Name: 作为脑微血管内皮细胞（CEND）的伸展体外 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-26T23:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 19 s
Description: 了解使用细胞牵张装置对脑微血管内皮细胞进行牵张损伤，建立创伤性脑损伤体外模型。该方法通过评估细胞活力和LDH释放，帮助研究者探索血脑屏障损伤机制并开发治疗策略。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本研究由德国研究基金会（Deutsche Forschungsgemeinschaft，DFG）资助，资助编号为FO 315/4-，以及欧盟第七个框架计划（FP7/2007-2013）资助，资助协议号为HEALTH-F2-2009-241778，授予CF。

1. 将内皮细胞接种至培养板孔中
<ol>
	<li>在T75培养瓶中培养小鼠脑微血管内皮细胞（cEND），每周更换两次培养基（含10%胎牛血清、50 U/ml青霉素/链霉素和1% L-谷氨酰胺的DMEM），直至细胞达到汇合状态。（关于脑微血管内皮细胞的建立与永生化方法，请参见Burek） 等，2012；Förster 等., 200521,19).</li>
	<li>用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞。吸除 PBS，加入 2 ml 温热的胰蛋白酶-EDTA 溶液消化细胞。</li>
	<li>在37 °C下孵育细胞5分钟&#160;或直至细胞层完全分散。</li>
	<li>加入8 ml培养基至细胞中。轻轻拍打培养瓶数次，使细胞脱落。</li>
	<li>在显微镜下观察细胞，以确保其完全从培养瓶脱落。</li>
	<li>用移液管将含有脱落细胞的培养基上下吹打。轻轻旋动培养瓶以混匀细胞悬液。</li>
	<li>取20 µl细胞悬液，加入血细胞计数板，计数细胞数量。</li>
	<li>确定细胞密度，并以 20,000 个细胞/cm² 接种2 到孔中。</li>
	<li>将细胞悬液转移至经胶原蛋白1预包被的6孔板中&#160;柔性底培养板（57.75 cm²）2) 总体积为 3 ml/孔。每孔面积为 9.62 cm²2.</li>
	<li>在37 °C下培养细胞一周至汇合，每周更换两次培养基。</li>
</ol>
2. 拉伸损伤前的细胞分化
<ol>
	<li>用分化培养基（含1%去血清胎牛血清（ssFCS）、50 U/ml 青霉素/链霉素的DMEM）更换细胞的培养液。</li>
	<li>将细胞在37 °C下孵育24小时。</li>
</ol>
3. 内皮细胞的牵张诱导损伤
<ol>
	<li>打开细胞损伤控制器设备。</li>
	<li>将延迟时间设置为 50 毫秒。</li>
	<li>将调节器压力设为 15 psi，并按压触发器数次，直至记录的峰值压力趋于稳定。</li>
	<li>将调节器压力调整至所需数值。可参考表 1以产生不同程度的拉伸损伤。</li>
	<li>将6孔柔性底培养板（57.75 cm2）放入托盘架中。确保井孔选择器已设置为正确的孔径（i.e. 大孔）。</li>
	<li>将适配器插头牢固地盖在孔上。一只手稳稳固定插头，另一只手按下触发器。</li>
	<li>记录产生的峰值压力。</li>
	<li>立即将培养板放回 37 °C 培养箱中，孵育所需时间，或立即用于后续实验或检测。</li>
</ol>
4. 通过染料摄取实验评估拉伸损伤
<ol>
	<li>细胞拉伸后立即（步骤 3.7），向细胞培养基中加入 30 µl 浓度为 1 mg/ml 的活率染料溶液，该染料可作为细胞毒性标记物（请参见材料与设备补充表）（注意：每毫升细胞培养基使用 10 µl 染料溶液）。</li>
	<li>将染料加入细胞后，立即在荧光显微镜下观察。</li>
</ol>
5. 通过乳酸脱氢酶（LDH）释放评估拉伸损伤
<ol>
	<li>细胞拉伸后立即（步骤 3.7）从孔中移除 200 µl 细胞培养基。对于您希望纳入乳酸脱氢酶（LDH）释放研究的每个损伤后时间点，均需进行相同操作。即&#160;例如 30 分钟，1 小时，2 小时 等等.)</li>
	<li>在微型离心机中以最高转速离心细胞培养基5分钟，以去除细胞碎片。弃去上清液，将上清液用于后续步骤。</li>
	<li>完成步骤5.1并采集所需各个时间点的样品后，使用LDH检测试剂盒中包含的裂解液裂解细胞（详见材料与设备补充表）。</li>
	<li>将检测试剂盒中提供的检测培养基各100 µl加入试剂盒提供的96孔板的每个孔中。</li>
	<li>将100 µl无细胞的细胞培养基加入检测试剂盒中包含的96孔板的两个平行孔中。</li>
	<li>在37 °C下孵育平板30分钟。</li>
	<li>在 492 nm 处读取吸光度。</li>
</ol>

