Name: 使用八臂径向水迷宫评估新生儿脑损伤后的工作记忆和参考记忆 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-04T19:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: 了解如何使用八臂径向水迷宫同时评估工作记忆和参考记忆。该方法利用迷宫外线索定位隐藏平台，克服了传统陆地迷宫的局限性，适用于神经科学和认知功能研究。

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作者谨此感谢 William Martin 及罗德岛学院艺术系在迷宫制作方面提供的协助。同时感谢罗德岛学院的学生 Katrina Feyerherm、Molly La Rue 和 Nick Lafond 在八臂水迷宫实验受试者测试工作中所做出的贡献。本研究得到了罗德岛生物医学研究卓越创意网络（RIINBRE）以及美国国立卫生研究院研究资源中心（资助号：P20 RR16457-12）的资助。此外，本研究还获得了美国国立卫生研究院尤妮斯·肯尼迪·施莱佛儿童健康与人类发展国家研究所（Award Number R15HD077544）的资助支持。

所有实验程序均经罗德岛学院机构动物照护与使用委员会批准，并遵循美国国立卫生研究院《实验动物照护与使用指南》。
1. 迷宫配置
<ol>
	<li>在迷宫周围放置清晰、静止且醒目的外部空间线索（如绘制的图形、家具或其他固定的房间特征）。 
	注意：实验期间，所有外部空间线索必须保持在相同位置不变。</li>
	<li>将放射状臂迷宫的中心枢纽和臂部置于一个塑料容器内（示例见设备表）。 
	注意：本实验方案所用迷宫由八个可拆卸的不锈钢臂组成，这些臂连接在八个中央支撑结构上，后者固定于一个已涂成黑色的圆形不锈钢基座上（结构示意图及相应尺寸见图1）。图1所示塑料容器的内径为122 cm，高度为60 cm。</li>
	<li>向容器中注入温度为室温（22–26 °C）的温水7。</li>
	<li>在八个臂中的四个臂末端，将平台置于水面以下1 cm处。 
	注意1：对每个受试动物而言，平台位置在整个测试期间保持固定。无论采用何种配置，均应避免在超过两个相邻臂中设置平台（即相邻臂中最多只能有两个平台）。起始臂中不得放置平台。 
	注意2：隐藏平台必须喷涂成与迷宫插件相同的颜色，以与迷宫背景融为一体。</li>
</ol>
2. 转运受试者进行测试
<ol>
	<li>按照指定的测试顺序，将实验动物从动物饲养室转移至测试房间。 
	注意：应将动物放入不透明的笼子中，以帮助减少预期性应激，并防止其观察到测试房间内的环境线索。</li>
	<li>进入测试房间后，将第1组的所有不透明笼子按测试顺序放置在准备台或桌面上。 
	注意：在大规模研究中（例如&#160;30只动物），可将动物分为若干测试组（例如每组10只，共3组）进行操作。具体分组方式取决于测试房间的大小以及动物转运的可行性。</li>
</ol>
3. 记录迷宫臂进入次数的数字平板电脑操作方案
<ol>
	<li>在数字平板电脑上打开一个PDF书写程序。</li>
	<li>导入第1组中所有受试者的预保存数据记录模板。 
	注意：每个记录模板应预先保存，并标注特定的受试者编号和试验编号（例如&#160;受试者1_试验1，受试者1_试验2， 等等。) 每个受试者共使用四个模板（试验1-4）。模板应包含迷宫及平台位置的空白示意图，以及用于记录受试者编号、试验编号、测试日期、逃生平台使用情况和试验潜伏期的区域（参见 图2).</li>
	<li>打开第一个受试者首次试验的模板。 
	注意：对于无法使用平板电脑或基于平板的笔记程序的研究人员，该系统也可配合纸质模板使用。</li>
</ol>
4. 放射臂水迷宫测试
<ol>
	<li>若动物为成对饲养，则在测试开始前将受试动物分开放置。将第一位受试动物转移至一个独立的不透明保温笼中。 
