Name: 就地 液体生物组件的 TEM (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-30T20:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 28 s
Description: 学习利用透射电子显微镜在液体环境中对轮状病毒复合物进行纳米级分辨率成像的方法。通过亲和捕获表面固定生物大分子，观察其动态行为，为病毒结构与疫苗研发提供新见解。

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作者感谢弗吉尼亚理工卡里隆研究所所长迈克尔·J·弗里德兰德博士（Dr. Michael J. Friedlander）对我们研究工作的鼓励。本项目得到了S.M.M.和D.F.K.的启动资金支持，部分经费来自弗吉尼亚理工学院关键技术和应用科学研究所的纳米-生物计划。

1. 准备亲和捕获装置16
<ol>
	<li>将硅氮化物E芯片在15&#160;ml丙酮中孵育2分钟，随后在15&#160;ml甲醇&#160;中孵育2分钟，以清洁芯片（图&#160;1A）。在层流通风条件下使芯片自然干燥。</li>
	<li>将干燥后的芯片置于加热搅拌板上（不搅拌），在150 °C下孵育1.5小时，然后冷却至室温后再使用。</li>
	<li>使用汉密尔顿注射器在小玻璃管中配制脂质混合物，其中包含25%氯仿、55% DLPC（1,2-二月桂酰基-磷脂酰胆碱）氯仿溶液（1 mg/ml）和20% Ni-NTA脂质（1,2-二油酰基-亚氨基二乙酸-琥珀酰-镍盐）氯仿溶液（1 mg/ml），总体积为40 μl。</li>
	<li>在湿润的培养皿中，将1 μl该混合物滴加至Parafilm表面的每滴15 μl Milli-Q水中（图&#160;1B）。将样品在冰上孵育至少60分钟。</li>
</ol>
2. 捕获大分子17
<ol>
	<li>将带有150&#160;nm集成垫片的E芯片置于单层样品上方，孵育1 min（图&#160;1C）。</li>
	<li>轻轻将芯片从样品上提起，加入3 μl His标签蛋白A。室温孵育1 min（图&#160;1D）。</li>
	<li>用Whatman #1滤纸吸去多余的液滴，立即加入3 μl抗体溶液。室温孵育1 min。</li>
	<li>使用Hamilton注射器除去多余的溶液，立即加入1 μl&#160;缓冲液中的轮状病毒DLPs（0.1 mg/ml），缓冲液组成为50 mM HEPES（pH 7.5）、150 mM NaCl、10 mM MgCl2和10 mM CaCl2。室温孵育至少2 min。DLPs的制备方法此前已有描述18。</li>
</ol>
3. 组装微流控芯片并加样 原位 样品台
<ol>
	<li>将含有病毒样本的湿态E芯片装入微流控样本 holder 的尖端。对另一片平的E芯片进行辉光放电处理1分钟，然后将其加载到间隔芯片的上方（图&#160;2，图示1-5）。</li>
	<li>或者，为了增强生物大分子的对比度，在将第二片E芯片放置于湿态样本之上前，可在样本中加入重金属染色剂（例如&#160;0.2% 甲酸铀酰）。然而，在添加对比度增强试剂之前，需先用Milli-Q水清洗含有样本的E芯片。</li>
	<li>将整个组件夹紧形成一个密封腔体，并通过3个黄铜螺丝在holder内进行机械固定（图&#160;2，图示6-8）。</li>
	<li>组装完成后，在将holder放入透射电子显微镜（TEM）之前，使用涡轮分子泵驱动的无油抽气站将holder尖端抽真空至10-6 Torr。</li>
</ol>
4. 使用透射电子显微镜在液体中成像
<ol>
	<li>将&#160;原位样品台装入配备LaB6灯丝、工作电压为120 kV的透射电子显微镜（FEI公司）中。</li>
	<li>开启透射电镜灯丝，并使用摇摆（wobbler）功能在镜筒内将样品从-15°至+15°来回倾斜，以调节显微镜载物台相对于样品的同心高度。该步骤通过在z方向上调节载物台，以补偿液体腔室的适当厚度，同时确保在记录图像时使用准确的放大倍数。</li>
	<li>首先在微流控腔室的边缘和角落区域记录图像。这些区域通常含有最薄的溶液。使用CCD相机在低剂量条件下（1–3 电子/Å2）记录样品图像，选用6,000X至30,000X的标称放大倍数。</li>
	<li>通过在流体腔室边缘聚焦来确定合适的离焦值。在30,000X放大倍数下成像时，采用-1.5 μm的离焦值。若遇到较厚的溶液，或在样品制备过程中未使用对比剂，则应使用-2至-4 μm范围内的更高离焦值。</li>
	<li>为确保在整个实验过程中溶液始终被封闭在微流控腔室内，需聚焦电子束直至装置内的液体中形成气泡。</li>
</ol>

