Name: 高通量流式细胞仪检测细胞为基础的试验检测抗体，以N-甲基-D-天冬氨酸受体或多巴胺2受体在人血清 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 19 s
Description: 学习高通量流式细胞术检测人血清中抗NMDA受体或多巴胺2受体抗体的方法。该技术利用转染细胞系表达神经元抗原，实现快速定量分析，有助于提升免疫介导性神经系统疾病的诊断效率和治疗策略。

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本研究得到了澳大利亚国家卫生与医学研究委员会、Star Scientific基金会（澳大利亚）、抽动秽语综合征协会（美国）、Trish多发性硬化症研究基金会和澳大利亚多发性硬化症研究基金会、Petre基金会（澳大利亚）以及Rebecca L.&#160;Cooper医学研究基金会（澳大利亚）的支持。我们感谢所有为本研究提供样本的患者及家属。

1. 构建编码D2R或NMDAR的pIRES2-EGFP载体的亚克隆策略
<ol>
	<li>获取人源 D2R 或 NMDAR 亚基 1（NR1）的全长 cDNA 克隆。</li>
	<li>选择一种表达载体，例如 pIRES2-EGFP，该载体适用于跨膜蛋白的表达，并在内部核糖体进入位点（IRES）控制下携带增强型绿色荧光蛋白（GFP）报告基因，从而可在细胞中分别共表达目标抗原与 GFP。</li>
	<li>将人源 cDNA 亚克隆至 pIRES2-EGFP 载体中。
	<ol>
		<li>进行亚克隆时，使用适当的限制性内切酶（例如，人源 D2R cDNA 可使用 NheI 和 XhoI）。</li>
		<li>将酶切后的 cDNA 片段连接至经相同酶切的 pIRES2-EGFP 载体中。</li>
		<li>对连接后的 pIRES2-EGFP D2R 或 NMDAR 载体进行测序，以确认载体中含有正确的序列。</li>
		<li>纯化并扩增 pIRES2-EGFP D2R 或 NMDAR 载体，用于后续转染实验。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 表达神经元抗原的HEK293细胞转染
<ol>
	<li>在组织培养瓶中使用新鲜的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（1x）（DMEM），该培养基含有 4.5 g/L D-葡萄糖、L-谷氨酰胺和 110 mg/L 丙酮酸钠，并添加 10% 胎牛血清（FBS）、2 mM GlutaMAX 和 50 μg/ml 庆大霉素，培养 HEK293 细胞。</li>
	<li>使用胰蛋白酶消化并脱离 HEK293 细胞，转移至锥形管中。
	<ol>
		<li>以 250 × g 离心 6 分钟洗涤细胞，弃上清，将细胞沉淀重悬于新鲜的完全 DMEM 培养基中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>计数细胞，并将细胞以约 8 × 105 个/孔的密度接种于 6&#160;孔板中，每孔加入 2 ml DMEM，在 37 °C、5% CO2 的培养箱中过夜培养。</li>
	<li>当细胞融合度达到约 70% 时，按以下步骤用 pIRES2-EGFP NR1（HEK293NMDAR+ 细胞）、pIRES2-EGFP D2R（HEK293D2R+ 细胞）和 pIRES2-EGFP（HEK293CTL 细胞；空载体对照）质粒转染 HEK293 细胞。保留部分未转染的 HEK293 细胞用于后续补偿设置。
	<ol>
		<li>配制转染混合物，每孔包括 2.5 μg DNA、200 μl 0.9% 氯化钠溶液和 4 μg/ml 聚乙烯亚胺（PEI），溶于 2 ml&#160;新鲜完全 DMEM 中。</li>
		<li>立即涡旋混合物 10 秒，室温（RT）孵育 10 分钟，然后将转染混合物加入相应孔中。</li>
		<li>盖上培养板，用 Parafilm 封边，于 280 × g 离心 5 分钟以促进细胞转染。</li>
		<li>移除 Parafilm，将培养板放入培养箱中，在 37 °C 继续培养。</li>
		<li>18 小时后更换为新鲜的完全 DMEM 培养基，继续培养 72 小时。</li>
		<li>可选步骤：转染 72 小时后，可通过在完全 DMEM 培养基中添加 250 μg/ml 遗传霉素（Geneticin）进行筛选，以获得多克隆稳定转染细胞系。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 用于检测抗神经元表面抗体的流式细胞术细胞实验
<ol>
	<li>将 HEK293NMDAR+、HEK293D2R+ 和 HEK293CTL 细胞用每孔 500 μl 的 Versene 在 37 °C 下孵育约 5 分钟，使其脱离。
	<ol>
		<li>用每孔 2 ml 含 2% FBS 的 PBS (-Ca2+/-Mg2+)（即 PBS/FBS）重悬细胞，并转移至 15 ml 或 50 ml 锥形管中。</li>
		<li>以 250 × g 离心 6 分钟洗涤细胞，将细胞沉淀重悬于 15–50 ml PBS/FBS 中。重复洗涤两次。</li>
		<li>计数细胞后，将其以 1 × 106 个细胞/ml 的浓度重悬于 PBS/FBS 中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>设计用于流式细胞术检测的 96 孔板模板，需考虑 HEK293D2R+ 或 HEK293NMDAR+ 细胞以及 HEK293CTL 细胞均需与每份患者样本或一抗共同孵育。</li>
	<li>根据流式细胞术检测模板，将细胞以每孔 50,000 个细胞的密度接种至 V 型底 96 孔板中。</li>
	<li>将 96 孔板以 450 × g 离心 5 分钟使细胞沉淀，使用电子或多通道手动移液器小心吸除上清液，倾斜板子并注意避免吸走细胞沉淀。</li>
	<li>在室温避光条件下孵育 HEK293D2R+、HEK293NMDAR+ 和 HEK293CTL 细胞 1 小时，孵育体系包含：
	<ol>
		<li>一抗的系列稀释液，用于评估抗原表面表达水平。</li>
		<li>患者样本，用于检测抗体。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用适当的流式细胞术补偿对照，例如 未染色的未转染 HEK293 细胞、GFP+ HEK293 细胞（AF647-）以及未转染的 AF647+ HEK293 细胞（GFP）。</li>
	<li>以 450 × g 离心 5 分钟洗涤细胞，将细胞沉淀重悬于 170 μl PBS/FBS 中。重复洗涤步骤两次。</li>
	<li>在室温避光条件下，加入 1:100 稀释的 AF647 标记的二抗（针对患者血清使用抗人 IgG，针对抗 NR1 或抗 D2R 一抗使用抗小鼠 IgG），孵育细胞 1 小时。</li>
