高通量流式细胞术细胞检测法用于检测人血清中抗N-甲基-D-天冬氨酸受体或抗多巴胺-2受体抗体
2013年11月23日
近年来，基于活细胞的检测方法已成功用于检测针对细胞表面和构象性抗原的抗体。本文介绍了一种利用高通量流式细胞术的方法，可实现对大规模患者队列的分析。新抗体的发现将有助于改善免疫介导性疾病的确诊与治疗。
以下实验的总体目标是利用高通量流式细胞术细胞结合实验，在患者样本中检测神经元抗 D2R 或 NMDAR 抗体。该目标通过将人源 D2R 或 NMDAR 的完整 cDNA 序列克隆至质粒中实现。第二步，转染人源细胞系，从而在细胞表面表达神经元抗原。
随后，将转染的细胞与患者血清及适当的二抗孵育，然后进行流式细胞术检测。为检测抗体与细胞表面抗原的结合，实验结果基于流式细胞术分析获得。本研究建立的高通量三通道流式细胞术细胞检测方法快速、定量且高效，适用于大规模患者样本的分析。
这相较于使用基于细胞的检测方法结合免疫化学与共聚焦分析具有显著优势。通常，初次使用该方法的研究人员在实验过程中会因细胞丢失而难以在流式细胞仪上获得足够数量的细胞。在洗涤步骤之间应小心避免吸走细胞。
选择一种适用于跨膜蛋白表达的表达载体，并能够分别实现抗原和绿色荧光蛋白的细胞共表达。例如，该载体含有一个增强型绿色荧光蛋白（GFP）报告基因，受内部核糖体进入位点（IRES）调控。在通过测序验证克隆后，使用适当的限制性内切酶将全长人源 CD NA 插入载体中，制备适用于转染培养的质粒储备液。使用含 10% 胎牛血清的完全 DMEM 培养 HEK 293 细胞。
用胰蛋白酶消化收获细胞，经一次洗涤后离心收集细胞，并将细胞沉淀重悬于新鲜的完全DMEM培养基中。计数细胞后，将细胞以每孔2毫升接种于6孔板中，接种密度约为70%融合度。为转染实验分配好HEK 293细胞的孔位，分别用于转染表达质粒和对照载体。同时保留部分未转染的HEK 293细胞，用于后续的补偿对照。
制备转染混合物，包含200微升0.9%氯化钠溶液、2.5微克DNA和每毫升4微克的聚乙烯亚胺。立即涡旋振荡10秒，室温孵育10分钟，然后将转染混合物加入含有2毫升新鲜完全DMM的每孔中。盖好培养板，用Perfil包裹四周，在280 ×g条件下离心5分钟，以促进细胞转染。
然后移除封口膜，将培养板置于培养条件下培养18小时。弃去原培养基，更换为新鲜的完全DMEM培养基，并继续培养72小时。为消化细胞，每孔加入500 µL胰蛋白酶溶液，在37°C孵育约5分钟。
然后，用两毫升含2% FBS的PBS重悬每个孔中的细胞，经三次洗涤后将细胞转移至锥形管中。用含2% FBS的溶液将细胞沉淀重悬至每毫升含100万个细胞。接下来设计96孔流式细胞术检测模板，使不同的细胞系分别与每位患者的样本或一抗共同孵育。
然后，将每孔50,000个细胞接种于V型底96孔板中，以450 × g离心5分钟使细胞形成沉淀。将板子倾斜一定角度，轻轻吸除上清液，注意不要吸走细胞沉淀。接着，加入梯度稀释的一抗，以评估抗原的表面表达水平。
然后加入患者样本以检测抗体，在170微升的2% FBS溶液中洗涤三次后，于室温避光孵育一小时，加入相应的AF 647标记的二抗：针对患者的抗人IgG和针对US的IgG一抗。在三次洗涤后，于室温避光条件下杂交一小时。
用35微升含2% FBS的溶液重悬细胞，用于流式细胞仪的流式细胞术检测。首先设置高通量进样器。根据流式细胞术检测模板，每孔采集10,000个事件。
使用流式细胞术分析软件导出并分析数据，根据前向散射和侧向散射圈选活的HEK 293细胞。同时圈选GFP高表达阳性细胞，以仅分析转染的细胞。测定活的GFP阳性细胞中AF 647通道的平均荧光强度。
