脑微血管内皮细胞（cEND）中的拉伸作用 体外 血脑屏障的创伤性脑损伤模型

本实验的总体目标是展示利用拉伸损伤作为创伤性脑损伤模型的方法。首先通过培养微血管内皮细胞并使用柔性底部孔板来实现这一目标。第二步是通过降低培养基中胎牛血清的浓度来诱导细胞分化。

接下来，使用细胞拉伸装置对细胞进行损伤处理。最后一步是评估细胞损伤程度。最终，通过脑微血管内皮细胞的拉伸诱导损伤，以体外模拟血脑屏障的损伤情况。

该技术的意义在于为创伤性脑损伤的治疗提供了可能，因为它利用海洋脑源性内皮细胞的拉伸损伤，在血脑屏障中模拟了创伤性脑损伤（TBI）发生时的实际冲击过程。本实验操作将由我实验室的博士后Elaine Salvador博士演示。首先在T75培养瓶中培养海洋脑微血管内皮细胞，以启动该实验流程。

每两周更换一次培养基，直至达到汇合。接下来，用 PBS 洗涤细胞。然后吸除 PBS 和胰蛋白酶。

用两毫升温热的胰蛋白酶-EDTA溶液消化细胞。在37摄氏度孵育细胞5分钟，或直至细胞层完全分散。随后，向细胞中加入八毫升培养基，轻轻拍打培养瓶数次以使细胞脱落。

在显微镜下观察细胞，以确认细胞已完全从培养瓶脱落。然后用移液器将含有脱落细胞的培养基上下吹打混匀。随后轻轻旋转培养瓶，使细胞悬液充分混匀。

取20微升细胞悬液加入血细胞计数板，计数细胞数量。确定细胞密度后，按每平方厘米接种20,000个细胞的密度将细胞悬液加入孔板中。随后，将细胞悬液转移至胶原蛋白中。

将细胞接种于一个预包被的六孔培养板中，每孔总体积为3毫升。每周更换培养基两次，在37°C条件下培养细胞一周，直至细胞融合。

进行细胞分化时，将细胞的培养基更换为分化培养基，并在37摄氏度下培养24小时。在此步骤中，打开细胞损伤控制器设备，将延迟时间设置为50毫秒。接着，将调节器压力设为15 PSI，并按压触发器数次，直至记录的峰值压力趋于稳定。

然后将调节器压力设置为所需值。接着，将六孔柔性底培养板放入托盘架中。确保孔选择器已设置为正确的孔尺寸。

然后将适配器插头牢固地插入，一手稳稳固定插头，另一手按压触发按钮，记录所产生的峰值压力。随后立即将培养板放回37°C培养箱中，孵育所需时间，或立即用于后续实验或评估，通过DI摄取实验来评价拉伸损伤。细胞拉伸后立即向细胞培养基中加入30 µL浓度为1 mg/mL的活率染料，该染料作为细胞毒性的标记物。

通过乳酸脱氢酶（LDH）释放量评估拉伸损伤。拉伸后，立即从每个孔中吸取200微升细胞培养基，对您希望纳入LDH释放研究的每个损伤后时间点均进行相同操作。随后，将细胞培养基在微量离心机中以最高转速离心5分钟。

为去除任何细胞碎片，移除上清液并将其用于后续步骤。在采集了各个时间点所需的样品后，使用LDH检测试剂盒中包含的裂解液裂解细胞。随后，向试剂盒提供的96孔板的每个孔中加入100 µL检测试剂盒中包含的检测培养基。

然后将100微升无细胞的细胞培养基加入96孔板的两个平行孔中，在37摄氏度孵育30分钟，并在492纳米处读取吸光度。此处显示的是正常细胞与受损细胞的光学显微镜检查结果。

正常未拉伸的汇合细胞单层排列紧密且呈伸长状。当施加1.8至2.0 PSI的峰值压力脉冲使细胞拉伸时，细胞形态变得不那么致密。当使用2.5至3.0 PSI的峰值压力脉冲造成中度损伤时，部分细胞出现肿胀和变形。当受到3.5至4.5 PSI的严重拉伸时，细胞则发生回缩。

这是正常细胞与受损细胞的荧光显微镜检查结果。细胞在损伤后两小时用活率染料进行处理。这些分别是未拉伸的对照细胞、中度拉伸的细胞和严重拉伸的细胞。

该图显示了拉伸损伤后乳酸脱氢酶（LDH）释放到 snat 中的情况。在拉伸损伤后不同时间点测定培养基中释放的 LDH，并以经低强度和中等强度拉伸处理的细胞所释放的总可释放性 L-D-H-L-D-H 的百分比表示。低强度与中等强度拉伸组之间的 LDH 释放量无显著差异，且与未拉伸的对照组相比亦无显著差异。

与除一小时中度拉伸样本外的所有其他样本相比，严重拉伸的细胞释放出显著更多的乳酸脱氢酶（LDH）。该技术为神经生物学领域的研究人员探索海洋脑内皮细胞体外创伤性脑损伤奠定了基础。