	<li>按照步骤 3.7 的方法洗涤细胞三次，最后将细胞重悬于 35 μl PBS/FBS 中，用于流式细胞术检测。</li>
	<li>在流式细胞仪（BDLSRII）上设置高通量进样器（HTS）。</li>
	<li>根据流式细胞术检测模板，每孔采集 10,000 个事件。</li>
	<li>导出数据并使用流式细胞术分析软件（如 FlowJo v7.5）进行分析：
	<ol>
		<li>首先根据前向散射（细胞大小）和侧向散射（细胞粒度）对活的 HEK293 细胞设门。</li>
		<li>进一步根据高 GFP 阳性信号对活的 HEK293 细胞设门，仅分析转染成功的细胞。</li>
		<li>测定活的 GFP 阳性细胞中 AF647 通道的平均荧光强度（MFI）。</li>
		<li>将数据导出至 Excel 或 Prism 进行分析：
		<ol>
			<li>绘制一抗（抗 NMDAR 或抗 D2R 抗体）浓度与其孵育后细胞所得 MFI 的关系曲线。</li>
			<li>对每位患者及对照样本，通过从 HEK293D2R+ 或 HEK293NMDAR+ 细胞的 MFI 中减去 HEK293CTL 细胞的 MFI，计算 ΔMFI。</li>
			<li>通过将对照组 ΔMFI 均值加上三个标准差，计算抗体阳性的阈值。</li>
			<li>将各样本按血清类型分组绘图，并以一条线表示该阈值。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Lancaster, E., Martinez-Hernandez, E., Dalmau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encephalitis+and+antibodies+to+synaptic+and+neuronal+cell+surface+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Neurol%22%5BJournal%5D)">Encephalitis and antibodies to synaptic and neuronal cell surface proteins.</a> Neurol. 77, 179-189 (2011).</li>
<li>Vincent, A., Bien, C. G., Irani, S. R., Waters, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoantibodies+associated+with+diseases+of+the+CNS%3A+new+developments+and+future+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurol%22%5BJournal%5D)">Autoantibodies associated with diseases of the CNS: new developments and future challenges.</a> Lancet Neurol. 10, 759-772 (2011).</li>
<li>Dalmau, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-NMDA-receptor+encephalitis%3A+case+series+and+analysis+of+the+effects+of+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurol%22%5BJournal%5D)">Anti-NMDA-receptor encephalitis: case series and analysis of the effects of antibodies.</a> Lancet Neurol. 7, 1091-1098 (2008).</li>
<li>Dalmau, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paraneoplastic+anti-N-methyl-D-aspartate+receptor+encephalitis+associated+with+ovarian+teratoma%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">Paraneoplastic anti-N-methyl-D-aspartate receptor encephalitis associated with ovarian teratoma.</a> Ann Neurol. 61, 25-36 (2007).</li>
<li>Dale, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-methyl-D-aspartate+receptor+antibodies+in+pediatric+dyskinetic+encephalitis+lethargica%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">N-methyl-D-aspartate receptor antibodies in pediatric dyskinetic encephalitis lethargica.</a> Ann Neurol. 66, 704-709 (2009).</li>
<li>Lancaster, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+to+the+GABA%28B%29+receptor+in+limbic+encephalitis+with+seizures%3A+Case+series+and+characterisation+of+the+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurol%22%5BJournal%5D)">Antibodies to the GABA(B) receptor in limbic encephalitis with seizures: Case series and characterisation of the antigen.</a> Lancet Neurol. 9, 67-76 (2010).</li>
<li>Lai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AMPA+receptor+antibodies+in+limbic+encephalitis+alter+synaptic+receptor+location%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">AMPA receptor antibodies in limbic encephalitis alter synaptic receptor location.</a> Ann Neurol. 65, 424-434 (2009).</li>