然后将数据导出至 Excel 或 Prism 进行分析。绘制每例患者及对照样本中对应的主要抗体浓度与获得的 MFI 值的关系曲线。计算 delta MFI，并通过将对照组 delta MFI 均值加上三个标准差来确定抗体阳性的阈值。
然后在图表上按患者组别对个体样本进行分组绘制。将阈值表示为一条线。使用高通量进样器在流式细胞仪上获取表达N-甲基-D-天冬氨酸受体或多巴胺2受体的细胞。
分析过程中，根据前向散射（反映细胞大小）和侧向散射（反映细胞颗粒度）对细胞进行设门。转染的HK293细胞在细胞质中表达GFP报告分子，未转染的细胞在GFP阳性门内被排除在分析之外。通过检测AF647标记的抗人IgG二抗结合所产生的平均荧光强度（MFI），以消除分析人血清时的背景荧光干扰。
通过减去对照细胞的背景MFI来计算Δ MFI。该基于流式细胞术的细胞检测方法依赖于抗体对目标细胞表面抗原的检测。例如，转染了N-M-D-A-R表达质粒的GK 2 93细胞显示出表面甲基化受体的高表达。
同样，转染 D2R 的细胞表达了多巴胺 D2 受体，而对照细胞则不表达这两种抗原中的任何一种。本项临床研究评估了一个 NMDAR 脑炎患者队列、一个 D2R 抗体相关脑炎患者队列，以及一个患有其他非炎性神经系统疾病的对照队列。需要注意的是，所有抗体阳性患者均未同时出现双重抗体阳性。
靶向 N-M-D-A-R-M-D 二聚体 R 符合预期。在所分析的任何对照样本中均未检测到 N-M-D-A-R 和 D 二聚体 R 抗体。掌握该技术后，可在约 80 个样本中完成实验，总耗时五小时，其中流式数据采集约需一小时，此为技术开发完成后的操作时间。
该技术为神经免疫学领域的研究人员发现免疫介导疾病中的新型抗体靶点铺平了道路。
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概述
本研究介绍了一种高通量流式细胞术方法，用于检测患者样本中针对神经元D2R或NMDA-R的抗体。该方法旨在通过高效分析大规模队列，提高免疫介导性疾病的诊断与治疗水平。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 免疫学
- 细胞生物学
背景
- 基于活细胞的检测方法正越来越多地用于检测针对抗原的抗体。
- 高通量技术可实现对大规模患者队列的分析。
- 发现新型抗体可显著影响临床治疗效果。
- 流式细胞术可提供抗体结合的定量数据。
研究目的
- 检测患者样本中的特异性神经元抗体。
- 采用高通量流式细胞术以提高效率。
- 改进免疫介导性疾病的诊断方法。
使用的方法
- 将人源 D2R 或 NMDA-R 的全长 cDNA 序列亚克隆至质粒中。
- 转染人源细胞系，使其在细胞表面表达神经元抗原。
- 将转染后的细胞与患者血清及二抗共同孵育。
- 通过流式细胞术分析结果，检测抗体结合情况。
主要结果
- 流式细胞术检测快速且具有定量性。
- 它能够对大量患者样本队列进行分析。
- 结果表明神经元抗体检测成功。
- 该方法可提高诊断和治疗策略的准确性。
结论
- 高通量流式细胞术在抗体检测中具有良好的效果。
- 该方法在提升临床诊断水平方面具有潜在应用价值。
- 未来的研究可在此基础上拓展该方法在其他免疫介导性疾病中的应用。
常见问题
行业重要性概述
这种高通量流式细胞术细胞检测方法可快速、定量地检测人血清中针对神经元靶标（如 D2R 和 NMDA-R）的自身抗体。该方法通过标准化读数支持大规模队列分析，从而加强自身免疫性中枢神经系统疾病中的靶点验证和生物标志物发现。其对多种抗原靶标的适应性增强了从发现到临床前评估的转化连续性。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：通过检测针对表面表达的神经递质受体的致病性自身抗体，实现对治疗假设的验证。
- 操作价值：提供定量的MFI读数，支持在免疫介导疾病模型中对靶点结合进行生物学风险评估。