<ol><li>Hyder, A. A., Wunderlich, C. A., Puvanachandra, P., Gururaj, G., Kobusingye, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+traumatic+brain+injuries%3A+a+global+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22NeuroRehabilitation%22%5BJournal%5D)">The impact of traumatic brain injuries: a global perspective.</a> NeuroRehabilitation. 22 (5), 341-353 (2007).</li>
<li>Morrison, B. III, Saatman, K. E., Meaney, D. F., McIntosh, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+centralnervoussystemmodels+of+mechanicallyinducedtrauma%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">In vitro centralnervoussystemmodels of mechanicallyinducedtrauma: a review.</a> J. Neurotrauma. 15 (11), 911-928 (1998).</li>
<li>Albert-Weissenberger, C., Sirén, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+traumatic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Transl.+Stroke+Med%22%5BJournal%5D)">Experimental traumatic brain injury.</a> Exp. Transl. Stroke Med. 2 (16), 1-8 (2010).</li>
<li>Morrison, B., Elkin, B., Dollé, J. P., Yarmush, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+models+of+traumatic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">In vitro models of traumatic brain injury.</a> Annu. Rev. Biomed. Eng. 13, 91-126 (2011).</li>
<li>Cargill, R. S., Thibault, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+alterations+in+%5BCa2%2B%5Di+in+NG108-15+cells+subjected+to+high+strain+rate+deformation+and+chemical+hypoxia%3A+an+in+vitro+model+for+neural+trauma%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Acute alterations in [Ca2+]i in NG108-15 cells subjected to high strain rate deformation and chemical hypoxia: an in vitro model for neural trauma.</a> J. Neurotrauma. 13 (7), 395-407 (1996).</li>
<li>Geddes-Klein, D., Schiffman, K., Meaney, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+and+Consequences+of+neuronal+stretch+injury+in+vitro+differ+with+the+model+of+trauma%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Mechanisms and Consequences of neuronal stretch injury in vitro differ with the model of trauma.</a> J. Neurotrauma. 23 (2), 93-204 (2006).</li>
<li>Ellis, E. F., McKinney, J. S., Willoughby, K. A., Liang, S., Povlischock, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+model+for+rapid+stretch-induced+injury+of+cells+in+culture%3A+characterization+of+the+model+using+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">A new model for rapid stretch-induced injury of cells in culture: characterization of the model using astrocytes.</a> J. Neurotrauma. 12 (3), 325-339 (1995).</li>
<li>McKinney, J. S., Willoughby, K. A., Liang, S., Ellis, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stretch-induced+injury+of+cultured+neuronal%2C+glial+and+endothelia+cells+%28Effect+of+polyethylene+glycol-conjugated+superoxide+dismutase%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Stretch-induced injury of cultured neuronal, glial and endothelia cells (Effect of polyethylene glycol-conjugated superoxide dismutase.</a> Stroke. 27 (5), 934-940 (1996).</li>
<li>Wanner, I. B., Deik, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+in+vitro+model+of+the+glialscarinhibitsaxongrowth%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">A new in vitro model of the glialscarinhibitsaxongrowth.</a> Glia. 56 (15), 1691-16709 (2008).</li>
<li>Wanner, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+In+Vitro+Trauma+Model+to+Study+Rodent+and+Human+Astrocyte+Reactivity%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">An In Vitro Trauma Model to Study Rodent and Human Astrocyte Reactivity.</a> Methods Mol. Biol. 814, 189-219 (2012).</li>
<li>Berrout, J., Jin, M., O'Neil, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+role+of+TRPP2+and+TRPC1+channels+in+stretch-induced+injury+of+blood-brain+barrier+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Critical role of TRPP2 and TRPC1 channels in stretch-induced injury of blood-brain barrier endothelial cells.</a> Brain Res. 1436, 1-12 (2011).</li>
<li>Weber, J. T., Rzigalinski, B. A., Willoughby, K. A., Moore, S. F., Ellis, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+in+calcium-mediated+signal+transduction+after+traumatic+brain+injury+of+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Alterations in calcium-mediated signal transduction after traumatic brain injury of cortical neurons.</a> Cell Calcium. 26, 289-299 (1999).</li>
<li>Zhang, L., Rzigalinski, B. A., Ellis, E. F., Satin, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduction+of+voltage-dependent+Mg2%2B+blockade+of+NMDA+current+in+mechanically+injured+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Reduction of voltage-dependent Mg2+ blockade of NMDA current in mechanically injured neurons.</a> Science. 274, 1921-1923 (1996).</li>
<li>Gidday, J. M., Beetsch, J. W., Park, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endogenous+glutathione+protects+cerebral+endothelial+cells+from+traumatic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Endogenous glutathione protects cerebral endothelial cells from traumatic brain injury.</a> J. Neurotrauma. 16 (1), 27-36 (1999).</li>
<li>Gumbleton, M., Audus, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+and+limitations+in+the+use+of+in+vitro+cell+cultures+to+serve+as+permeability+screen+for+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharm.+Sci%22%5BJournal%5D)">Progress and limitations in the use of in vitro cell cultures to serve as permeability screen for the blood-brain barrier.</a> J. Pharm. Sci. 90, 1681-1698 (2001).</li>
<li>Omidi, Y., Campbell, L., Barar, J., Connell, D., Akhtar, S., Gumbleton, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+immortalised+mouse+brain+capillary+endothelial+cell+line%2C+b.End3%2C+as+an+in+vitro+blood-brain+barrier+model+for+drug+uptake+and+transport+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the immortalised mouse brain capillary endothelial cell line, b.End3, as an in vitro blood-brain barrier model for drug uptake and transport studies.</a> Brain Res. 990 (1-2), 95-112 (2003).</li>
<li>Montesano, R., Pepper, M. S., Mohle-Steinlein, U., Risau, W., Wangner, E. F., Orci, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Icreased+proteolytic+activity+is+responsible+for+the+aberrant+morphogenetic+behaviour+of+endothelial+cells+expressing+the+middle+T+oncogene%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Icreased proteolytic activity is responsible for the aberrant morphogenetic behaviour of endothelial cells expressing the middle T oncogene.</a> Cell. 62, 435-445 (1990).</li>
<li>RayChaudhury, A., Frazier, W., D'Amore, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+normal+and+tumorigenic+endothelial+cells%3A+differences+in+thrombospondin+production+and+responses+to+transforming+growth+factor-beta%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Comparison of normal and tumorigenic endothelial cells: differences in thrombospondin production and responses to transforming growth factor-beta.</a> J. Cell Sci. 107, 39-46 (1994).</li>
<li>Förster, C., Silwedel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Occludin+as+direct+target+for+glucocorticoid-induced+improvement+of+blood-brain+barrier+properties+in+a+murine+in+vitro+system%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Occludin as direct target for glucocorticoid-induced improvement of blood-brain barrier properties in a murine in vitro system.</a> J. Physiol. 565 (Pt 2), 475-486 (2005).</li>
<li>Rubin, L. L., Hall, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cell+culturemodel+of+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A cell culturemodel of the blood-brain barrier.</a> J. Cell Biol. 115 (6), 1725-1735 (1991).</li>
<li>Burek, N. M., Salvador, E., Förster, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+an+immortalized+murine+brain+microvascular+endothelial+cell+line+as+an+in+vitro+blood+brain+barrier+model%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Generation of an immortalized murine brain microvascular endothelial cell line as an in vitro blood brain barrier model.</a> J. Vis. Exp. (66), (2011).</li>
<li>Weber, J. T., Rzigalinski, B. A., Gabler, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+in+calcium-mediated+signal+transduction+after+traumatic+injury+of+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Alterations in calcium-mediated signal transduction after traumatic injury of cortical neurons.</a> Cell Calcium. 26, 289-299 (1999).</li>
<li>Shlosberg, D., Benifla, M., Kaufer, D., Friedman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+brain+barrier+breakdown+as+a+therapeutic+target+in+traumatic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Blood brain barrier breakdown as a therapeutic target in traumatic brain injury.</a> Nat. Rev. Neurol. 6, 393-403 (2010).</li>
<li>Thal, S. C., Schaible, E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+proteasomal+glucocorticoid+receptor+degradation+restores+dexamethasone-mediated+stabilization+of+the+blood-brain+barrier+after+traumatic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Crit.+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Inhibition of proteasomal glucocorticoid receptor degradation restores dexamethasone-mediated stabilization of the blood-brain barrier after traumatic brain injury.</a> Crit. Care Med. , (2013).</li>
<li>Werner, C., Engelhard, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathophysiology+of+traumatic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Anaesth%22%5BJournal%5D)">Pathophysiology of traumatic brain injury.</a> Br. J. Anaesth. 99 (1), 4-9 (2007).</li>
<li>Tanno, H., Nockels, R. P., Pitts, L. H., Noble, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breakdown+of+the+blood-brain+barrier+after+fluid+percussion+brain+injury+in+the+rat%3A+Part+2%3A+Effect+of+hypoxia+on+permeability+to+plasma+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Breakdown of the blood-brain barrier after fluid percussion brain injury in the rat: Part 2: Effect of hypoxia on permeability to plasma proteins.</a> J. Neurotrauma. 9 (4), 335-347 (1992).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