	注意：应使用加热垫将笼子预热至 37 °C，以在测试间期维持动物体温。</li>
	<li>在每位受试动物首次测试前，确认其编号与数据记录表上的编号一致，并确保八臂水迷宫中的平台已正确放置。</li>
	<li>将受试动物放入起始臂，使其面向迷宫壁，并启动计时器。 
	注意：本方案设计为由两名实验人员协作完成，一人负责记录数据，另一人负责处理动物。在此协作过程中，实验人员之间的沟通至关重要。每次试验前，必须确认开始时间、动物编号以及平台的正确位置。</li>
	<li>每次试验过程中，实验人员应固定在实验室内指定位置，以保持线索的一致性。 
	注意：实验过程中应避免引入明显的气味线索（例如&#160;香水），且实验人员每天应穿着相同的衣物（如实验服），以维持线索一致性。</li>
	<li>通过在数字平板的数据记录模板上对应臂的位置做标记，记录动物进入每个臂的行为。 
	注意：当动物的双肩穿过臂的开口平面时，记为一次有效进入。</li>
	<li>允许动物最多用 120 秒寻找四个平台之一。一旦动物到达平台，立即停止计时，本次试验结束。 
	注意：为保持一致性，当动物的前爪完全置于平台上时，视为已成功到达目标。</li>
	<li>若动物在 120 秒内未能找到平台，则小心引导其至最近的平台，并让其在平台上停留 10 秒后再移走，以确保动物能够感知目标位置。</li>
	<li>仅在第一天，在每次试验结束后，让动物在平台上停留 10 秒，以便其参考空间线索。</li>
	<li>试验结束后，通过轻轻托起动物身体的方式将其从平台上移走。</li>
	<li>开始计算 90 秒的试验间间隔时间。</li>
	<li>将动物放回个体饲养笼，并置于恒温垫上。</li>
	<li>在数据记录模板上圈出动物用于逃生的特定平台位置以作记录。</li>
	<li>在此间隔期间，移除上一次试验中动物所使用的逃生平台。</li>
	<li>打开下一次试验的记录模板，并在模板上用 X 标记此前试验中已被使用并移除的所有平台位置。 
	注意：在下一次试验开始前，准确标记所有缺失的平台，对于定义错误类型（例如&#160;参考记忆和/或工作记忆正确性）至关重要。</li>
	<li>在开始下一次试验前，确认动物编号、试验序号以及剩余平台的位置。</li>
	<li>90 秒&#160;的试验间间隔结束后，将动物放入起始臂，使其面向迷宫壁，并启动下一次试验的计时器。</li>
	<li>重复此过程进行第 2 至第 4 次试验，每次试验后移除动物所到达的逃生平台，并在试验过程中及结束后正确标记模板（即&#160;在已移除的平台上标记 X，记录进入的臂，并圈出用于逃生的平台）。</li>
	<li>完成一位受试动物的全部四次试验后，将逃生平台重新放回迷宫中相应的位置，并对下一位动物重复测试流程（测试步骤 4.1–4.17）。</li>
	<li>第一组测试完成后，将数据记录表导出至当日测试文件夹（例如&#160;第 1 天），并保存至文件存储系统。 
	注意：在开始下一组测试前，应提前导出数据记录表，以最大限度降低数据丢失的风险。</li>
	<li>对每组动物重复上述步骤（测试步骤 2.1–4.19）。</li>
</ol>
5. 因变量
<ol>
	<li>每次试验中，统计进入此前曾放置过平台的任一臂的首次和重复进入次数。数据记录表上平台位置标有“X”以作提示。此类错误称为工作记忆正确性错误。 
	注意：由于工作记忆正确性错误依赖于记住此前已用于逃生的平台位置并避免进入该臂，因此在第一次试验中不可能出现工作记忆正确性错误。</li>
	<li>每次试验中，统计进入从未放置过平台的任一臂的首次进入次数。此类错误称为参考记忆错误。</li>
	<li>每次试验中，统计进入从未放置过平台的任一臂的重复进入次数。此类错误称为工作记忆错误性错误。</li>
	<li>记录每次试验中到达平台的潜伏期。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在竞争性财务利益。

