>患有肌肉营养不良症且骨骼肌结构紊乱的鱼类通常表现出斑块状的双折射模式，其中暗区代表退化的肌肉，而亮区为正常的肌肉结构。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在相同的曝光设置和放大倍数下，利用偏振光对野生型和突变型斑马鱼进行成像，以量化双折射现象。将图像保存为 .tiff 文件。
	<ol>
		<li>在 ImageJ 软件中打开双折射图像（<a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a>).</li>
		<li>对于每张图像，使用工具栏中的“多边形选择”选项，围绕鱼体绘制线条以选定斑马鱼肌肉区域。</li>
		<li>在“分析”下拉菜单中使用“设置测量”以选择图像所需的统计参数。
		<ol>
			<li>最小选择要求勾选“Area”、“Mean gray value”和“Min”复选框 &amp;#38; 最大灰度值” 已勾选。</li>
			<li>最大灰度值 &#62;255 表示像素饱和。因此，请使用最大灰度值小于 255 的图像。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将平均强度根据所选区域进行归一化，并对每张双折射图像重复相同的定量分析步骤。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 触发逃逸行为检测
<ol>
	<li>按照上述步骤 1.1–1.5 所述，设置适当斑马鱼品系的交配对并收集胚胎。</li>
	<li>在受精后 2–7 天，将去壳的胚胎/幼鱼单独放入深型培养皿或多孔板的孔腔中。</li>
	<li>每次仅操作一个胚胎，将胚胎置于 Nikon SMZ1500 体视显微镜&#160;配备 SPOT RT3 数字相机系统&#160;或类似设备的视野中央，开始进行序列成像。
	<ol>
		<li>野生型和突变型鱼应采用相同的成像频率。建议帧率&#62;30 Hz，因为较低的帧率通常不足以捕捉野生型鱼快速的游泳行为。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过用昆虫针触碰胚胎尾部，施加机械感觉刺激。</li>
	<li>当胚胎停止游泳或游出视野时，停止成像。</li>
	<li>使用 SPOT 5.1 Advanced&#160;软件将序列图像转换为视频文件，或对延时图像的单帧进行离线分析。类似软件包括 Open Lab、NIS Elements 或免费软件 ImageJ（<a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/" title="">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a>）。</li>
	<li>通过在多个胚胎中执行触诱发应答来量化游泳行为。
	<ol>
		<li>可通过使用软件或刻度尺标记游泳过程的起点和终点，计算固定时间间隔内胚胎游泳距离的平均值来实现。</li>
		<li>为避免胚胎随时间推移对触觉刺激产生习惯化，每次实验重复应使用新的胚胎。野生型和可靠的突变型模型的行为通常具有高度可重复性。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Bassett, D. I., Bryson-Richardson, R. J., Daggett, D. F., Gautier, P., Keenan, D. G., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dystrophin+is+required+for+the+formation+of+stable+muscle+attachments+in+the+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Dystrophin is required for the formation of stable muscle attachments in the zebrafish embryo.</a> Development. 130, 5851-5860 (2003).</li>
<li>Gupta, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+dag1+mutant%3A+a+novel+genetic+model+for+dystroglycanopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mol.+Genet%22%5BJournal%5D)">The zebrafish dag1 mutant: a novel genetic model for dystroglycanopathies.</a> Hum. Mol. Genet. 20 (9), 1712-1725 (2011).</li>
<li>Hall, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+candyfloss+mutant+implicates+extracellular+matrix+adhesion+failure+in+laminin+%CE%B12-deficient+congenital+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">The zebrafish candyfloss mutant implicates extracellular matrix adhesion failure in laminin α2-deficient congenital muscular dystrophy.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (17), 7092-7097 (2007).</li>
<li>Dowling, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+myotubularin+function+results+in+T-tubule+disorganization+in+zebrafish+and+human+myotubular+myopathy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Loss of myotubularin function results in T-tubule disorganization in zebrafish and human myotubular myopathy.</a> PLoS Genet. 5 (2), e1000372(2009).</li>
<li>Telfer, W. R., Nelson, D. D., Waugh, T., Brooks, S. V., Dowling, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neb%3A+a+zebrafish+model+of+nemaline+myopathy+due+to+nebulin+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Dis.+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Neb: a zebrafish model of nemaline myopathy due to nebulin mutation.</a> Dis. Model Mech. 5 (3), 389-396 (2012).</li>
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<li>Barbazuk, W. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+syntenic+relationship+of+the+zebrafish+and+human+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">The syntenic relationship of the zebrafish and human genomes.</a> Genome Res. 10 (9), 1351-1358 (2000).</li>
<li>Schapira, G., Dreyfus, J. C., Joly, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+the+flow+birefringence+of+myosin+as+a+result+of+muscular+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Changes in the flow birefringence of myosin as a result of muscular atrophy.</a> Nature. 170 (4325), 494-495 (1952).</li>
<li>Kimmel, C. B., Patterson, J., Kimmel, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+and+behavioral+characteristics+of+the+startle+response+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Psychobiol%22%5BJournal%5D)">The development and behavioral characteristics of the startle response in zebrafish.</a> Dev. Psychobiol. 7, 47-60 (1974).</li>
<li>Eaton, R. C., Bombardieri, R. A., Meyer, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Mauthner-initiated+startle+response+in+teleost+fish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">The Mauthner-initiated startle response in teleost fish.</a> J. Exp. Biol. 66, 65-81 (1977).</li>
<li>Saint-Amant, L., Drapeau, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+course+of+the+development+of+motor+behaviors+in+the+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Time course of the development of motor behaviors in the zebrafish embryo.</a> J. Neurobiol. 37 (4), 622-632 (1998).</li>
<li>Hirata, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+relatively+relaxed+mutants+have+a+ryanodine+receptor+defect%2C+show+slow+swimming+and+provide+a+model+of+multi-minicore+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Zebrafish relatively relaxed mutants have a ryanodine receptor defect, show slow swimming and provide a model of multi-minicore disease.</a> Development. 134 (15), 2771-2781 (2007).</li>
<li>Wallace, G. Q., McNally, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+muscle+degeneration%2C+regeneration%2C+and+repair+in+the+muscular+dystrophies%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of muscle degeneration, regeneration, and repair in the muscular dystrophies.</a> Annu. Rev. Physiol. 71, 37-57 (2009).</li>
<li>Granato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+controlling+and+mediating+locomotion+behavior+of+the+zebrafish+embryo+and+larva%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Genes controlling and mediating locomotion behavior of the zebrafish embryo and larva.</a> Development. 123, 399-413 (1996).</li>
<li>Berger, J., Sztal, T., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+birefringence+readily+measures+the+level+of+muscle+damage+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Quantification of birefringence readily measures the level of muscle damage in zebrafish.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 423 (4), 785-788 (2012).</li>
<li>Low, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPM7+is+required+within+zebrafish+sensory+neurons+for+the+activation+of+touch-evoked+escape+behaviors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">TRPM7 is required within zebrafish sensory neurons for the activation of touch-evoked escape behaviors.</a> J. Neurosci. 31 (32), 11633-11644 (2011).</li>
<li>Liu, D. W., Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Function+of+identified+motoneurones+and+co-ordination+of+primary+and+secondary+motor+systems+during+zebrafish+swimming%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Function of identified motoneurones and co-ordination of primary and secondary motor systems during zebrafish swimming.</a> J. Physiol. 403, 73-89 (1988).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

