Name: 调查纤维素酶与基于AFM的单分子力谱受体 - 配体系统 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-20T13:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 34 s
Description: 了解基于原子力显微镜的单分子力谱技术，用于研究纤维素酶复合体中受体-配体系统的机械特性与蛋白质折叠状态。该方法为生物物理研究提供关键技术支持。

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作者感谢欧洲研究理事会向 Hermann Gaub 提供的高级资助。Michael A. Nash 感谢 Society in Science — Branco Weiss 博士后奖学金项目提供的资助。作者感谢魏茨曼科学研究所的 Edward A. Bayer、Yoav Barak 和 Daniel B. Fried 慷慨提供本研究中使用的蛋白质。作者感谢 Hermann E. Gaub、Elias M. Puchner 和 Stefan W. Stahl 提出的有益讨论。

本研究中用于探究黏连蛋白-对接蛋白相互作用的拉伸几何构型示意图见图1A。本文报道的悬臂梁和盖玻片功能化所用的蛋白质固定方案，是此前发表方法27的改进版本。蛋白质通过常规方法在E. coli中由质粒载体表达获得。这些蛋白质设计含有溶剂可及的巯基，可与马来酰亚胺化学结合，通过稳定的硫醚键将蛋白质共价连接至盖玻片表面和悬臂梁上。在CBM-黏连蛋白和木聚糖酶-对接蛋白融合蛋白中，人工引入的半胱氨酸残基均位于蛋白质的N端一侧，远离黏连蛋白-对接蛋白结合界面11。蛋白质固定过程中所用化学键合的详细示意图见图1B。
1. 样品制备
<ol>
	<li>缓冲液
	<ol>
		<li>配制含钙的 Tris 缓冲盐水（TBS）：25 mM TRIS、75 mM NaCl、1 mM CaCl2，pH 7.2</li>
		<li>配制硼酸钠缓冲液：50 mM Na2B4O7，pH 8.5 
		样品制备步骤的流程图见图2。 
		操作悬臂梁和盖玻片时，建议使用自锁镊子。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>盖玻片的氨基硅烷化（约 1.5 小时）
	<ol>
		<li>将盖玻片（直径 24 mm，厚度 0.5 mm）放入聚四氟乙烯（PTFE）支架中。</li>
		<li>在体积比为 1:1 的乙醇与超纯水混合液中超声处理盖玻片 15 分钟。</li>
		<li>用超纯水冲洗盖玻片。</li>
		<li>将盖玻片浸入“piranha”溶液（体积比为 1:1 的浓 H2SO4 : 30% H2O2）中 30 分钟，然后用超纯水彻底冲洗。在温和的 N2 气流下干燥盖玻片。注意：“piranha”溶液具有极强腐蚀性，操作时必须佩戴眼部和皮肤防护装备。</li>
		<li>将盖玻片浸入体积比为 45:5:1 的乙醇 : 超纯水 : 3-氨基丙基二甲基乙氧基硅烷（v/v）混合液中，在室温下置于摇床上反应 60 分钟（约 50 rpm）。</li>
		<li>依次将盖玻片浸入乙醇和超纯水中各两次（每次一种溶剂）。在温和的 N2 气流下干燥盖玻片。</li>
		<li>将盖玻片在烘箱中烘烤（80 °C，30 分钟）。</li>
		<li>硅烷化处理后的盖玻片可在氩气环境中保存最多 6 周。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>悬臂梁的氨基硅烷化（约 1.5 小时） 
	注意：本方案中所述的探针功能化方法适用于硅基悬臂梁探针。
	<ol>
		<li>将悬臂梁放置在洁净的玻璃载片上，进行 15 分钟的紫外-臭氧处理。</li>
		<li>将悬臂梁浸入体积比为 1:1 的乙醇与 3-氨基丙基二甲基乙氧基硅烷混合液中 3 分钟，并加入催化量（0.25%，v/v）的超纯水。</li>
		<li>依次在甲苯、乙醇和超纯水的烧杯中轻轻搅拌冲洗悬臂梁，每次 60 秒。每次冲洗之间，小心地将悬臂梁在滤纸上轻触以干燥。</li>
		<li>将悬臂梁放回洁净的玻璃载片上，烘烤（80 °C，30 分钟）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>蛋白质二硫键还原（约 3 小时） 
	所有溶液的配制应确保每根悬臂梁使用约 30 µl 稀释后的蛋白溶液，每张盖玻片使用约 20 µl 稀释后的蛋白溶液。蛋白溶液应与 Tris(2-羧乙基)膦（TCEP）还原凝胶按体积比 1:2 混合。
	<ol>