八臂放射状水迷宫范式已在本实验室及其它研究中成功用于评估有或无新生儿脑损伤大鼠的工作记忆和参考记忆功能5-7,18-20。在当前的实验范式中，每次试验后移除逃生平台会增加后续试验中的工作记忆负荷（受试动物的逃生选择减少）。因此，在第四次试验时，仅剩一个平台，工作记忆负荷达到最高，动物重新进入先前访问过的臂的概率也随之增加（即发生工作记忆错误）。由于逃生臂在整个测试期间保持不变，通过记录首次进入从未设置平台的臂的情况，可方便地分析参考记忆。该范式的其他显著优势包括：无需食物剥夺、潜在干扰性气味线索的风险较低，以及与传统的陆基迷宫不同，无需进行预训练5-7,18-20。
关于测试时长（天数），研究人员在确定获得最佳结果所需的测试天数之前，应充分了解所评估动物物种或品系的认知能力限制和相关需求。与陆地迷宫类似，幼年大鼠、用于神经疾病模型的大鼠以及小鼠在八臂放射状水迷宫中的表现达到渐近稳定水平所需的时间，可能比成年或正常大鼠更长。本方案中提供的数据采用了为期11天的测试。尽管当前数据已观察到显著效应，但我们仍建议将测试延长至15至20天，以便在研...

工作记忆（WM）对应于目标导向行为过程中表征物体或位置所需的关键认知领域1。相比之下，参考记忆（RM）则用于对这些物体或位置进行时间上稳定的表征。长期以来，啮齿类动物的工作记忆与参考记忆通常通过基于陆地的八臂迷宫范式进行评估2,3。然而，这些任务通常需要预先训练，因为大鼠并不倾向于自发地在迷宫中奔跑，这会显著增加完成实验所需的时间，并可能干扰对时间敏感的纵向实验设计。基于陆地的八臂迷宫的其他局限性还包括需要食物剥夺，以及难以控制每次试验后留在迷宫上的气味线索变化。许多上述局限性已通过使用莫里斯水迷宫范式得以克服4，但历史上这类设计主要用于测试参考记忆和空间学习（例外情况5-9）。八臂放射状水迷宫是八臂放射状陆地迷宫的一种改良版本，已被用于评估大鼠和小鼠的参考记忆与工作记忆5-7。与传统的陆地迷宫相比，八臂放射状水迷宫无需食物剥夺，最大限度减少了潜在的干扰性气味线索，并利用实验动物逃离水环境的动机，作为一种有效手段，可在无需预先训练的情况下同时评估工作记忆与参考记忆的学习能力5-7。
该实验范式的一个应用是检测新生儿脑损伤后的工作记忆缺陷。人类研究表明，有脑损伤风险的早产儿在后期生活中会表现出工作记忆缺陷10,11。通过在出生后早期诱导缺氧/缺血（HI），可在啮齿类动物中建立新生儿脑损伤的模型12-15。更重要的是，使用放射臂水迷宫可在啮齿类动物中重现高危婴儿中发现的空间学习和工作记忆缺陷，使其成为研究此类功能障碍的可靠模型8,9。八臂放射状水迷宫还可同时量化参考记忆和工作记忆，因此非常适合在时间敏感的模型中（i.e.&#160;在特定发育窗口期间）或在交叉平衡的纵向设计中，对脑损伤与非脑损伤受试者进行比较。
本方案中，我们描述了使用八臂放射状水迷宫（见图1）的测试流程，并提供了具有和不具有新生儿缺氧缺血性脑损伤的大鼠示例数据。缺氧缺血（HI）模型在出生后第7天通过结扎右侧颈总动脉并暴露于8%氧气环境中120分钟诱导建立。该手术方法已被广泛用于模拟早产及相关新生儿脑损伤的病理过程（详见12,13,16,17）。我们证明，放射状水迷宫范式能够揭示新生儿期HI损伤后参考记忆和工作记忆能力的缺陷。在本方案中，参考记忆通过八臂放射状水迷宫中的四个特定臂进行评估，这些臂在整个测试过程中相对于迷宫外线索保持固定位置。这些臂中从不设置逃生平台，因此动物进入这些臂的次数反映了参考记忆表现差以及长期学习能力的缺陷。其余四个臂在每天测试开始时均设有逃生平台，但每当动物成功进入某一臂并逃离水面后，该臂的平台即被移除5-7。这要求动物记住在当天连续四次试验中已进入过的臂，随着每个平台被移除，工作记忆的负荷逐步增加。工作记忆通过分析动物在同一天测试中重复进入此前用于逃生的臂，或重复进入参考记忆臂的情况进行评估。此外，该设计利用迷宫外线索来定位逃生平台，反映依赖海马的空间学习能力。这种评估工作记忆与参考记忆错误的方法最初由Jarrard et al.18提出，此后已被广泛用于评估与衰老相关的神经功能障碍、学习障碍以及经激素干预后的啮齿类动物模型5,6,7,19,20。
该实验范式的主要目的是评估参考记忆和工作记忆，因此，八臂放射状水迷宫设计不应仅限于测试发育性脑损伤引起的功能缺陷。相反，以往采用该范式的研究表明，可在多种实验背景下利用多种啮齿类动物模型评估学习与记忆相关病理5,6,7,18,19,20。