<ol><li>Zhou, Z. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+atomic+resolution+structural+determination+by+single-particle+cryo-electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Towards atomic resolution structural determination by single-particle cryo-electron microscopy.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 18, 218-228 (2008).</li>
<li>Wolf, M., Garcea, R. L., Grigorieff, N., Harrison, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subunit+interactions+in+bovine+papillomavirus%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Subunit interactions in bovine papillomavirus.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 6298-6303 (2010).</li>
<li>Dubochet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-electron+microscopy+of+vitrified+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Q.+Rev.+Biophys%22%5BJournal%5D)">Cryo-electron microscopy of vitrified specimens.</a> Q. Rev. Biophys. 21, 129-228 (1988).</li>
<li>Unwin, P. N., Henderson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+structure+determination+by+electron+microscopy+of+unstained+crystalline+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular structure determination by electron microscopy of unstained crystalline specimens.</a> J. Mol. Biol. 94, 425-440 (1975).</li>
<li>Ohi, M., Li, Y., Cheng, Y., Walz, T. Negative Staining and Image Classification - Powerful Tools in Modern Electron Microscopy. Biol. Proced. Online. 6, 23-34 (2004).</li>
<li>Adrian, M., Dubochet, J., Fuller, S. D., Harris, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-negative+staining%5BTitle%5D)+AND+%22Micron%22%5BJournal%5D)">Cryo-negative staining.</a> Micron. 29, 145-160 (1998).</li>
<li>Parsons, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+wet+specimens+in+electron+microscopy.+Improved+environmental+chambers+make+it+possible+to+examine+wet+specimens+easily%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structure of wet specimens in electron microscopy. Improved environmental chambers make it possible to examine wet specimens easily.</a> Science. 186, 407-414 (1974).</li>
<li>Parsons, D. F., Matricardi, V. R., Moretz, R. C., Turner, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscopy+and+diffraction+of+wet+unstained+and+unfixed+biological+objects%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Biol.+Med.+Phys%22%5BJournal%5D)">Electron microscopy and diffraction of wet unstained and unfixed biological objects.</a> Adv. Biol. Med. Phys. 15, 161-270 (1974).</li>
<li>Hui, S. W., Parsons, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+diffraction+of+wet+biological+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Electron diffraction of wet biological membranes.</a> Science. 184, 77-78 (1974).</li>
<li>Hui, S. W., Parsons, D. F., Cowden, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+diffraction+of+wet+phospholipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Electron diffraction of wet phospholipid bilayers.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 71, 5068-5072 (1974).</li>
<li>Ring, E. A., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+system+for+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc.+Microanal%22%5BJournal%5D)">Microfluidic system for transmission electron microscopy.</a> Microsc. Microanal. 16, 622-629 (2010).</li>
<li>Dukes, M. J., Ramachandra, R., Baudoin, J. P., Gray Jerome, W., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+locations+of+gold-labeled+proteins+in+a+whole+mount+eukaryotic+cell+obtained+with+3nm+precision+using+aberration-corrected+scanning+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional locations of gold-labeled proteins in a whole mount eukaryotic cell obtained with 3nm precision using aberration-corrected scanning transmission electron microscopy.</a> J. Struct. Biol. 174, 552-562 (2011).</li>
<li>Yuk, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+EM+of+colloidal+nanocrystal+growth+using+graphene+liquid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">High-resolution EM of colloidal nanocrystal growth using graphene liquid cells.</a> Science. 336, 61-64 (2012).</li>
<li>Peckys, D. B., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+gold+nanoparticle+uptake+in+live+cells+with+liquid+scanning+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Visualizing gold nanoparticle uptake in live cells with liquid scanning transmission electron microscopy.</a> Nano Lett. 11, 1733-1738 (2011).</li>
<li>Klein, K. L., Anderson, I. M., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmission+electron+microscopy+with+a+liquid+flow+cell%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">Transmission electron microscopy with a liquid flow cell.</a> J. Microsc. 242, 117-123 (2011).</li>
<li>Degen, K., Dukes, M., Tanner, J. R., Kelly, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+affinity+capture+devices-a+nanoscale+purification+platform+for+biological+in+situ+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Rsc.+Adv%22%5BJournal%5D)">The development of affinity capture devices-a nanoscale purification platform for biological in situ transmission electron microscopy.</a> Rsc. Adv. 2, 2408-2412 (2012).</li>
<li>Gilmore, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+viral+assemblies+in+a+nanoscale+biosphere%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Visualizing viral assemblies in a nanoscale biosphere.</a> Lab Chip. 13, 216-219 (2013).</li>
<li>Bican, P., Cohen, J., Charpilienne, A., Scherrer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+characterization+of+bovine+rotavirus+cores%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Purification and characterization of bovine rotavirus cores.</a> J. Virol. 43, 1113-1117 (1982).</li>
<li>Frank, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SPIDER+and+WEB%3A+processing+and+visualization+of+images+in+3D+electron+microscopy+and+related+fields%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">SPIDER and WEB: processing and visualization of images in 3D electron microscopy and related fields.</a> J. Struct. Biol. 116, 190-199 (1996).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near-atomic+resolution+using+electron+cryomicroscopy+and+single-particle+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Near-atomic resolution using electron cryomicroscopy and single-particle reconstruction.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 1867-1872 (2008).</li>
<li>Scheres, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Bayesian+view+on+cryo-EM+structure+determination%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">A Bayesian view on cryo-EM structure determination.</a> J. Mol. Biol. 415, 406-418 (2012).</li>
<li>Kelly, D. F., Abeyrathne, P. D., Dukovski, D., Walz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Affinity+Grid%3A+a+pre-fabricated+EM+grid+for+monolayer+purification%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The Affinity Grid: a pre-fabricated EM grid for monolayer purification.</a> J. Mol. Biol. 382, 423-433 (2008).</li>
</ol>