原发性神经肌肉疾病传统上被分为肌营养不良性和非肌营养不良性病变。肌营养不良症的特征是肌纤维变性，随后经历多轮再生，最终发展为以纤维化和脂肪组织替代为典型表现的终末期病变14。相比之下，非肌营养不良性肌病不伴有坏死或再生性改变，但仍会导致肌纤维结构紊乱及整体骨骼肌无力。
斑马鱼模型近年来已成为深入理解各种神经肌肉疾病分子通路及发病机制的极为宝贵的资源。除了该模型系统本身所具有的普遍优势，如发育迅速 子宫外 发育迅速、胚胎透明、繁殖能力强，且基因组与人类高度相似，斑马鱼疾病模型通常能高度模拟人类疾病。尽管许多骨骼肌缺陷的斑马鱼存在形态学异常，但部分突变体表型总体正常，需要更精细的表征分析。对于此类情况及所有其他情形，均可通过非侵入性方法快速、简便地评估斑马鱼肌肉损伤和肌力减弱的程度 体内 双折射和触碰诱发逃避行为的检测方法。双折射是透明斑马鱼胚胎中肌肉完整性的敏感指标，自斑马鱼模型系统建立初期以来，已被用于无创鉴定骨骼肌突变体。15该检测方法本身是将斑马鱼胚胎置于两个偏振滤光片之间，在暗背景下观察鱼体<su...