<li>Irani, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+to+Kv1+potassium+channel-complex+proteins+leucine-rich%2C+glioma+inactivated+1+protein+and+contactin-associated+protein-2+in+limbic+encephalitis%2C+Morvan%E2%80%99s+syndrome+and+acquired+neuromyotonia%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Antibodies to Kv1 potassium channel-complex proteins leucine-rich, glioma inactivated 1 protein and contactin-associated protein-2 in limbic encephalitis, Morvan’s syndrome and acquired neuromyotonia.</a> Brain. 133, 2734-2748 (2010).</li>
<li>Lai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+LGI1+as+the+antigen+in+limbic+encephalitis+previously+attributed+to+potassium+channels%3A+a+case+series%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurol%22%5BJournal%5D)">Investigation of LGI1 as the antigen in limbic encephalitis previously attributed to potassium channels: a case series.</a> Lancet Neurol. 9, 776-785 (2010).</li>
<li>Lancaster, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+to+metabotropic+glutamate+receptor+5+in+the+Ophelia+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Neurol%22%5BJournal%5D)">Antibodies to metabotropic glutamate receptor 5 in the Ophelia syndrome.</a> Neurol. 77, 1698-1701 (2011).</li>
<li>Dale, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+to+surface+dopamine-2+receptor+in+autoimmune+movement+and+psychiatric+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Antibodies to surface dopamine-2 receptor in autoimmune movement and psychiatric disorders.</a> Brain. , (2012).</li>
<li>Titulaer, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+and+prognostic+factors+for+long-term+outcome+in+patients+with+anti-NMDA+receptor+encephalitis%3A+an+observational+cohort+study%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurol%22%5BJournal%5D)">Treatment and prognostic factors for long-term outcome in patients with anti-NMDA receptor encephalitis: an observational cohort study.</a> Lancet Neurol. 12, 157-165 (2013).</li>
<li>Hughes, E. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+synaptic+mechanisms+of+anti-NMDA+receptor+encephalitis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cellular and synaptic mechanisms of anti-NMDA receptor encephalitis.</a> J Neurosci. 30, 5866-5875 (2010).</li>
<li>Bien, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunopathology+of+autoantibody-associated+encephalitides%3A+clues+for+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Immunopathology of autoantibody-associated encephalitides: clues for pathogenesis.</a> Brain. 135, 1622-1638 (2012).</li>
<li>Waters, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serologic+diagnosis+of+NMO%3A+a+multicenter+comparison+of+aquaporin-4-IgG+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Neurol%22%5BJournal%5D)">Serologic diagnosis of NMO: a multicenter comparison of aquaporin-4-IgG assays.</a> Neurol. 78, 665-671 (2012).</li>