机械损伤的影响 体外 已对星形胶质细胞、神经元、胶质细胞和主动脉内皮细胞进行了研究，并建立了相应的方法8, 9, 22然而，迄今为止仍无已知的 体外 体外培养脑微血管内皮细胞的拉伸损伤模型。相较于动物模型，细胞创伤模型具有重要优势，因其可精确控制细胞所处的机械环境。6因此，一个 体外 使用培养的脑内皮细胞作为血脑屏障（BBB）模型，通过拉伸损伤建立创伤模型，例如本方案所展示的方法，可能被证明具有重要应用价值。
本方案使用cEND细胞，这是我们实验室建立的血脑屏障（BBB）模型。由于在创伤性脑损伤（TBI）患者中常观察到血脑屏障的破坏，且TBI常与血脑屏障功能障碍相关，后者可能导致水肿形成23, 24，因此本文所述方法可专门用于与TBI相关的血脑屏障研究。
在此模型中，需注意施加给细胞的拉伸损伤程度。无论何种情况，细胞都会受到损伤，而不同压力大小所导致的内皮细胞损伤程度与其他细胞类型相比存在显著差异。主动脉内皮细胞对拉伸损伤的耐受性高于星形胶质细胞或混合胶质细胞9。此外，与其它细胞类型相比，它们在损伤后的修复速度也更快。因此，对于脑内皮细胞，尤其是cEND细胞，需要施加更大程度的拉伸损伤才能达到较高的损伤水平。可通过应用表1中所示的相应压力来实现所需的损伤程度。然而，由于cEND细胞对拉伸具有较强耐受性，通常更倾向于造成严重损伤。乳酸脱氢酶（LDH）检测结果显示，随着拉伸程度的增加，释放到上清液中的LDH量也随之增多。相反，接受较低程度拉伸损伤的细胞所释放的LDH量与对照组细胞相近。如实验方案中所述，必须注意使用适量的培养基，因为培养基体积的增加或减少可能导致施加于孔板中的峰值压力出现差异。例如，当施加45 psi压力时，含有5 ml液体的孔板其平均峰值压力为4.0 psi，而空孔板的平均峰值压力为3.8 psi。因此，最好先在对照孔板上多次触发装置，以确保所产生的峰值压力符合预期值。
在我们的实验中，使用了活细胞染色剂来确定拉伸对细胞膜通透性的影响。我们所使用的柔性底培养板具有良好的光学特性，可直接在显微镜下观察染色后的细胞。然而，若希望在拉伸损伤后立即进行免疫标记研究，则可能会遇到一些困难。首先，培养板的尺寸和厚度可能与某些显微镜观察平台不兼容。其次，培养孔中柔性膜的光学性质可能会影响清晰成像。
尽管存在上述局限性，但所述方案仍可作为模型使用 体外 血脑屏障的机械性损伤。创伤性脑损伤（TBI）包含两个组成部分，即缺血和创伤。缺血可继发于TBI之后，常见于严重失血导致低血压，或脑肿胀限制脑部氧气供应的情况。缺血被视为一种延迟发生的非机械性损伤，代表了在损伤发生时即已启动的一系列继发性病理过程。25严重创伤性脑损伤后出现缺氧的情况很常见26氧气葡萄糖剥夺（OGD）是目前用于模拟缺血的常用方法 体外因此，将细胞在拉伸损伤后再次暴露于氧糖剥夺（OGD）可模拟创伤性脑损伤（TBI）继发缺血的病理过程。因此，为改进我们目前的 体外 创伤性脑损伤模型，并尽可能使其模式接近实际发生的创伤性脑损伤 体内在未来&#160;我们还将采用氧糖剥夺（OGD）与拉伸损伤相结合的方法。