		<li>在微量离心管中分装 TCEP 二硫键还原微珠。建议用剪刀剪去移液器吸头末端以增大孔径，便于移取 TCEP 微珠悬液。</li>
		<li>用 1 ml TBS 缓冲液冲洗 TCEP 微珠悬液，并在 850 rcf 下离心 3 分钟。</li>
		<li>用移液器小心吸除并弃去上清液。</li>
		<li>重复步骤 1.4.2–1.4.3 两次。</li>
		<li>将浓缩的蛋白溶液（1–10 mg/ml）加入 TCEP 微珠中（蛋白与 TCEP 微珠悬液的体积比为 1:2），用移液器吸头轻轻搅拌混合。避免引入气泡。</li>
		<li>将蛋白/TCEP 微珠混合悬液置于旋转仪上反应 2.5 小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>盖玻片和悬臂梁的 PEG 修饰（PEGylation）（约 1.5 小时）
	<ol>
		<li>在使用 NHS-PEG-马来酰亚胺交联剂修饰前，将氨基硅烷化处理后的悬臂梁和盖玻片浸入 pH 8.5 的硼酸钠缓冲液中 45 分钟，以使表面的伯胺基团去质子化。</li>
		<li>确保在打开瓶盖和称量前，NHS-PEG-马来酰亚胺粉末已恢复至室温。未使用的 NHS-PEG-马来酰亚胺应于 -20 °C 在氩气环境中保存。每根悬臂梁约需 30 µl 聚合物溶液，每两片叠合的盖玻片约需 90 µl 溶液。</li>
		<li>称取 5 kDa 的 NHS-PEG-马来酰亚胺后，加入硼酸钠缓冲液并涡旋混合，配制成 25 mM 溶液。 
		注意：由于 NHS 在 pH 8.5 条件下半衰期极短，溶液应尽快使用。涡旋混合及将液体转移至悬臂梁或盖玻片的操作应在 1–2 分钟内完成。</li>
		<li>将悬臂梁置于培养皿中，每片上加 30 µl NHS-PEG-马来酰亚胺溶液液滴。对于盖玻片，先在一张盖玻片上加 90 µl NHS-PEG-马来酰亚胺溶液，再将另一张盖玻片覆盖其上，形成中间含溶液的“盖玻片夹心”结构。</li>
		<li>将悬臂梁和盖玻片在室温、饱和湿度环境中孵育 1 小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>蛋白质偶联（约 2 小时） 
	关键：尽量减少 PEG 修饰后的悬臂梁和盖玻片暴露于空气中的时间。
	<ol>
		<li>将 TCEP 微珠/还原蛋白溶液在 100 rcf 下离心 1 分钟，收集上清液。</li>
		<li>用 TBS 缓冲液稀释蛋白溶液，目标是在表面偶联过程中蛋白浓度维持在 0.5–2 mg/ml。在冲洗悬臂梁和盖玻片时，将还原并稀释的蛋白溶液暂时放置备用。</li>
		<li>将悬臂梁和盖玻片依次在三个盛有超纯水的烧杯中冲洗。</li>
		<li>在温和的 N2 气流下，用滤纸轻轻接触盖玻片边缘以去除残留液体；用滤纸轻触悬臂梁以去除残留液体。随后立即加入稀释的蛋白溶液。</li>
		<li>将盖玻片安装至与原子力显微镜（AFM）仪器兼容的适当样品台中。</li>
		<li>将 PEG 修饰的盖玻片和悬臂梁分别与对应的稀释蛋白溶液在室温下孵育 1–2 小时。</li>
		<li>将悬臂梁在三个盛有 TBS 缓冲液的烧杯中依次冲洗，以去除未结合的蛋白。对盖玻片至少用移液器冲洗 10 次。</li>
		<li>在测量前，将悬臂梁和盖玻片保存在 TBS 缓冲液中。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 数据采集
本研究中使用了一台自制的原子力显微镜（AFM）28，由Asylum Research的MFP-3D原子力显微镜控制器控制，并配合自行编写的Igor Pro软件进行操作。悬臂梁偏转通过光学束偏转法29进行测量。本文提供的样品制备和数据分析方案适用于任何型号的原子力显微镜。然而，所使用的原子力显微镜应具备在液体环境中测量的能力，并支持z轴压电扫描器约200–5,000 nm/sec的可调速度范围。
<ol>
	<li>将功能化后的悬臂梁和玻璃表面安装到原子力显微镜（AFM）上。在整个操作过程中，表面应始终保持被缓冲液覆盖。安装悬臂梁时，尽量减少其暴露于空气中的时间。在正确调整激光束位置后，让系统平衡至少30分钟，以减少漂移效应，并在必要时重新调整。</li>
	<li>在悬臂远离表面的位置记录热噪声谱， 即 在无阻尼效应的情况下。</li>
	<li>使用声学法等微创方法在测量前定位表面，以避免损坏悬臂探针。如果可能，手动将悬臂靠近表面，并使用耳机监听原子力显微镜控制器原始偏转输出中的热噪声。当悬臂接近表面时，可听到声音发生明显变化。 