<li>McLaughlin, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-Dependent+B+Cell+Autoimmunity+to+a+Myelin+Surface+Antigen+in+Pediatric+Multiple+Sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Age-Dependent B Cell Autoimmunity to a Myelin Surface Antigen in Pediatric Multiple Sclerosis.</a> J Immunol. 183, 4067-4076 (2009).</li>
<li>Probstel, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+to+MOG+are+transient+in+childhood+acute+disseminated+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22Neurol%22%5BJournal%5D)">Antibodies to MOG are transient in childhood acute disseminated encephalomyelitis.</a> Neurol. 77, 580-588 (2011).</li>
<li>Cho, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-terminal+Region+of+Dopamine+D2+Receptor%2C+a+Rhodopsin+Family+GPCR%2C+Regulates+Proper+Integration+into+Plasma+Membrane+and+Endocytic+Routes%5BTitle%5D)+AND+%22British+journal+of+pharmacology%22%5BJournal%5D)">N-terminal Region of Dopamine D2 Receptor, a Rhodopsin Family GPCR, Regulates Proper Integration into Plasma Membrane and Endocytic Routes.</a> British journal of pharmacology. , (2011).</li>
<li>Zhou, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+pathogenic+antibody+response+to+native+myelin+oligodendrocyte+glycoprotein+in+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Identification of a pathogenic antibody response to native myelin oligodendrocyte glycoprotein in multiple sclerosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 19057-19062 (2006).</li>
<li>Brilot, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+to+native+myelin+oligodendrocyte+glycoprotein+in+children+with+inflammatory+demyelinating+central+nervous+system+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">Antibodies to native myelin oligodendrocyte glycoprotein in children with inflammatory demyelinating central nervous system disease.</a> Ann Neurol. 66, 833-842 (2009).</li>
<li>Boronat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encephalitis+and+Antibodies+to+Dipeptidyl-Peptidase-Like+Protein-6%2C+a+Subunit+of+Kv4.2%5BTitle%5D)+AND+%22Potassium+Channels.+Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">Encephalitis and Antibodies to Dipeptidyl-Peptidase-Like Protein-6, a Subunit of Kv4.2.</a> Potassium Channels. Ann Neurol. 73, 120-128 (2013).</li>
<li>Hinson, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aquaporin-4-binding+autoantibodies+in+patients+with+neuromyelitis+optica+impair+glutamate+transport+by+down-regulating+EAAT2%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Aquaporin-4-binding autoantibodies in patients with neuromyelitis optica impair glutamate transport by down-regulating EAAT2.</a> J. Exp. Med. 205, 2473-2481 (2008).</li>
</ol>

利益冲突：F.B. 和 R.C.D.（悉尼大学）已提交一项专利，声称D2R是自身抗体的作用靶点。

本文介绍了一种基于流式细胞术的活细胞检测新方法，利用高通量进样器检测靶向特定细胞表面神经元蛋白的抗体。通过该技术，我们发现一组自身免疫性中枢神经系统疾病患者血清中存在针对细胞表面NMDAR或细胞表面D2R的抗体。
使用此高通量流式细胞术活细胞检测方法进行最佳抗体检测的关键步骤包括：1）获得大量健康的转染细胞，2）验证目的抗原在细胞表面的高表达水平，3）利用一组对照样本确定抗体阳性的阈值，4）确认数据的可重复性。
健康细胞的培养是该技术成功的关键。HEK293细胞以其易于培养、转染效率高以及不表达神经元蛋白的特性而广为人知，因此常被用于基于细胞的检测，以发现针对特定神经元抗原的抗体4,5,8-10。为了准确计算MFI，获得高比例活GFP+细胞的最优转染率对该检测至关重要。因此，构建GFP+ HEK293NMDAR+、HEK293D2R+或HEK293CTL的多克隆稳定细胞系具有优势，因其可提供稳定且...