<table><tbody><tr><td>三卡因 </td><td>Sigma</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>培养皿</td><td>Fischer Scientific</td><td>0875711Z</td><td></td></tr><tr><td>镊子</td><td>Fischer Scientific</td><td>100189-588</td><td></td></tr><tr><td>昆虫针</td><td>Fischer Scientific</td><td>S67375</td><td></td></tr><tr><td>偏振镜片</td><td>Ritz Camera</td><td>Quantaray Tristar Optics C-PL 72mm</td><td></td></tr><tr><td>培养箱</td><td>Fischer Scientific</td><td>Isotemp Incubator Model 630D</td><td></td></tr><tr><td>显微镜</td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td>SMZ 1500</td><td></td></tr><tr><td>相机</td><td>Diagnostic Instruments Inc.</td><td>SPOT RT3</td><td></td></tr><tr><td>成像软件</td><td>Diagnostic Instruments Inc.</td><td>SPOT 5.1 Advanced</td><td></td></tr></tbody></table>

通过双折射和触诱发逃逸反应检测分析斑马鱼幼虫骨骼肌缺陷

Analysis of Skeletal Muscle Defects in Larval Zebrafish by Birefringence and Touch-evoke Escape Response Assays

斑马鱼（Danio rerio）因其与哺乳动物在基因组和结构上具有高度保守性1-3，已成为模拟影响骨骼肌的人类疾病的有力模型，包括肌营养不良症4,5、先天性肌病6,7以及肌节组装异常8。在受精后的最初几天内，可快速评估斑马鱼的肌肉紊乱和运动功能障碍。用于表征斑马鱼骨骼肌缺陷的两种检测方法是双折射检测（结构性）和触碰诱发逃逸反应检测（行为性）。
双折射是一种物理特性，指光在穿过有序物质（如肌节的类晶体阵列9）时发生偏转的现象。这是一种简单、无创的方法，可用于早期发育阶段对透明斑马鱼幼鱼的肌肉完整性进行评估。当在两个偏振光滤光片之间观察时，具有高度有序骨骼肌的野生型斑马鱼在暗背景中呈现非常明亮的形态，而肌肉突变体则表现出与其所模拟的主要肌肉疾病相对应的特异性双折射模式。模拟肌营养不良症的斑马鱼模型——这类疾病以肌纤维变性继而反复再生为特征——在偏振光下骨骼肌中会显示出退行性的暗斑。非营养不良性肌病不伴有坏死或再生性改变，但会导致肌纤维排列紊乱和骨骼肌无力。肌病型斑马鱼通常表现为整体双折射强度降低，反映出肌节结构的紊乱。
触觉诱发逃逸实验通过观察胚胎在受到触觉刺激后的游泳行为来进行10-12与野生型幼虫相比，突变型幼虫常表现出微弱的逃避收缩反应，随后出现缓慢游泳或其他类型的运动障碍，无法使幼虫移动较远距离12这些检测方法的优势在于可以对同一种鱼类的疾病进展进行监测 体内 数天，且相较于高等脊椎动物，可在短时间内分析大量鱼类。

双折射可作为一种高效、非侵入性的检测方法，用于揭示活体斑马鱼胚胎中肌原纤维的组织状态。本文展示了野生型斑马鱼以及骨骼肌发育和功能相关基因表达降低的斑马鱼实例。在偏振光下，5天龄的野生型斑马鱼由于肌丝排列有序，其骨骼肌表现出强烈的双折射现象（图2A-B）。相比之下，携带dag1基因致病性突变的同龄纯合子胚胎则呈现斑片状双折射，提示存在肌肉退化区域（图2C-D）2。这种斑块样模式以及在早期发育过程中肌肉退化的快速进展，与其他肌营养不良型鱼类模型一致1,3。对5天龄dag1突变体（肌营养不良型）的双折射进行定量分析，发现其亮度显著降低至野生型同胞最大双折射值的27.9%±5.3，降低程度比3天龄肌病型mtm1吗啉代寡核苷酸敲降胚胎中观察到的52.4%±5.5更为严重（野生型/dag1/mtm1：n = 3；Student's t检验，P &lt; 0.001）（图4）。肌病型鱼类模型（<str...

斑马鱼现已成为研究肌营养不良症、先天性肌病及相关神经肌肉疾病的重要且强大的模型工具。双折射和触觉诱发逃逸行为是两种常用的非侵入性检测方法，用于评估斑马鱼胚胎在早期发育过程中肌肉结构紊乱和运动功能障碍的程度。