	注意：悬臂针尖现在应位于 2-5 µm 表面。声音变化的性质取决于所用悬臂梁的特性。本研究中使用的悬臂梁在水中的共振频率约为25 kHz，高于人类听觉范围。由于靠近表面时的阻尼效应，共振频率向较低频率偏移，使悬臂梁的共振进入可听范围。因此，可感知到频率和声音强度的明显增加。 
	在无法获得偏转信号音频输出的情况下，可在启用偏转信号的主动反馈时，通过z轴压电陶瓷驱动器接近样品表面。一旦由于表面压入导致偏转信号增加至预设值，即停止接近。</li>
	<li>测定倒光学杠杆灵敏度（InvOLS），即每伏特偏转信号所对应的针尖位移距离（单位：nm）。通过使用悬臂针尖压入表面来完成该测定，建议采用对应于悬臂针尖位移约3 nm的偏转设定点电压。</li>
	<li>根据能量均分定理，通过将简谐振子响应函数拟合到悬臂梁的热噪声谱来确定其弹簧常数30,31.</li>
	<li>初始化实验程序。本研究采用以下测量参数：接近速度：3,000 nm/sec；压痕力：180 pN；表面停留时间：10 msec；回缩速度：0.2, 0.7, 2.0 5.0 µm/sec 采样率分别为 2,000、5,000、15,000、20,000 Hz；回撤距离：500 nm。 
	注意：采样率不应设置高于10点/纳米，以避免过采样并保持数据量合理。</li>
	<li>每次力-距离曲线测量后，驱动x轴和y轴压电平台，使悬臂在每条力-距离曲线中接触盖玻片表面的新位置。该技术可在长期测量期间对盖玻片表面更大区域进行采样。</li>
	<li>使用偏转台的周期性调零（即 光电二极管位置）以及在长期测量过程中，若偏转信号漂移超出范围或与表面失去接触时，z向压电陶瓷支架的高度。</li>
	<li>测量运行结束后，进行另一次InvOLS测量，所用压痕力应显著高于测量前的压痕力，以获得更精确的InvOLS值。</li>
	<li>远离表面处记录另一条热噪声谱。在实验结束时确定弹簧常数。</li>
</ol>
3. 数据分析
图3中的流程图展示了数据分析的过程。使用适当的软件包（如 Igor Pro 或 MATLAB）执行所有数据处理操作。首先将检测器的原始信号转换为力的单位，并对偏移和漂移进行校正。随后，利用生物大分子弹性的模型来定位解折叠路径中的能垒，并识别蛋白质亚结构域。最后，获得受体-配体相互作用的动力学和能量学参数。
<ol>
	<li>单位换算与数据校正
	<ol>
		<li>将原始偏转信号（伏特）乘以InvOLS（纳米/伏特）和弹簧常数（皮牛/纳米），以将探测器电压转换为力的单位。</li>
		<li>通过取力-距离曲线最后10%（远离表面时采集）的力值进行平均，将未加载悬臂的力值偏移至0 pN，然后从数据曲线的所有力值中减去该平均值。</li>
		<li>将每条曲线在x方向上进行偏移，使得其与距离轴的第一个交点位于0 nm处。</li>
		<li>InvOLS 依赖于激光光斑在悬臂上的位置。即使光学读出系统发生微小漂移，当悬臂的尺寸与激光光斑大小相当时，也可能导致 InvOLS 出现明显变化。可通过在零力条件下分析形变信号的噪声来校正此效应。假设环境条件恒定，形变信号上的噪声与 InvOLS 成正比。
		<ol>
			<li>测量每条力-距离曲线最后10%区段的均方根（RMS）偏转值（零力下的噪声水平）。</li>
			<li>绘制噪声与曲线编号的关系图，并进行适当的拟合。通常采用指数拟合形式 <img alt="Exponential decay formula, N(n_i)=N_0 * e^(-kn_i), mathematical representation." fo:content-width="1in" height="22" src="/files/ftp_upload/50950/50950_clip_image002.jpg" width="109" data-altupdatedat="1787630408000"> 效果最佳，其中N为噪声，ni为曲线编号，N0和k为拟合参数。对于某些数据集，线性拟合也可能适用。</li>
			<li>为每条曲线确定一个缩放因子（SF）： 
			 
			公式 1： 
			<img alt="static equilibrium equation; (SF)=(N₀e^(-knᵢ)+C)/(N₀e^(-knₓ)+C); mathematical formula" fo:content-width="2in" height="50" src="/files/ftp_upload/50950/50950eq1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000"> 
			其中，ni 为曲线编号，nf 为最终曲线编号，C 为偏移量。</li>