近年来，已发现多种中枢神经系统（CNS）的自身免疫性疾病。研究表明，这些疾病与自身抗体的存在密切相关，并由此定义。这些抗体可结合于参与神经传递的神经元受体或突触蛋白1,2。目前已发现多种不同的抗原，包括N-甲基-D-天冬氨酸受体（NMDAR）3-5、γ-氨基丁酸B型受体（GABAB受体）6、α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异噁唑丙酸（AMPA）受体7、电压门控钾通道（VGKC）相关蛋白：富含亮氨酸的胶质瘤失活1蛋白（LGI1）和接触蛋白相关蛋白2（Caspr2）8,9、谷氨酸受体5,10以及多巴胺-2受体（D2R）11。过去，这些自身免疫性中枢神经系统疾病（主要称为脑炎）常被漏诊或未予治疗。这些新发现的抗体生物标志物，例如抗NMDAR抗体或多巴胺-2受体抗体，显著提高了临床诊断率和认知度，并为患者提供了新的治疗选择。事实上，早期采用免疫治疗可显著改善患者预后11,12。
检测抗体的传统方法，如酶联免疫吸附试验（ELISA）和蛋白质印迹法（western blot），已被用于血清中抗体的检测。然而，这些方法难以有效识别细胞外或细胞表面的表位，反而可能检测到针对细胞内表位的免疫反应性。此外，结合于参与神经传递的重要蛋白质胞外结构域的抗体很可能具有致病性2,3,7,13,14。因此，开发准确且敏感的检测方法以发现患者体内相关的细胞表面或细胞外抗体靶点至关重要。该领域的金标准方法是基于使用活细胞的“基于细胞的检测法”（cell-based assays）。该方法通过转染含有目标抗原完整cDNA序列的载体，使抗原以其天然构象表达于哺乳动物细胞（最常用的是人胚胎肾293（HEK293）细胞）表面。随后将未通透处理的活细胞与稀释后的患者血清孵育，再加入荧光染料标记的抗人免疫球蛋白（Ig）二抗。通过检测荧光强度或水平，反映自身抗体的结合程度。该技术具有高度特异性，因为细胞中仅过表达一种抗原。目前最广泛采用的“读出”方式是在免疫细胞化学染色后进行共聚焦显微镜分析4,5,8-10。然而，基于流式细胞术的细胞检测法也已成功用于检测脱髓鞘疾病患者的抗体15-17。特别是Waters&#160;et al.15比较了包括基于细胞的检测法结合显微镜或流式细胞术分析在内的多种抗体检测技术，结果表明基于流式细胞术的细胞检测法是最敏感、准确且可靠的方法。因此，基于流式细胞术的细胞检测法具有显著优势：它可实现定量分析，结果不依赖于操作者主观判断，且无需使用放射性物质。此外，该方法操作便捷，可在短时间内完成对大量患者样本的检测。
最近，我们优化了一种高通量流式细胞术细胞实验方法，用于检测自身免疫性中枢神经系统疾病患者体内的NMDAR抗体和D2R抗体11。我们课题组近期采用流式细胞术细胞实验检测了患者血清中的NMDAR抗体，这些NMDAR抗体阳性的血清此前通过共聚焦显微镜分析也已被确认为阳性11。本方案描述了一种利用自动化高通量进样器，通过流式细胞术细胞实验检测患者血清中构象敏感性中枢神经系统抗体的方法。

<table><tbody><tr><td>pIRES2-EGFP 载体</td><td>Clontech</td><td>6029-1</td><td></td></tr><tr><td>人HA-多巴胺-2受体（D2R）cDNA</td><td>密苏里州&amp;amp;T cDNA资源中心</td><td>DRD020TN00</td><td></td></tr><tr><td>人NMDAR亚基1（NR1）cDNA</td><td></td><td></td><td>A. Vincent 教授惠赠&amp;nbsp; （英国牛津）</td></tr><tr><td>单克隆纯化小鼠抗人NR1抗体（克隆：54.1）</td><td>BD Pharmingen</td><td>556308</td><td></td></tr><tr><td>小鼠纯化的单克隆抗DRD2 IgG（克隆：1B11）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>WH0001813M1-50UG</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 驴抗小鼠 IgG（H + L）</td><td>Invitrogen</td><td>A31571</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 