创伤性脑损伤（TBI）是全球范围内导致死亡的主要原因之一。每年约有1000万人受到TBI影响，使其成为一个重大的公共卫生和医学问题1。因此，已建立并开发了多种TBI的体内和体外模型，以研究其发病机制2,3,4.。对TBI的更深入理解有助于改善患者治疗，降低相关死亡率、发病率及医疗成本。
许多利用两者的大脑损伤模型 体内 和 体外 方法存在。 体内 模型可以模拟真实的头部损伤事件。然而，由于其复杂性 体内 情况，对目标组织的可及性变得受限2在研究细胞因损伤而产生的生理反应时，将细胞与可能抑制或改变其个体反应的系统性效应隔离开来至关重要。5因此，细胞创伤模型相较于动物模型具有显著优势，因为可以精确控制细胞的力学环境。6.
体外 已开发出利用机械负荷作用于细胞或组织以确定由此类损伤方法所诱导变化的系统。例如，已有方法用于研究机械性损伤对星形胶质细胞、神经元、胶质细胞和主动脉内皮细胞的影响。7,8,9。该 体外 为研究啮齿类和人类星形胶质细胞反应性而建立的创伤模型10 采用与本模型所用相同的压力控制装置，对小鼠脑微血管内皮细胞（bEnd3）施加拉伸以诱导损伤。11 以及皮层神经元12,13 以及来自新生仔猪的脑微血管内皮细胞14该装置通过变形培养孔底部，从而产生机械拉伸损伤10通过在细胞上方施加气压，对培养的细胞造成损伤。该压力可使细胞生长的膜发生形变，从而拉伸细胞。不同程度的拉伸（即 &#34;低 &#34;中等&#34; 或 &#34;严重&#34;通过相应地设置气压脉冲的持续时间和强度，可实现上述效果。这种拉伸诱导损伤的方法已与创伤性损伤相关联。 体内7此外，这种损伤方法能够精确控制细胞外环境，且易于重复。
尽管类似的方法已被用于包括bEnd3在内的多种其他脑细胞类型，但我们的模型具有优势，即采用了本实验室制备的小鼠脑微血管内皮细胞（cEND）。该细胞系是血脑屏障（BBB）的适宜模型。体外培养的细胞若用作BBB模型，应具备可作为通透性筛选工具的特性。一个理想的体外细胞模型若要准确预测BBB通透性，其必须具有生理上真实的细胞结构15。尽管bEnd3细胞在培养中表现出明显的纺锤形鳞状形态16，但其在体外表现出不规则的形态发生行为，在纤维蛋白凝胶中形成囊样空腔，而非规则的管状结构17。此外，当将这些细胞注射到胚胎期和新生小鼠体内时，它们会诱导快速生长的肿瘤，对胚胎小鼠具有致死性，但在新生和幼年小鼠中则不会。因此推测，该细胞系中调控正常内皮细胞生长、迁移和分化的某些过程可能已被改变或缺失18。相比之下，形态学、免疫细胞化学对内皮细胞及BBB标志物表达的评估，以及生物电特性和旁细胞通量的测量结果均表明，我们建立的BBB模型cEND确实是BBB的合适模型19。
脑血管内皮 体内 其特征是具有极低的通透性，跨内皮电阻（TEER）范围为 2,000–5,000 Ω·cm2对于研究脑微血管屏障对药物的通透性，应考虑细胞的细胞旁通透限制性和紧密性。在大多数脑毛细血管内皮细胞（BCEC）中，这种特性并未得到保持，因为这些细胞的跨内皮电阻（TEER）范围仅为50–100 Ω·cm2 20永生化脑微血管内皮细胞系 bEnd3 产生的跨内皮电阻值不超过 60 Ω·cm2&#160;15相比之下，使用低血清培养基诱导cEND细胞分化时，其跨内皮电阻（TEER）值范围为300-500 Ω·cm²。2&#160;19,21.
迄今为止， 体外 培养的脑内皮细胞拉伸损伤模型较为稀缺。因此，一种 体外 使用培养的脑微血管内皮细胞作为血脑屏障模型来模拟拉伸损伤所致创伤的模型可能具有重要价值。在本方案中，我们介绍了一种 体外 一种能够模拟创伤性脑损伤（TBI）期间脑细胞——特别是血脑屏障（BBB）的脑微血管内皮细胞——所受实际影响的模型。该模型的主要优势在于，施加于细胞的损伤程度以及细胞外环境均可被精确控制，从而实现实验条件的高度可重复性。