			<li>接下来，将每条独立曲线中的所有力值除以相应的缩放因子。该步骤通过将当前曲线的均方根噪声值与InvOLS测量前立即获取的最终轨迹的均方根噪声值之比，对每条曲线进行归一化处理。</li>
			<li>进行偏转校正，将距离轴（z）转换为分子延伸量（z*）。该步骤可校正悬臂在受力下弯曲所导致的悬臂尖端与样品间距离缩短，此缩短量相对于z压电传感器所报告的位置值。 
			 
			公式 2： 
			<img alt="Static equilibrium equation, z* = z - F/k, formula; physics calculations, force analysis" fo:content-width="1in" height="50" src="/files/ftp_upload/50950/50950eq2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000"> 
			何处 z 是测得的z轴传感器位置， F 悬臂上的作用力以及 k 弹簧常数</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>轮廓长度分析 
	蛋白质的轮廓长度是指多肽链完全伸展时的最大长度。蛋白质的折叠状态由其二级和三级结构决定，反映了蛋白质的空间构象及其首尾之间的距离。蛋白质的轮廓长度与其折叠状态直接相关。9,25,32由于PEG连接臂的多分散性以及温度、缓冲液性质和加载速率等外部参数的影响，力-延伸曲线中特定断裂位置存在较大差异。这给直接数据分析带来了困难，但可通过将力-延伸数据转换至轮廓长度空间予以克服。该技术能够对大量数据集进行平均处理，并允许使用自动模式识别方法来鉴定特征性去折叠事件。因此，可根据所表现出的相互作用类型对单个力曲线进行分类。以下为先前已描述的实验步骤25 用于将力-延伸数据转换为轮廓长度空间。
	<ol>
		<li>求解WLC模型（方程3）23 轮廓长度 L 在固定的持久长度下 p 得到公式4的结果，该公式提供了轮廓长度 L(x,u)。在此处， x 是距离和 u = F * p / kBT，其中 kB 是玻尔兹曼常数，T 为温度。仅可考虑实数解。附加约束条件为 x&lt;L, F&gt;0, L&gt;0, x&gt;0; 
		 
		公式 3： 
		<img alt="Force-extension formula, F(x,L), polymer physics equation, illustrates entropic elasticity." fo:content-width="2.5in" height="50" src="/files/ftp_upload/50950/50950eq3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000"> 
		 
		公式 4： 
		<img alt="Static equilibrium, L(x,u), complex formula, educational diagram, analytical expression interpretation." fo:content-width="3in" height="50" src="/files/ftp_upload/50950/50950eq4a.jpg" data-altupdatedat="1787630408000"> 
		其中， 
		<img alt="Polynomial function \( g(u) \) equation, mathematical analysis, symbolic computation." fo:content-width="3.5in" height="60" src="/files/ftp_upload/50950/50950eq4b.jpg" data-altupdatedat="1787630408000"></li>
		<li>在力-轮廓长度图中绘制经变换的数据点。应用约10 pN的力阈值以排除噪声。通过应用长通长度滤波器排除非特异性相互作用。构建轮廓长度的直方图。</li>
		<li>互相关分析33 将获得的直方图与模板直方图进行比较，并沿x轴进行偏移以校正PEG的多分散性。利用所得的相关系数值来衡量各条数据轨迹之间的相似性，从而可将数据轨迹归类至预定义的类别中，以简化后续分析。</li>
		<li>使用类似的技术，通过自相关方法在单个轨迹中寻找重复特征， 例如 多个Ig结构域的解折叠。</li>
		<li>手动分类轨迹以研究其他去折叠事件。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>加载速率分析 