- 预测价值：基于对照队列得出的Δ MFI阈值和三倍标准差阳性截断值，助力项目组合的优先级筛选。
筛选与检测方法开发
- 科学价值：构建经过验证的生物系统（表达 D2R 或 NMDA-R 并带有 GFP 报告基因的 HEK 293 细胞），用于后续的抗体筛选工作流程。
- 操作价值：通过高通量进样器、一致的细胞接种（50,000 个细胞/孔）和固定的采集参数（每孔 10,000 个事件），确保检测的标准化。
- 可扩展性价值：可在五小时内处理约 80 个样本，支持大规模队列分析，并可在不同抗原靶标间重复使用该平台。
转化与临床前研究
- 转化价值：通过使用与疾病相关的队列（抗NMDA受体脑炎、抗D2R抗体脑炎、非炎症性对照），将发现阶段的抗体检测与临床前研究的连续性相衔接。
- 机制性风险降低：利用GFP门控及AF647二抗信号扣除法消除背景荧光，提高靶标特异性信号的可信度。
- 预测可信度：通过确认患者群体中无双阳性信号，并建立疾病特异性的信号阈值，支持基于风险评估的后续推进决策。
流程与工作流整合
该检测适用于从靶点验证到先导化合物鉴定的整个发现过程，可在临床前研究推进之前支持假设验证和生物标志物的确证。
- 发现生物学：通过在活的GFP阳性HEK 293细胞上进行流式细胞术门控，检测抗体与表面抗原的结合，支持假设验证。
- 筛选：通过可重复的转染、表面表达验证以及标准化的二抗孵育（AF647标记的抗人IgG），实现检测就绪。
- 分析：通过计算ΔMFI、使用Excel/Prism绘图，并结合对照组队列的统计学数据确定阈值，实现不同条件间的比较分析。
- 转化研究：利用临床明确定义的患者队列和特异性疾病抗体检测（无交叉反应性），连接临床前研究的连续性。
- 企业级复用：通过将全长cDNA亚克隆至表达载体，可适应多种中枢神经系统及外周抗原，作为可重复使用的平台发挥作用。
运营与企业影响
- 科学价值：通过定量、扣除背景的荧光读数减少机制上的不确定性，从而提高靶点验证的预测可信度。
- 操作价值：借助高通量取样器、固定的细胞密度和自动化采集模板，实现标准化和可扩展性。
- 战略价值：提供定量的自身抗体阈值，降低中枢神经系统治疗药物开发中后期的生物学风险，从而改善决策（推进或终止项目）。
- 项目组合影响：通过明确的阳性阈值和队列分层，支持在免疫介导疾病生物标志物发现中进行基于风险调整的优先排序。
实施注意事项
- 需要具备分子克隆、哺乳动物细胞转染以及流式细胞术补偿对照方面的专业知识。
- 依赖于特定仪器，包括配备高通量进样器、荧光检测功能（FSC、SSC、GFP、AF647）以及用于细胞处理的离心机的流式细胞仪。
- 需要在发现研究团队与转化研究团队之间对转染方案、血清稀释方案以及设门策略进行跨团队标准化。
- 针对不同抗原靶标时需进行适应性调整，每种新构建体均需重新验证其表面表达及GFP共表达情况。
- 实际操作中的限制因素包括洗涤步骤中的细胞损失，以及需避免吸出细胞沉淀，如实验方案中所述。
生物制药常见问题
Chapters in this video
0:05
Title
1:37
Subcloning Strategy: D2R or NMDAR into pIRES2-EGFP Vector
2:20
Transfection: Expression of Neuronal Antigen in HEK293 Cells
4:15
Flow Cytometry Cell-based Assay for Detection of Antibody to Surface Neuronal Antigens
7:44
Results: Detection/Analysis of Antibody Binding
9:45
Conclusion