<table><tbody><tr><td>塑料浴槽</td><td>Gototanks http://www.gototanks.com</td><td>ARM-19455</td><td>尺寸可根据测试物种或各实验室具体需求而调整。</td></tr><tr><td>iPad 或其他数码平板设备</td><td>Apple Inc.</td><td>N/A</td><td>http://www.apple.com</td></tr><tr><td>Notability 或其他笔记应用程序</td><td>Gingerlabs</td><td>N/A</td><td> &lt;p&gt;http://www.gingerlabs.com&lt;/p&gt; &lt;p&gt;数码 PDF 写入器或笔记软件&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td>数码计时器</td><td>任意品牌</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Deltaphase 恒温加热垫</td><td>Braintree Scientific</td><td>ASS7D</td><td>http://www.braintreesci.com/</td></tr><tr><td>不锈钢迷宫</td><td>实验室自制</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

使用八臂放射状水迷宫评估新生儿脑损伤后的 工作记忆与参考记忆

Use of an Eight-arm Radial Water Maze to Assess Working and Reference Memory Following Neonatal Brain Injury

工作记忆和参考记忆通常通过基于陆地的放射臂迷宫进行评估。&#160;然而，该范式需要预先训练、食物剥夺，且可能引入气味线索干扰。八臂放射式水迷宫旨在通过要求受试动物利用迷宫外线索定位逃生平台，同时评估参考记忆和工作记忆表现，并克服了基于陆地的放射臂迷宫设计中存在的局限性。具体而言，受试动物在每次测试当天需避免进入此前已用于逃生的臂（工作记忆），同时避免进入固定不含逃生平台的臂（参考记忆）。在单次测试会话中，重复进入此前已用于逃生（因此逃生平台已被移除）的臂，或重复进入参考记忆臂，提示存在工作记忆缺陷；而首次进入即选择参考记忆臂，则提示存在参考记忆缺陷。我们利用该迷宫比较了新生期脑损伤大鼠与假手术对照组在缺氧-缺血诱导后的表现，结果显示经过11天测试后，两组在工作记忆和参考记忆方面均存在显著缺陷。该实验方案可轻松修改，用于研究多种其他学习障碍模型。

本实验室的样本数据显示，在测试第11天，缺氧缺血（HI）动物的工作记忆错误次数显著高于假手术组（t = 2.124，p&lt;0.05，参见图3A）。到测试第11天，HI动物的参考记忆错误次数也显著多于假手术组动物（t = 2.303，p&lt;0.05，参见图3B）。工作记忆错误和参考记忆错误是指每只动物在第11天全部四次试验中累计的错误总数。这些结果支持该任务在评估新生儿脑损伤模型中工作记忆和参考记忆方面的有效性，并进一步支持该范式可用于评估其他神经行为病理模型。
<img alt="八臂放射状迷宫示意图：心理学实验装置、空间记忆测试、实验舱、标注迷宫臂编号。" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50940/50940fig1.jpg" width="600px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
<stro...