作者 Madeline J. Dukes 是 Protochips, Inc. 的员工。

在本研究中，我们采用亲和捕获方法将轮状病毒双层颗粒（DLPs）固定于微流控平台，从而实现了 原位 在液体微环境中的大分子复合物成像。该 捕获方法相较于其他微流控成像技术具有重要意义 因为它能将生物样本定位到成像窗口，从而避免在液体中记录图像时出现的大范围扩散问题。然而，其中一个 我们方案中最关键的步骤 涉及将脂质生物膜转移至微芯片表面。若脂质单层未能均匀铺展在网格上，则会导致实验失败。转移步骤不佳的一个表现是流体芯片上结合的病毒组装颗粒极少甚至没有。转移步骤的一个限制因素是脂质层流动性相关的热稳定性。若经评估发现液滴铺展不均，表明转移步骤不充分，此时应将脂质层在冰上或无振动的低温环境中孵育更长时间。此外，培养皿必须用Parafilm充分密封，以维持适当的湿度。
微芯片样品中病毒复合物或衔接蛋白过量可能导致颗粒过度聚集。这是该实验方案中的一个局限性，但可轻松控制。为尽量减少聚集效应，可缩短蛋白因子的孵育时间，或对病毒样品进行进一步稀释。若检测到非特异性蛋白过量，可在缓冲液中加入新鲜配制的咪唑（约50 m...

<a href="https://app.jove.com/t/6605">This corrects</a> the article <a href="https://dx.doi.org/10.3791/50936">10.3791/50936</a>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/50936">In situ TEM of Biological Assemblies in Liquid</a>. The Representative Results and References sections were&#160;updated.