<table><tbody><tr><td>细胞损伤控制器 II</td><td>美国弗吉尼亚州定制设计与制造</td><td></td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Bioflex 培养板 - I 型胶原蛋白</td><td>Flexcell，Dunn实验室技术</td><td>BF - 3001C</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>杜尔贝科&amp;rsquo;s 改良的 Eagle&amp;rsquo;DMEM培养基</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5796</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>胎牛血清（FCS）</td><td>PAA Laboratories</td><td>A15110-1333</td><td>终浓度10%，56℃加热灭活30分钟 &amp;deg;C)</td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Biochrom AG</td><td>K0282</td><td>储存： &amp;le; -15 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>MEM维生素</td><td>Biochrom AG</td><td>K0373</td><td>储存： &amp;le; -15 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Na-丙酮酸</td><td>Biochrom AG</td><td>L0473</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>非必需氨基酸（NEA）</td><td>Biochrom AG</td><td>K0293</td><td>4℃保存 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Biochrom AG</td><td>A2212</td><td>储存： &amp;le; -15 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>胎牛血清，炭吸附处理（ssFCS）</td><td>Life Technologies</td><td>12676-011</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA 溶液</td><td>PAA Laboratories</td><td>L11-004</td><td>储存： &amp;le; -15 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Image-iT DEAD Green</td><td>Life Technologies</td><td>I10291</td><td>储存： &amp;le; -15 &amp;deg;避光，4°C 保存</td></tr><tr><td>细胞毒性检测试剂盒PLUS（LDH）&amp;nbsp;</td><td>罗氏</td><td>4744926001</td><td>储存： &amp;le; -15 &amp;deg;C</td></tr></tbody></table>

脑微血管内皮细胞（cend）中的拉伸作用 体外 血脑屏障的创伤性脑损伤模型

Stretch in Brain Microvascular Endothelial Cells (cEND) as an In Vitro Traumatic Brain Injury Model of the Blood Brain Barrier