	通过将合适的模型应用于力谱，提取受体-配体解离的动力学和热力学信息。 即 断裂力与加载速率对数的关系图
	<ol>
		<li>对于给定的拉伸速度，确定目标断裂事件的断裂力和加载速率：
		<ol>
			<li>在目标断裂事件附近的力-时间曲线上进行直线拟合。根据直线拟合至峰值的斜率确定加载速率。对每条显示目标断裂事件的曲线重复此操作。</li>
			<li>通过将断裂力的直方图进行高斯拟合，确定最可能的断裂力。也可采用其他拟合函数。</li>
			<li>确定最可能的加载速率。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>对所有拉伸速度重复步骤 3.3.3.1 - 3.3.3.3。</li>
		<li>将最可能的断裂力对最可能的加载速率的自然对数作图，以获得力谱。</li>
		<li>将合适的理论模型应用于力谱，以提取动力学和能量参数（图4C）。在许多情况下，线性 Bell-Evans 模型20,34 可用于并能获得良好的估计值 koff，无外力作用下的解离速率，以及 Dx 沿反应坐标到过渡态的距离，如公式5所示。 
		 
		公式 5： 
		<img alt="static force equation ⟨F⟩, k_B T/Δx, formula analysis for thermal fluctuation experiments" fo:content-width="2in" height="50" src="/files/ftp_upload/50950/50950eq5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000"></li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Dudko, O. K., Hummer, G., Szabo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+Rates+and+Activation+Free+Energies+from+Single-Molecule+Pulling+Experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Rev.+Lett%22%5BJournal%5D)">Intrinsic Rates and Activation Free Energies from Single-Molecule Pulling Experiments.</a> Phys. Rev. Lett. 96 (10), 108101 (2006).</li>
<li>Friddle, R. W., Noy, A., De Yoreo, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interpreting+the+widespread+nonlinear+force+spectra+of+intermolecular+bonds%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Interpreting the widespread nonlinear force spectra of intermolecular bonds.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (34), 13573-13578 (2012).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

为了从单分子力谱实验中获得有意义的数据，实现明确定义且可重复的拉伸几何构型至关重要。本实验所采用的方案可实现蛋白质复合物在特定拉伸几何构型下的位点特异性固定。
本研究中所使用的悬臂梁因其在水中的力灵敏度和高共振频率而被选用。此外，探针尖端曲率半径较小（约10 nm），有利于单分子实验，可降低发生多重相互作用的可能性。然而，悬臂梁臂部尺寸较小（38×16 µm2），在使用光学偏转法29时会增加激光束调节的难度。本实验所用装置中聚焦激光束的直径与悬臂梁的宽度相当，因此获得稳定的总信号可能较为困难。我们已描述过，可通过分析数据曲线中的噪声来校正逆光学杠杆灵敏度，从而部分补偿激光在悬臂梁上的漂移。目前，我们课题组正在研发一种新型原子力显微镜，其具有更短的光路和更小的激光光斑尺寸，以提高数据质量。
为了获得有关断裂事件的可靠信息，必须对大量曲线进行分析。由于单分子力谱测量会受到多种波动的影响，在力-伸展空间内的平均化处理并无助于分析。然而，一旦在轮廓长度空间中对势垒位置直方图进行对齐，便可对其...