八臂放射状水迷宫通过要求受试者利用迷宫外线索定位逃生平台，可同时评估参考记忆和工作记忆表现，克服了基于陆地的放射臂迷宫设计中存在的局限性。

工作记忆与参考记忆通常通过基于陆地的放射臂迷宫进行评估。然而，该范式需要进行预训练、食物限制……

本实验的总体目标是同时量化工作记忆和参考记忆，且克服传统陆基迷宫中常见的局限性。实验开始时，将动物放入水迷宫的起始臂，使其寻找隐藏的平台。记录动物进入各个臂的次数，以及用于逃生的平台所在位置。接下来，移除动物使用的逃生平台，并重复该步骤进行另外三次试验。最后一步中，将记录的进入行为编码为工作记忆正确、工作记忆错误、参考记忆错误或工作记忆不正确错误。最终，八臂放射状水迷宫可用于评估多种动物模型的工作记忆和参考记忆。与现有的莫里斯水迷宫等方法相比，该技术的主要优势在于允许实验者同时评估工作记忆和参考记忆。放射状迷宫由八个不锈钢臂组成，连接在一个圆形基座上。将其置于装有室温水的水槽中。隐藏平台位于水面以下一厘米处。在四个臂中，需要两名实验人员。一人负责记录数据，另一人负责处理受试者。在协作过程中，实验人员之间的沟通至关重要。每次试验前，必须确认开始时间、受试者编号以及平台放置位置的正确性。使用数字书写板记录玉米植株的行号信息。打开PDF写入程序，并导入为第一组受试者预先保存的所有数据记录模板。该模板应包含迷宫及平台位置的空白示意图，以及用于记录受试者编号、试验编号、测试日期、逃生平台使用情况和试验潜伏期的填写区域。首先，将第一位测试对象转移至另一个已预热的笼子中。接着，确认平台已正确放置在八臂水迷宫中。核对测试对象的编号后，将测试对象放入起始臂，使其面朝迷宫的墙壁，并启动计时器。每次试验期间，保持在指定位置静止不动至关重要，以确保Q值在整个过程中的一致性。通过在相应手臂上做标记来记录测试结果。在记录模板中，每次标记均计为一次记录。当受试动物的肩部越过臂的开口平面时，允许受试动物最多用 120 秒的时间来寻找四个平台中的任意一个。一旦动物到达平台，立即停止计时，结束该次试验。记录动物到达平台所需的潜伏期。为了确保每次试验的一致性，当实验对象的前爪到达平台时，即视为其已抵达目标。在测试的第一天，每次试验均让实验对象在平台上停留10秒，共进行四次试验，以便实验对象能够参照空间线索进行定位。如果受试者在 120 秒内无法找到平台，请将其轻轻引导至最近的平台，并让其在平台上停留 10 秒。试验结束后，通过轻轻托起受试者身体将其从平台上移开。开始计算第 92 次试验间间隔的时间。为防止低体温，用毛巾将受试对象擦干。将受试对象放回位于温度调节垫上的单独笼具中。在数据记录模板上圈出相应的位点，以记录受试对象用于逃脱的具体平台位置。在试验间期，移除受试者在上一次试验中使用的逃生平台。打开下一次试验的模板，并用 x 标记所有此前已被受试者作为逃生平台使用并已被移除的平台。接着，确认下一次试验中各平台的放置位置。准备就绪后，将受试者放入起始臂，使其面向迷宫壁，并启动计时器。重复此过程，共进行四次试验。每次试验结束后移除逃生平台，并在每次试验过程中及结束后相应地标记模板。完成后，将逃生平台重新放回迷宫的相应臂中，并对下一位受试对象重复测试过程。第一组测试结束后，将数据记录表导出至该测试日期对应的文件夹中，以供后续分析。每次试验中，统计进入此前曾设有平台的任一臂的首次和重复进入次数。这些是工作记忆正确错误。参考记忆错误计为首次进入从未放置平台的任一臂的次数。使用八臂放射状水迷宫时，重复进入从未放置平台的任一臂的次数被视为工作记忆错误；结果显示，新生期缺氧缺血性脑损伤的啮齿类动物错误次数显著增加。与对照组动物相比，脑损伤动物的参考记忆错误也有所增加。在实施该操作时需注意，经过实验干预的动物可能需要更长时间才能掌握任务技能。这一点在工作记忆正确错误方面尤为明显，因为当以逃离水环境作为动机时，大鼠天生倾向于返回平台所在的臂。

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使用八臂放射状水迷宫评估新生儿脑损伤后的工作记忆与参考记忆

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