由于创伤性脑损伤（TBI）导致的高死亡率，能够帮助人们更深入理解其潜在机制的方法对于治疗具有重要意义。目前既有 体内 和 体外 可用于此目的的方法。 在体 模型能够模拟创伤性脑损伤（TBI）发生时的真实头部损伤情况。然而， 体内 这些技术可能不适用于细胞生理学水平的研究。因此， 体外 对于此目的而言，这些方法更具优势，因为它们更便于对细胞及其胞外环境进行操作。
我们的方案展示了一种 体外 利用脑微血管内皮细胞的拉伸损伤建立创伤性脑损伤（TBI）模型。该模型通过向培养在柔性底壁孔板中的细胞施加可控压力，实现损伤程度从轻度至重度的精确调控。本实验室制备的鼠脑微血管内皮细胞（cEND）是血脑屏障（BBB）研究的适宜模型，相较于采用类似技术的其他系统具有明显优势。此外，该方法操作简便，实验装置易于重复。因此，该模型可用于研究TBI过程中血脑屏障水平的细胞与分子机制。

将细胞接种于预先包被I型胶原的6孔柔性底培养板（57.75 cm2）中，使用细胞拉伸装置施加不同程度的拉伸损伤。损伤后，在显微镜下观察细胞形态学变化以评估拉伸所致损伤效应。结果显示，随着施加的拉伸程度增加，细胞形变也更加明显（图1）。如图1A所示，未受损伤的对照组细胞呈现规则形态的脑血管内皮细胞（cEND），无细胞肿胀或形变迹象。当施加拉伸损伤后（图1B-D），在光学显微镜下可观察到细胞发生变形。当以3.5–4.5 psi的峰值压力对细胞进行重度拉伸时，cEND细胞明显回缩、肿胀并出现显著变形，细胞间隙增宽。此外，随着拉伸损伤程度的增加，细胞对活力染料的摄取也相应增强（图2）。所用的活力染料无法穿透健康细胞，仅在细胞质膜完整性受损时方可进入细胞。该染料被大多数对照组细胞排斥，因此仅有少量细胞被染色（图2A），而拉伸后的细胞染色比例明显升高（图2B-D）。随着拉伸损伤程度的增加，呈现绿色荧光的细胞数量增多。
作为一种损伤的生物化学标志物，根据制造商说明书检测了乳酸脱氢酶（LDH）的释放情况。图3显示，细胞拉伸损伤程度增加导致LDH释放量随之增加。
<img alt="Cell culture growth phases; microscopy image, fibroblast cell confluence, cell proliferation analysis." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50928/50928fig1.jpg" width="500px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 1"> 
图1. 正常细胞与损伤细胞的光学显微镜检查。 (A正常未拉伸的汇合单层细胞排列紧密且呈长梭形。当施加1.8–2.0 psi的峰值压力脉冲进行拉伸时（即 低拉伸）下显得较为松散，箭头所指为间隙B）。当细胞受到2.5–3.0峰值压力脉冲的中度损伤时，部分细胞出现肿胀和变形（C）。在3.5–4.5 psi的强烈拉伸作用下，细胞出现收缩，如箭头所示（D100倍放大。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50928/50928fig1highres.jpg" target="_blank">单击此处查看大图</a>.
<img alt="荧光显微镜图像、细胞培养生长阶段、蛋白质表达分析" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50928/50928fig2.jpg" width="500px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图2"> 
图2. 正常细胞与受损细胞的荧光显微镜观察。细胞在损伤后2小时用活细胞染料处理。A：未拉伸的对照细胞。B-D：拉伸后的细胞（B - 轻度，C - 中度，D - 重度）。放大倍数为100倍。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50928/50928fig2highres.jpg" target="_blank">点击此处查看高分辨率图像</a>。
<img alt="LDH 释放量图示；拉伸后不同损伤程度的时间曲线，线形图，细胞损伤评估。" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50928/50928fig3.jpg" width="500px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 3"> 
图3. 拉伸损伤后乳酸脱氢酶（LDH）在上清液中的释放情况。在拉伸损伤后不同时间点测定培养基中释放的LDH含量。LDH释放量以总可释放LDH（培养基与细胞内LDH之和）的百分比表示。数据以±标准误（SEM）表示。每个时间点的n值为5，仅严重拉伸组0小时时间点n=3。经低强度和中等强度拉伸的细胞LDH释放量与未拉伸对照组相比无显著差异，彼此之间亦无显著差异。经高强度拉伸的细胞在除1小时中等拉伸组外的所有样本中均释放了显著更高水平的LDH（p &lt; 0.05，单因素方差分析，Holm-Sidak法）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50928/50928fig3highres.jpg" target="_blank">点击此处查看高清图像</a>。
表1. 产生不同程度拉伸损伤的指南。
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<th>调节压力</th>
			<th>峰值压力</th>
			<th>损伤程度</th>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 psi</td>
			<td>1.2-1.5 psi</td>
			<td>&lt; 轻度</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20-25 psi</td>
			<td>1.8-2.0 psi</td>
			<td>轻度</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30-35 psi</td>
			<td>2.5-3.0 psi</td>
			<td>中度</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40-50 psi</td>
			<td>3.5-4.5 psi</td>
			<td>重度</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 psi</td>
			<td>4.8-6.0 psi</td>
			<td>&gt; 重度</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