山羊抗人 IgG（H + L）</td><td>Invitrogen</td><td>A21445</td><td></td></tr><tr><td>杜尔贝科&amp;rsquo;含4.5 g/L D-葡萄糖、L-谷氨酰胺和110 mg/L丙酮酸钠的改良型厄尔氏培养基（1x）</td><td>Invitrogen</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Invitrogen</td><td>10099-141</td><td></td></tr><tr><td>庆大霉素</td><td>Invitrogen</td><td>15710-072</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Invitrogen</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>遗传霉素</td><td>Invitrogen</td><td>10131-035</td><td></td></tr><tr><td>杜氏磷酸盐缓冲液（1x）（-Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;/-Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;)</td><td>Invitrogen</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>含酚红的 TrypLE Express (1x)</td><td>Invitrogen</td><td>12605-028</td><td></td></tr><tr><td>0.9% 氯化钠</td><td>Baxter</td><td>AHF7975</td><td></td></tr><tr><td>聚乙烯亚胺</td><td>Polysciences 公司</td><td>9002-98-6</td><td></td></tr><tr><td>Versene</td><td>Invitrogen</td><td>15040-066</td><td></td></tr><tr><td>XhoI</td><td>罗氏</td><td>10899194001</td><td></td></tr><tr><td>NheI</td><td>罗氏</td><td>10885843001</td><td></td></tr><tr><td>PureLink PCR 纯化试剂盒</td><td>Invitrogen</td><td>K3100-01</td><td></td></tr><tr><td>JetQuick 凝胶回收离心柱试剂盒</td><td>基因组学</td><td>420050</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA连接酶</td><td>罗氏</td><td>10481220001</td><td></td></tr><tr><td>质粒&amp;nbsp;加&amp;nbsp;Maxi 试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>12963</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>设备/软件名称</td><td>公司</td><td>货号</td><td>模型/版本</td></tr><tr><td>配备高通量进样系统的流式细胞仪</td><td>BD 生物科学</td><td></td><td>BDLSRII 配 HTS</td></tr><tr><td>倒置显微镜</td><td>奥林巴斯</td><td></td><td>CKX41（配备汞灯和U-RFLT50电源）</td></tr><tr><td>电子多通道移液器（15-300） &amp;mu;l)</td><td>Eppendorf</td><td>613-2240P</td><td>12通道Xplorer Plus</td></tr><tr><td>Excel</td><td>微软</td><td></td><td>2010</td></tr><tr><td>Prism</td><td>GraphPad Software, Inc.