Erratum: In situ TEM of Biological Assemblies in Liquid

生物学家和工程师的共同目标是理解分子机器的内部工作机制。透射电子显微镜（TEM）是用于在接近原子分辨率下观察这些复杂细节的理想仪器1-2。为了维持透射电子显微镜的高真空系统，生物样本通常被包埋在玻璃态冰薄层3、糖类4、重金属盐5或其某种组合中6。因此，包埋样本的图像可能仅能揭示动态过程的有限快照。
帕森斯（Parsons）及其同事曾利用差分抽气腔室，尝试在环境液体腔中保持生物样本的水合状态。未染色的过氧化氢酶晶体在水合状态下成功获得了分辨率为3 Å的电子衍射图谱7-8。此外，还可观察人红细胞水合膜中的相分离脂质区域9-10。然而，由于液体扩散引起的样本运动及其对电子束的干扰，导致分辨率严重下降，因此直到最近之前，尚未再开展针对生物样本的进一步实验。
新开发的微流控样品 holder 采用半导体微芯片构建微尺度环境腔室。这些装置可在样品置于透射电子显微镜（TEM）镜筒内的同时，使其保持在液态环境中11-12。这一透射电镜成像技术的突破，首次使研究人员能够观察到分子水平上的动态过程13。我们将这种新兴技术模式称为“原位分子显微术”（in situ molecular microscopy），因为实验现在可以直接在电镜镜筒“内部”进行14-15。该方法的总体目标是在液态环境中对生物大分子组装体进行成像，以纳米级分辨率观察其动态行为。该技术的设计理念在于记录实时观测结果，并探究溶液中生物分子机器的新特性。这一方法拓展了透射电子显微镜在细胞与分子生物学领域更广泛的应用前景12-16。
在本视频文章中，我们介绍了一种组装和使用市售微流控样品 holder 的全面方案。这些专用的 holder 利用带有集成式间隔层的氮化硅微芯片，形成可封闭微量液体的液相腔室。微芯片上刻蚀有薄而透明的窗口，用于成像12。我们展示了如何正确使用微流控 holder，通过透射电子显微镜（TEM）在液相环境中观察灵长类轮状病毒双层颗粒（DLPs）。为了确保生物组装体（如 DLPs）在成像过程中不会迅速扩散至较大距离，我们采用亲和捕获（Affinity Capture）方法将其固定在微流控腔室的表面16。这种分子捕获步骤在液相生物样品成像方面具有相较于其他技术的显著优势，因为它能够获取可用于后续处理流程的图像。将该捕获步骤与微流控成像结合使用，是本实验流程的独特之处17。使用透射电镜（TEM）或微流控成像腔室进行结构生物学研究的读者，若最终目标是实现分子水平的动态观察，可考虑采用亲和捕获技术。

<table><tbody><tr><td>E-chips，间隔芯片</td><td>Protochips, Inc.</td><td>EPB-52TBD</td><td>400 &amp;mu;m × 50 &amp;mu;m 窗口</td></tr><tr><td>E-chip，顶芯片</td><td>Protochips, Inc.</td><td>EPT-45W</td><td>400 &amp;mu;m × 50 &amp;mu;m 窗口</td></tr><tr><td>Ni-NTA 脂质</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>790404P</td><td>粉末形态</td></tr><tr><td>DLPC (12:0) 脂质</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850335P</td><td>粉末形态</td></tr><tr><td>容量瓶&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>20-812A；20-812C</td><td>1 ml；5 ml&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Hamilton 注射器</td><td>Hamilton Co.</td><td>80300，80400</td><td>1–10 &amp;mu;l；1–25 &amp;mu;l</td></tr><tr><td>Whatman #1 滤纸</td><td>Whatman</td><td>1001 090</td><td>100 张，90 mm</td></tr><tr><td>玻璃培养皿</td><td>Corning</td><td>70165-101</td><td>100 mm × 15 mm</td></tr><tr><td>玻璃巴斯德吸管</td><td>VWR</td><td>14673-010</td><td>14673-010</td></tr><tr><td>玻璃培养管</td><td>VWR</td><td>47729-566</td><td>6 mm × 50 mm</td></tr><tr><td>丙酮</td><td>Fisher Scientific</td><td>A11-1</td><td>1 L</td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Fisher Scientific</td><td>A412-1</td><td>1 L</td></tr><tr><td>氯仿&amp;nbsp;</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>12550</td><td>100 ml&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>带 His 标签的 Protein A</td><td>Abcam, Inc.</td><td>ab52953</td><td>10 mg</td></tr><tr><td>Milli-Q 超纯水系统</td><td>EMD Millipore Corp.</td><td>Z00QSV001</td><td>超纯水</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP310-500</td><td>500 g</td></tr><tr><td>设备&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Poseidon &lt;em&gt;原位&lt;/em&gt;样品台</td><td>Protochips, Inc.</td><td></td><td>&amp;nbsp;与 FEI 兼容</td></tr><tr><td>FEI Spirit BioTwin 透射电子显微镜（TEM）</td><td>FEI Co.</td><td></td><td>120 kV</td></tr><tr><td>Eagle 2k HS CCD 相机</td><td>FEI Co.</td><td></td><td>在 30,000× 下采样分辨率为 10&amp;nbsp;&amp;Aring;/像素</td></tr><tr><td>Gatan 655 干泵站</td><td>Gatan, Inc.</td><td></td><td>将样品台尖端抽至 10&lt;sup&gt;-6&amp;nbsp;&lt;/sup&gt; 范围</td></tr><tr><td>PELCO easiGlow 电晕放电仪</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td></td><td>&amp;nbsp;负极性模式</td></tr><tr><td>Isotemp 加热搅拌器</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>加热至 150 &amp;ordm;C，持续 1.5 小时</td></tr></tbody></table>