斑马鱼（Danio rerio）已成为模拟影响骨骼肌的人类疾病的特别有效工具，包括肌肉疾病……

本实验的总体目标是评估半透明斑马鱼幼鱼肌原纤维的有序程度，并对两种方法中幼鱼在触觉刺激下的游泳距离进行量化。首先通过交配斑马鱼，然后在实验的第二步中收集可存活的卵，以评估肌肉结构。将经过包被并麻醉的斑马鱼胚胎置于体视显微镜载物台上两个偏振镜头之间，使鱼体沿其身体侧轴方向排列，并尽可能保持平直状态。随后可观察到双折射现象，并对肌肉完整性进行定量分析。在触觉诱发逃避实验的第二步中，将一只包被的幼虫放入一个较深的培养皿中，并置于体视显微镜视野中央。通过用昆虫针触碰幼虫尾部施加轻微的感觉刺激，持续成像记录动物的反应，直至胚胎停止游泳或游出视野范围。最终，可以对肌肉组织结构和运动反应的差异进行量化。这些非侵入性技术的主要优势在于能够快速分析大量鱼类，并可在活体状态下对同一条鱼的骨骼肌缺陷进行数日内的连续监测。正确安装偏振镜头以及将幼鱼置于适当方向的可视化演示对于确保实验成功至关重要。通过这些检测方法，将交配后的成年鱼类所产卵块中无法存活的卵清除。这些卵在肉眼下通常呈白色且不透明，或在显微镜下表现为一团深色、无序排列的细胞。将胚胎放回培养箱中继续培养，使其发育至受精后3至7天。若目标胚胎仍包裹在卵膜内，可用一对锋利的镊子轻轻在目标胚胎的卵膜上撕开一个小口，然后将胚胎翻转至倒置位置，使胚胎自然脱落出来。用三卡麻醉处理包被的胚胎，以帮助其正确摆放位置，然后在解剖显微镜上安装可旋转的偏振镜头，以调节偏振光的角度。待胚胎伸直后，在显微镜载物台上放置第二片偏振镜头，位于上方镜头正下方，并将胚胎直接置于第二片镜头之上。每个待观察的胚胎应沿其身体的侧轴方向摆放。旋转上层镜片，使目标胚胎处于视野中，直至两个镜片的偏振轴相互呈90度角，背景完全变暗。移动斑马鱼，确保其尽可能平躺。若斑马鱼身体弯曲，则只有呈平直方向的节段才能透过偏振光，并表现出frt现象。现在观察野生型斑马鱼的双折射表型。高度有序的骨骼肌在双折射成像下呈现明亮的特征，因为平行于肌原纤维方向的光折射率高于垂直于这些结构的偏振光。骨骼肌排列紊乱的斑马鱼，提示可能存在神经退行性肌病或发育缺陷，通常表现出整体双折射信号的减弱。肌营养不良症的特征。通常表现为双折射呈斑块状分布，其中暗区代表肌肉退化，亮区代表正常的肌肉结构。在偏振光下采集鱼类图像，用于双折射的定量分析。将图像保存为 tiff 文件。在图像处理软件程序中打开双折射图像。如果使用 ImageJ（如此处所示），对于每幅图像，首先使用多边形选择工具在鱼体周围绘制一条线，以确定斑马鱼肌肉的测量区域。然后在“分析”下拉菜单中，选择“设置测量值”，以选定图像所需的统计参数。勾选面积、平均灰度值以及最小和最大灰度值的复选框，以建立受精后2至7天的触碰诱发逃逸行为实验。将包被的待测鱼类逐一放入深型培养皿中，每次仅操作一个胚胎。将鱼置于配备数字相机系统的体视显微镜视野中央，使用不低于30赫兹的帧率开始连续成像。然后用昆虫针轻触胚胎尾部，以施加机械感觉刺激，并在胚胎停止游动或游出视野时停止成像。最后，将连续图像转换为视频文件，或对延时图像的各个帧进行单独分析。离体双折射可作为一种高效的非侵入性检测方法，用于揭示活体斑马鱼胚胎中肌原纤维的组织状态。受精后五天的野生型斑马鱼在偏振光下显示出强烈的骨骼肌双折射现象，这是由于其肌丝结构排列有序所致。相比之下，携带 dystroglycan 或 DAG1 基因致病性突变纯合子的同龄胚胎则表现出斑片状的双折射，提示存在肌肉退化区域。这种斑块样模式以及在早期发育过程中肌肉退化的快速进展，与其他肌营养不良型斑马鱼模型的表现一致。对受精后五天的 dystrophic DAG1 突变体双折射性进行定量分析，发现其亮度显著降低，仅为野生型同胞最大双折射强度的 27.9 ± 5.3%。这一降幅比受精后三天 myopathic mtm1 形态异常鱼类模型中观察到的 52.4 ± 5.5% 的降幅更为严重。相比之下，肌病性鱼类模型通常表现出整体双折射性降低，这主要由于主轴骨骼肌中常存在肌原纤维排列紊乱，但并无变性改变的证据。通过触觉诱发的逃避行为实验可用于证明骨骼肌疾病斑马鱼模型存在运动功能障碍和游泳困难。第一段视频展示了野生型斑马鱼的触碰诱发逃逸行为实验。请注意，在受精后第五天，正常的幼鱼会迅速游开。在第二段视频中，对 dag1 幼鱼进行触碰，记录到了其触碰诱发的逃逸行为。注意观察受精后第五天的突变体胚胎对触碰刺激反应迟钝，并且在受到刺激后无法移出视野。随后对视频进行逐帧分析，以确认与野生型对照组相比，DAG1突变体在触觉刺激下的运动能力受损。统计并计算了两种类型胚胎在固定时间间隔内移动的距离均值，结果表明DAG1突变体的运动功能显著减弱。一旦掌握这些技术，便可在短时间内对大量鱼类进行操作，这在进行高通量化学筛选或诱变筛选时至关重要。在完成该操作后，可进一步采用免疫组织化学或电子显微镜等更具侵入性的方法，从分子和结构水平上研究骨骼肌的缺陷。