</td><td></td><td>v4</td></tr><tr><td>FlowJo</td><td>Treestar</td><td></td><td>v7.5</td></tr><tr><td>50 ml 聚丙烯锥形管</td><td>BD 生物科学</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>6孔板</td><td>BD 生物科学</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>组织培养瓶（T75）</td><td>BD 生物科学</td><td>353136</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>佩秦尼塑料包装</td><td>PM-992</td><td></td></tr><tr><td>V型底96孔板</td><td>康宁</td><td>651180</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td></tr></tbody></table>

高通量流式细胞术细胞检测法用于检测人血清中抗n-甲基-d-天冬氨酸受体或抗多巴胺-2受体抗体

High-throughput Flow Cytometry Cell-based Assay to Detect Antibodies to N-Methyl-D-aspartate Receptor or Dopamine-2 Receptor in Human Serum

近年来，在儿童和成人自身免疫性中枢神经系统疾病中，已检测到针对神经传递相关表面蛋白和构象蛋白的抗体。这些抗体已被用于指导疾病的诊断和治疗。基于细胞的检测方法提高了患者血清中抗体的检出率。该方法基于真核细胞表面表达脑部抗原，随后与稀释的患者血清孵育，再加入荧光染料标记的二抗。洗涤后，通过流式细胞术分析二抗的结合情况。本研究团队已开发出一种高通量流式细胞术活细胞检测方法，可可靠地检测针对特定神经递质受体的抗体。该流式细胞术方法操作简便、定量准确、高效，并且借助高通量进样系统，可在短时间内轻松检测大量患者样本。此外，这种基于细胞的检测方法可轻松改造，用于检测针对中枢神经系统及外周多种不同抗原靶点的抗体。发现更多新型抗体生物标志物将有助于实现免疫介导疾病的快速而准确的诊断，并改善治疗效果。

使用高通量进样器在流式细胞仪上获取活的 HEK293D2R+ 和 HEK293CTL 细胞。分析过程中，根据前向散射（大小）和侧向散射（颗粒度）参数对细胞进行设门（图 1A 和 1D）。转染的 HEK293 细胞在细胞质中表达报告分子 GFP，未转染的细胞被排除在分析之外（图 1B 和 1E）。在 GFP+ 设门范围内，测定与 AF647 标记的抗人 IgG 二抗结合相关的平均荧光强度（MFI）（图 1C 和 1F）。为了消除分析人血清时的背景荧光，通过从 HEK293D2R+ 细胞的 MFI 中减去 HEK293CTL 细胞的 MFI 来计算 ΔMFI（图 1G）。所示数据代表 D2R 抗体分析的典型结果，相同的设门策略和数据分析方法也可用于 NMDAR 抗体检测（数据未显示）。
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近年来，基于活细胞的检测方法已成功用于检测针对细胞表面和构象性抗原的抗体。本文介绍了一种利用高通量流式细胞术的方法，可实现对大规模患者队列的分析。新抗体的发现将有助于改善免疫介导性疾病的确诊与治疗。

高通量流式细胞术细胞检测法用于检测人血清中抗N-甲基-D-天冬氨酸受体或抗多巴胺-2受体抗体

近年来，在自身免疫性中枢神经系统疾病中检测到针对神经传递相关表面蛋白和构象蛋白的抗体……