体外创伤性脑损伤模型正在被开发以重现体内脑组织的形变。拉伸诱导损伤已被用于星形胶质细胞、神经元、胶质细胞、主动脉以及脑微血管内皮细胞的研究。然而，我们的系统采用了一种具有完整血脑屏障（BBB）特性的血脑屏障模型，以建立一种可靠的体外&#160;创伤性脑损伤（TBI）模型。

脑微血管内皮细胞（cEND）中的拉伸作用 体外 血脑屏障的创伤性脑损伤模型

由于创伤性脑损伤（TBI）导致的高死亡率，亟需开发能够帮助人们更深入理解其潜在……的方法

本实验的总体目标是展示利用拉伸损伤作为创伤性脑损伤模型的方法。首先通过培养微血管内皮细胞并使用柔性底部孔板来实现这一目标。第二步是通过降低培养基中胎牛血清的浓度来诱导细胞分化。接下来，使用细胞拉伸装置对细胞进行损伤处理。最后一步是评估细胞损伤程度。最终，通过脑微血管内皮细胞的拉伸诱导损伤，以体外模拟血脑屏障的损伤情况。该技术的意义在于为创伤性脑损伤的治疗提供了可能，因为它利用海洋脑源性内皮细胞的拉伸损伤，在血脑屏障中模拟了创伤性脑损伤（TBI）发生时的实际冲击过程。本实验操作将由我实验室的博士后Elaine Salvador博士演示。首先在T75培养瓶中培养海洋脑微血管内皮细胞，以启动该实验流程。每两周更换一次培养基，直至达到汇合。接下来，用 PBS 洗涤细胞。然后吸除 PBS 和胰蛋白酶。用两毫升温热的胰蛋白酶-EDTA溶液消化细胞。在37摄氏度孵育细胞5分钟，或直至细胞层完全分散。随后，向细胞中加入八毫升培养基，轻轻拍打培养瓶数次以使细胞脱落。在显微镜下观察细胞，以确认细胞已完全从培养瓶脱落。然后用移液器将含有脱落细胞的培养基上下吹打混匀。随后轻轻旋转培养瓶，使细胞悬液充分混匀。取20微升细胞悬液加入血细胞计数板，计数细胞数量。确定细胞密度后，按每平方厘米接种20,000个细胞的密度将细胞悬液加入孔板中。随后，将细胞悬液转移至胶原蛋白中。将细胞接种于一个预包被的六孔培养板中，每孔总体积为3毫升。每周更换培养基两次，在37°C条件下培养细胞一周，直至细胞融合。进行细胞分化时，将细胞的培养基更换为分化培养基，并在37摄氏度下培养24小时。在此步骤中，打开细胞损伤控制器设备，将延迟时间设置为50毫秒。接着，将调节器压力设为15 PSI，并按压触发器数次，直至记录的峰值压力趋于稳定。然后将调节器压力设置为所需值。接着，将六孔柔性底培养板放入托盘架中。确保孔选择器已设置为正确的孔尺寸。然后将适配器插头牢固地插入，一手稳稳固定插头，另一手按压触发按钮，记录所产生的峰值压力。随后立即将培养板放回37°C培养箱中，孵育所需时间，或立即用于后续实验或评估，通过DI摄取实验来评价拉伸损伤。细胞拉伸后立即向细胞培养基中加入30 µL浓度为1 mg/mL的活率染料，该染料作为细胞毒性的标记物。通过乳酸脱氢酶（LDH）释放量评估拉伸损伤。拉伸后，立即从每个孔中吸取200微升细胞培养基，对您希望纳入LDH释放研究的每个损伤后时间点均进行相同操作。随后，将细胞培养基在微量离心机中以最高转速离心5分钟。为去除任何细胞碎片，移除上清液并将其用于后续步骤。在采集了各个时间点所需的样品后，使用LDH检测试剂盒中包含的裂解液裂解细胞。随后，向试剂盒提供的96孔板的每个孔中加入100 µL检测试剂盒中包含的检测培养基。然后将100微升无细胞的细胞培养基加入96孔板的两个平行孔中，在37摄氏度孵育30分钟，并在492纳米处读取吸光度。此处显示的是正常细胞与受损细胞的光学显微镜检查结果。正常未拉伸的汇合细胞单层排列紧密且呈伸长状。当施加1.8至2.0 PSI的峰值压力脉冲使细胞拉伸时，细胞形态变得不那么致密。当使用2.5至3.0 PSI的峰值压力脉冲造成中度损伤时，部分细胞出现肿胀和变形。当受到3.5至4.5 PSI的严重拉伸时，细胞则发生回缩。这是正常细胞与受损细胞的荧光显微镜检查结果。细胞在损伤后两小时用活率染料进行处理。这些分别是未拉伸的对照细胞、中度拉伸的细胞和严重拉伸的细胞。该图显示了拉伸损伤后乳酸脱氢酶（LDH）释放到 snat 中的情况。在拉伸损伤后不同时间点测定培养基中释放的 LDH，并以经低强度和中等强度拉伸处理的细胞所释放的总可释放性 L-D-H-L-D-H 的百分比表示。低强度与中等强度拉伸组之间的 LDH 释放量无显著差异，且与未拉伸的对照组相比亦无显著差异。与除一小时中度拉伸样本外的所有其他样本相比，严重拉伸的细胞释放出显著更多的乳酸脱氢酶（LDH）。该技术为神经生物学领域的研究人员探索海洋脑内皮细胞体外创伤性脑损伤奠定了基础。