analysis-skeletal-muscle-defects-larval-zebrafish-birefringence-touch

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

通过双折射和触摸引发逃逸反应测定分析幼鱼斑马鱼骨骼肌缺陷

本视频介绍了触觉诱发反应检测方法，该方法用于测量斑马鱼幼虫对触觉刺激的反应。...

逃避反应检测：一种研究斑马鱼幼虫对触觉刺激反应的方法

本视频介绍了斑马鱼幼鱼的回避行为和接触趋向性实验。视频考察了斑马鱼幼鱼对视觉厌恶刺激的行为反应。...

斑马鱼回避与趋触性检测：一种高通量检测幼鱼对厌恶性视觉刺激行为反应的方法

斑马鱼是研究人类骨骼肌疾病的新兴模型系统。本文介绍一种快速高效分离斑马鱼胚胎和幼体骨骼肌肌纤维的方法。该方法可获得高密度的肌纤维样本，适用于单个骨骼肌纤维形态学、蛋白质亚细胞定位以及肌肉生理学的研究。...

分离制备物中斑马鱼胚胎和幼鱼骨骼肌肌纤维的分析

力测量可用于揭示发育、损伤、疾病、治疗或化学毒性对肌肉功能造成的影响。在本视频中，我们演示了一种用于测量斑马鱼幼体躯干肌肉在最大收缩期间产生力量的方法。...

斑马鱼幼虫收缩过程中的力测量以评估肌肉功能

我们介绍一种利用显微操作和视网膜电图（ERG）技术对斑马鱼幼鱼进行视网膜电图分析的方法。该方法简便直接，适用于检测斑马鱼幼鱼的视觉功能。 体内.

斑马鱼幼鱼视觉反应的视网膜电图分析

本研究中，我们介绍了一种对斑马鱼幼鱼进行伊文思蓝染料（EBD）分析的简便方法。该技术是表征骨骼肌完整性和建立斑马鱼肌肉营养不良模型的有力工具，也是开发新型治疗手段的重要方法。...

伊文思蓝染色法分析斑马鱼幼鱼骨骼肌完整性

斑马鱼是研究肌肉功能和疾病的理想模型。在早期胚胎发育过程中，斑马鱼开始出现规律的肌肉收缩，产生节律性游泳行为，当肌肉功能受到干扰时，该行为会发生改变。本文描述了一种触碰诱发反应和运动能力检测方法，通过评估游泳表现来反映肌肉功能。...

利用触觉诱发反应和运动能力检测评估斑马鱼肌肉功能与性能

本文介绍了一种斑马鱼癫痫模型的建立与表征方案，该模型源于对DEPDC5基因的瞬时抑制。...

癫痫斑马鱼模型中的行为与生理学分析

骨骼肌再生由组织驻留的肌肉干细胞驱动，这些细胞在多种肌肉疾病（如肌营养不良症）中功能受损，导致肌肉无法再生。本文介绍了一种可在斑马鱼肌肉疾病模型中研究肌肉再生的实验方案。...

研究肌肉疾病斑马鱼模型中的肌肉再生

介绍了一种用于观察微循环的新颖且多功能的方法。该方法适用于长期观察，并可与药理生理学或分子生物学干预相结合。...

活体显微镜下测量骨骼肌内微循环

了解利用双折射和触摸诱发逃逸反应评估斑马鱼幼鱼骨骼肌完整性的非侵入性方法。该技术可快速分析大量样本并监测肌肉缺陷，为神经肌肉疾病研究提供可靠的活体评估手段。

通过双折射和触诱发逃逸反应检测分析斑马鱼幼虫骨骼肌缺陷

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