以下实验的总体目标是利用高通量流式细胞术细胞结合实验，在患者样本中检测神经元抗 D2R 或 NMDAR 抗体。该目标通过将人源 D2R 或 NMDAR 的完整 cDNA 序列克隆至质粒中实现。第二步，转染人源细胞系，从而在细胞表面表达神经元抗原。随后，将转染的细胞与患者血清及适当的二抗孵育，然后进行流式细胞术检测。为检测抗体与细胞表面抗原的结合，实验结果基于流式细胞术分析获得。本研究建立的高通量三通道流式细胞术细胞检测方法快速、定量且高效，适用于大规模患者样本的分析。这相较于使用基于细胞的检测方法结合免疫化学与共聚焦分析具有显著优势。通常，初次使用该方法的研究人员在实验过程中会因细胞丢失而难以在流式细胞仪上获得足够数量的细胞。在洗涤步骤之间应小心避免吸走细胞。选择一种适用于跨膜蛋白表达的表达载体，并能够分别实现抗原和绿色荧光蛋白的细胞共表达。例如，该载体含有一个增强型绿色荧光蛋白（GFP）报告基因，受内部核糖体进入位点（IRES）调控。在通过测序验证克隆后，使用适当的限制性内切酶将全长人源 CD NA 插入载体中，制备适用于转染培养的质粒储备液。使用含 10% 胎牛血清的完全 DMEM 培养 HEK 293 细胞。用胰蛋白酶消化收获细胞，经一次洗涤后离心收集细胞，并将细胞沉淀重悬于新鲜的完全DMEM培养基中。计数细胞后，将细胞以每孔2毫升接种于6孔板中，接种密度约为70%融合度。为转染实验分配好HEK 293细胞的孔位，分别用于转染表达质粒和对照载体。同时保留部分未转染的HEK 293细胞，用于后续的补偿对照。制备转染混合物，包含200微升0.9%氯化钠溶液、2.5微克DNA和每毫升4微克的聚乙烯亚胺。立即涡旋振荡10秒，室温孵育10分钟，然后将转染混合物加入含有2毫升新鲜完全DMM的每孔中。盖好培养板，用Perfil包裹四周，在280 ×g条件下离心5分钟，以促进细胞转染。然后移除封口膜，将培养板置于培养条件下培养18小时。弃去原培养基，更换为新鲜的完全DMEM培养基，并继续培养72小时。为消化细胞，每孔加入500 µL胰蛋白酶溶液，在37°C孵育约5分钟。然后，用两毫升含2% FBS的PBS重悬每个孔中的细胞，经三次洗涤后将细胞转移至锥形管中。用含2% FBS的溶液将细胞沉淀重悬至每毫升含100万个细胞。接下来设计96孔流式细胞术检测模板，使不同的细胞系分别与每位患者的样本或一抗共同孵育。然后，将每孔50,000个细胞接种于V型底96孔板中，以450 × g离心5分钟使细胞形成沉淀。将板子倾斜一定角度，轻轻吸除上清液，注意不要吸走细胞沉淀。接着，加入梯度稀释的一抗，以评估抗原的表面表达水平。然后加入患者样本以检测抗体，在170微升的2% FBS溶液中洗涤三次后，于室温避光孵育一小时，加入相应的AF 647标记的二抗：针对患者的抗人IgG和针对US的IgG一抗。在三次洗涤后，于室温避光条件下杂交一小时。用35微升含2% FBS的溶液重悬细胞，用于流式细胞仪的流式细胞术检测。首先设置高通量进样器。根据流式细胞术检测模板，每孔采集10,000个事件。使用流式细胞术分析软件导出并分析数据，根据前向散射和侧向散射圈选活的HEK 293细胞。同时圈选GFP高表达阳性细胞，以仅分析转染的细胞。测定活的GFP阳性细胞中AF 647通道的平均荧光强度。然后将数据导出至 Excel 或 Prism 进行分析。绘制每例患者及对照样本中对应的主要抗体浓度与获得的 MFI 值的关系曲线。计算 delta MFI，并通过将对照组 delta MFI 均值加上三个标准差来确定抗体阳性的阈值。然后在图表上按患者组别对个体样本进行分组绘制。将阈值表示为一条线。使用高通量进样器在流式细胞仪上获取表达N-甲基-D-天冬氨酸受体或多巴胺2受体的细胞。分析过程中，根据前向散射（反映细胞大小）和侧向散射（反映细胞颗粒度）对细胞进行设门。转染的HK293细胞在细胞质中表达GFP报告分子，未转染的细胞在GFP阳性门内被排除在分析之外。通过检测AF647标记的抗人IgG二抗结合所产生的平均荧光强度（MFI），以消除分析人血清时的背景荧光干扰。通过减去对照细胞的背景MFI来计算Δ MFI。该基于流式细胞术的细胞检测方法依赖于抗体对目标细胞表面抗原的检测。例如，转染了N-M-D-A-R表达质粒的GK 2 93细胞显示出表面甲基化受体的高表达。同样，转染 D2R 的细胞表达了多巴胺 D2 受体，而对照细胞则不表达这两种抗原中的任何一种。本项临床研究评估了一个 NMDAR 脑炎患者队列、一个 D2R 抗体相关脑炎患者队列，以及一个患有其他非炎性神经系统疾病的对照队列。需要注意的是，所有抗体阳性患者均未同时出现双重抗体阳性。靶向 N-M-D-A-R-M-D 二聚体 R 符合预期。在所分析的任何对照样本中均未检测到 N-M-D-A-R 和 D 二聚体 R 抗体。掌握该技术后，可在约 80 个样本中完成实验，总耗时五小时，其中流式数据采集约需一小时，此为技术开发完成后的操作时间。该技术为神经免疫学领域的研究人员发现免疫介导疾病中的新型抗体靶点铺平了道路。

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