stretch-brain-microvascular-endothelial-cells-cend-as-an-vitro

Research

科研

JoVE Journal

Medicine

医学

作为脑微血管内皮细胞（CEND）的伸展<em&gt;体外</em创伤性脑损伤模型血脑屏障

本方法描述了如何从小鼠脑组织中分离并永生化微血管内皮细胞。我们介绍了一套从脑组织匀浆、消化处理、细胞接种到细胞永生化的逐步实验方案。通常需要约五周时间获得均一的、可永生化的微血管内皮细胞系。...

建立永生化的小鼠脑微血管内皮细胞系作为 体外 血脑屏障模型

建立人源血脑屏障（BBB）模型有助于研究与BBB功能障碍相关脑部疾病。本文介绍一种改良的接触式BBB模型制备技术，可在多孔膜的两侧分别共培养人源星形胶质细胞和脑微血管内皮细胞。...

改进的人源细胞接触共培养血脑屏障模型的制备方法

脑微血管内皮细胞（BMEC）通过特定的连接蛋白相互连接，形成高度调控的屏障，将血液与中枢神经系统（CNS）分隔开来，即所谓的血脑屏障（BBB）。本方案所述的原代小鼠脑微血管内皮细胞的分离，可实现对BBB进行深入的体外研究。...

分离原代小鼠脑微血管内皮细胞

一个 体外 利用阻抗谱技术构建血脑屏障模型：聚焦T细胞与内皮细胞的相互作用

本方案的目的是提供一种优化的流程，用于建立一个 体外 基于原代猪脑微血管内皮细胞（pBECs）的血脑屏障（BBB）模型。该模型具有高度可重复性和紧密性，适用于药物发现中的转运及细胞内 trafficking 研究。...

改进的建立方法 体外 基于猪脑内皮细胞的血脑屏障模型

本实验的总体目标是提供一种高度可重复的技术，用于在缺血性脑卒中大鼠模型中进行血脑屏障破坏的体内评估。...

一个 在体 内 缺血性中风大鼠模型中血脑屏障破坏的评估

药物靶向中枢神经系统肿瘤是一项重大挑战。本文介绍了一种利用小鼠和/或人类细胞构建体外血脑肿瘤屏障模型的实验方案，并探讨了该模型在预测体内中枢神经系统肿瘤靶向性方面的相关性。...

利用培养皿中的血-脑肿瘤屏障预测体内载荷递送效果

人血脑屏障选择性地阻止亲水性分子和病原体进入大脑。多种病理状态，包括脑膜炎和术后谵妄，均与血脑屏障通透性增加相关。本文中，我们描述了一种内皮细胞培养模型，用于通过微生物跨膜迁移来检测屏障通透性。...

通过微生物穿越微血管内皮细胞分析血脑屏障通透性

本方案详细描述了一种改进的方法，用于诱导人诱导性多能干细胞分化，从而获取、扩增并冻存脑微血管内皮细胞，并用于研究血脑屏障特性的体外模型 离体...

从人诱导性多能干细胞中衍生、扩增、冷冻保存及表征脑微血管内皮细胞

血脑屏障（BBB）在维持稳定且健康的脑环境方面起着至关重要的作用。BBB功能障碍与多种神经系统疾病相关。我们开发了一种源自干细胞的三维血脑屏障模型，用于研究脑血管病理、血脑屏障完整性，以及遗传因素和疾病如何改变血脑屏障。...

血脑屏障的重建 体外 用于建模及治疗性靶向神经系统疾病

通过在不同时间点向小鼠注射两种荧光染料，建立了一种可视化血脑屏障（BBB）破坏所致染料外渗的方法。使用甘油作为冷冻保护剂，有助于在同一组织样本上进行免疫组织化学染色。...

轻度创伤性脑损伤小鼠模型中血脑屏障破坏的评估

了解使用细胞牵张装置对脑微血管内皮细胞进行牵张损伤，建立创伤性脑损伤体外模型。该方法通过评估细胞活力和LDH释放，帮助研究者探索血脑屏障损伤机制并开发治疗策略。

脑微血管内皮细胞（cEND）中的拉伸作用体外血脑屏障的创伤性脑损伤模型

探索更多视频

脑微血管内皮细胞（cEND）中的拉伸作用 体外 血脑屏障的创伤性脑损伤模型

探索更多视频

脑微血管内皮细胞（cEND）中的拉伸作用体外血脑屏障的创伤性脑损伤模型