原位 液相中生物组装体的透射电子显微镜观察

In situ TEM of Biological Assemblies in Liquid

研究人员经常使用透射电子显微镜（TEM）来观察生物实体并评估新材料。本文介绍这些仪器的另一项应用——在液体环境中观察病毒组装体。这种令人振奋且新颖的生物结构可视化方法利用了 recently developed 基于微流控技术的样品台。我们的视频文章展示了如何组装和使用微流控样品台，在透射电子显微镜中对液体样品进行成像。具体而言，我们以灵长类轮状病毒双层颗粒（DLPs）作为模型系统。我们还描述了用亲和生物膜包被液体腔室表面的步骤，以将 DLPs 固定在观察窗口上。这使得我们能够以适用于三维结构解析的方式对组装体进行成像。因此，本文首次展示了亚病毒颗粒在天然液体环境中的形态。

使用经过辉光放电处理的E芯片在液体中观察双层颗粒（DLPs）的代表性图像显示，在给定视野范围内DLPs数量较少（图3A），这可能是由于扩散作用所致，相比之下，通过亲和捕获装置富集的DLPs更为集中（图3B）。在成像腔室中加入甲酸铀酰可增强样品的对比度，从而提高溶液中单个DLPs的可见性（图3C，上图）。更高的对比度有利于后续的图像处理，例如颗粒平均化（图3C，下图）和三维重构分析（图3C，插图），如先前所述17。简而言之，在进行三维重构时，我们使用SPIDER软件包19选取了600个DLP颗粒。所选颗粒基于一个初始的轮状病毒DLP模型进行优化20，该模型被滤波至80 Å分辨率。我们采用RELION软件包21计算得到一个分辨率约为25 Å的三维重构图。我们的三维密度图与初始模型以及使用相同参数和DLP样品计算出的独立冷冻电镜三维重构结果均具有良好一致性17。</p...

本文介绍了一种利用透射电子显微镜在液体环境中以纳米级分辨率对病毒复合物进行成像的方法。

研究人员经常使用透射电子显微镜（TEMs）来观察生物实体并评估新材料。本文中，我们描述了一种……

本实验的总体目标是对生物组装体和液体进行成像，以在纳米级分辨率下观察其动态行为。该目标通过以下步骤实现：首先制备具有亲和捕获表面的氮化硅微芯片，使大分子能够固定在微芯片表面，从而防止其在液体中扩散；第二步是将生物样品加载到微芯片上，以富集轮状病毒颗粒。接下来，用对比剂清洗含有病毒颗粒的微芯片，然后将其装载到微流控样品 holder 上。最后一步是安装顶部芯片和面板，以形成封闭的容器，包裹住液体样品。最终，在透射电子显微镜（TEM）中记录图像，以揭示液体微腔内病毒样品的特征。该技术相较于其他现有方法在检测液体中微粒时的主要优势在于，由于微芯片上涂覆了亲和捕获层，样品在成像过程中不会在较大距离上迅速扩散。该技术的应用前景包括对基于纳米颗粒的药物递送系统或针对病毒病原体的疫苗开发进行实时评估，因为我们首次能够观察到动态纳米机器在溶液中的变化过程。尽管该方法可为生物大分子的可视化提供深入见解，但也可应用于其他系统，例如电化学应用。该方法的可视化演示至关重要，因为对于初学者而言，制备亲和捕获装置以及装载微流控样本载体可能存在操作困难。首先，将氮化硅芯片置于15毫升丙酮中孵育2分钟，随后再将其置于15毫升甲醇中孵育2分钟，以完成清洗。为去除制造过程中残留的光刻胶，将芯片置于层流气流下快速干燥。干燥后，将芯片置于加热至150摄氏度的加热板上孵育1.5小时，随后使其冷却至室温。接下来，使用汉密尔顿注射器在小型玻璃管中配制脂质混合物。首先加入25%氯仿，然后加入55%氯仿溶液中的DLPC（1毫克/毫升）。最后，使用另一支注射器加入20%氯仿溶液中的镍NTA脂质（1毫克/毫升），总体积为40微升。然后剪取一块石蜡膜，使其能够放入直径为100毫米、高度为15毫米的玻璃培养皿内，在石蜡膜表面加入九滴、每滴15微升的超纯水。将1微升脂质混合物等分试样分别加至每滴15微升的超纯水上，并将培养皿置于潮湿环境中的冰上，静置至少60分钟，使脂质在液滴表面形成单分子层。将带有150纳米集成垫片的EIP放置在单分子层液滴上方，共同孵育1分钟。接下来，轻轻将芯片从液滴上取下，并直接向芯片表面加入3微升浓度为0.01毫克/毫升的组氨酸标签蛋白A。在室温下孵育芯片与蛋白A一分钟。然后用沃特曼一号滤纸吸去多余液体，并立即加入3微升浓度为0.01毫克/毫升的IgG抗体溶液。将样品在室温下孵育一分钟。接着，使用 Hamilton 注射器去除多余的溶液，并立即加入一微升轮状病毒双层颗粒，其浓度为每毫升 0.1 毫克，溶于 HEPES 缓冲液中，然后将芯片在室温下孵育至少两分钟。通过辉光放电处理一分钟制备第二块平整的载网，使用 ST. Stereoscope 组装微流控室，首先将样品室的端口用 O 形圈密封。然后将含有病毒样本的湿电镜载网（E IP）装入微流控样品 holder 的尖端。接着，将经过辉光放电处理

in-situ-tem-of-biological-assemblies-in-liquid

Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

就地 液体生物组件的 TEM

我们开发了一种独立的液体池，可在透射电子显微镜中实现液体环境下的成像。该技术能够以亚纳米分辨率实时揭示纳米颗粒在液体中的动态过程。...

利用液体池透射电子显微技术揭示材料在液体中的动态过程

本文介绍了一种用于培养生物膜的方法 原位 飞行时间二次离子质谱结合微流控反应器——液体-真空界面分析系统，用于样品水合状态下的化学成像。 Shewanella oneidensis...

原位表征Shewanella oneidensis MR1生物膜的SALVI与飞行时间二次离子质谱技术

我们介绍了一种对去离子水中的勃姆石颗粒进行实时成像与元素组成分析的方法 原位...

原位 使用液相扫描电镜表征水中的勃姆石颗粒

本文介绍了利用液体池透射电子显微镜实时观察自组装过程的实验方案。...

液相透射电子显微技术用于追踪纳米颗粒的自组装过程

原位显微镜技术用于生物过程中单细胞形态的实时测定

用于制备石墨烯支撑的微孔液体池的方案 原位 氯金酸中金纳米晶体的电子显微镜观察4...

用于制备石墨烯支撑的微孔液体池 原位 透射电子显微镜技术

本文介绍了一种进行原位透射电子显微镜（in situ...

执行 原位 透射电子显微镜中的封闭腔体气体反应

本方案介绍了配备光照系统的透射电子显微镜（TEM）的改造方法、液体样品池的制备以及 原位 细菌细胞与光敏剂在光照下相互作用的透射电子显微镜观察。同时讨论了样品制备方法、电子束损伤及成像技术。...

光诱导 原位 透射电子显微镜观察液体-软物质相互作用

本文描述了制备适用于在纳米尺度下通过透射电子显微镜进行液相电镜和冷冻电镜分析的病毒组装体的实验方案。...

在液体和冰中推进病毒组装的高分辨率成像

冷冻扫描透射电子显微镜断层成像技术提供了一种无需包埋、切片或其他侵入性制备步骤即可观察完整细胞中细胞器的方法。目前该技术获得的三维分辨率可达数纳米，视场范围为数微米，可观察样品厚度约为 1...

细胞器的可视化 原位 通过冷冻扫描透射电子显微镜断层成像技术

学习利用透射电子显微镜在液体环境中对轮状病毒复合物进行纳米级分辨率成像的方法。通过亲和捕获表面固定生物大分子，观察其动态行为，为病毒结构与疫苗研发提供新见解。

原位液相中生物组装体的透射电子显微镜观察

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原位 液相中生物组装体的透射电子显微镜观察

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