纤维素小体是存在于厌氧纤维素降解细菌表面的大型多酶复合物（例如&#160;C. thermocellum能够高效地将植物细胞壁中的木质纤维素降解为可溶性寡糖的微生物1细胞表面体的一个核心特征是高亲和力的黏连素-对接素相互作用。在最典型的模式中，多种细菌酶的C末端展示出一个高度保守的约60-75个氨基酸组成的I型对接素模块。该对接素模块可引导多种酶协同组装到非催化性的骨架蛋白（“支架蛋白”）上，该骨架蛋白由多个对I型对接素模块具有特异性的黏连素结构域组成的多蛋白结构。在更高级的结构层次上，细胞表面体的构架可能变得非常复杂，包含其他类型的黏连素与对接素配对（例如&#160;II型、III型）将这些结构锚定在细胞表面，并介导含有多个支架蛋白的分支结构的组装2不同的卷曲蛋白-对接蛋白类型尽管结构相似，却表现出差异性的结合特异性，从而抑制了与非目标支架蛋白或其他产纤维素体细菌物种组分之间的交叉反应。尽管生物信息学方法已在基因层面成功鉴定了数千种独特的纤维素体组分，但已知的蛋白质结构仍相对较少，卷曲蛋白与对接蛋白特异性识别的分子机制仍是结构生物学研究的活跃领域。
自从Binnig等人发明原子力显微镜（AFM）以来et al.3，已发展并持续改进了多种AFM操作模式，包括非接触成像、振荡模式成像4以及单分子力谱（SMFS）5,6。SMFS已发展成为一种广泛应用的技术，用于直接探测单个蛋白质7-11、核酸12-15和合成聚合物16-19。在典型的用于研究受体-配体结合的SMFS实验中20,21，将结合对中的一方修饰在AFM悬臂探针上，而将互补的结合对修饰在平坦的玻璃表面。修饰后的悬臂探针与表面接触，使结合对发生结合。随后以恒定速度将悬臂基部拉离表面，并利用光学杠杆偏转法测量作用力。如果形成了结合，则所得的力-距离曲线会呈现出锯齿状的峰。当结合对被融合至多个蛋白质结构域时，力-距离曲线中的每个峰可对应于单个蛋白质结构域或折叠亚结构域的展开，而最后一个峰则对应于蛋白质结合界面的断裂。这些抗力元件的特定位置可作为“指纹”用于识别感兴趣的各个蛋白质结构域。该方法可用于探究参与蛋白质折叠和稳定的關鍵氨基酸。文献中已报道了多种模型，用于解释SMFS实验中观察到的特征性力-伸展行为。最常用的模型包括自由连接链（FJC）模型22、蠕虫状链（WLC）模型18,23-25以及自由旋转链（FRC）模型25,26。
在我们之前的研究11中，我们采用单分子力谱技术研究了黏连蛋白（cohesin）与对接蛋白（dockerin）模块之间的相互作用。本文中，我们介绍了一种实验方案，用于在玻璃表面和悬臂梁上功能化修饰酶-对接蛋白（enzyme-dockerin）和纤维素结合模块-黏连蛋白（CBM-cohesin）蛋白构建体。我们还介绍了一种基于原子力显微镜（AFM）的单分子力谱（SMFS）实验方案，包括数据采集与分析流程。所述方案可轻松推广至其他分子体系，对于关注高亲和力受体-配体对的研究人员尤为有用。

<table><tbody><tr><td>3-氨基丙基二甲基乙氧基硅烷</td><td>ABCR GmbH</td><td>AB110423</td><td></td></tr><tr><td>5 kDa NHS-PEG-马来酰亚胺</td><td>Rapp Polymer</td><td>13 5000-65-35</td><td></td></tr><tr><td>TCEP 二硫键还原凝胶</td><td>Thermo Scientific, Pierce</td><td>77712</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.thermoscientific.com/pierce">www.thermoscientific.com/pierce&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>三(羟甲基)氨基甲烷</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BioLever mini 氮化硅悬臂梁探针</td><td>Olympus</td><td>BL-AC40TS-C2</td><td>软批次</td></tr><tr><td>XYZ 压电驱动器</td><td>Physik Instrumente GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>红外 &amp;ldquo;宽谱&amp;rdquo; 红外激光器</td><td>Superlum</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MFP-3D 原子力显微镜控制器</td><td>Asylum Research</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Igor Pro 6.31</td><td>Wavemetrics</td><td></td><td>数据采集与分析</td></tr><tr><td>氯化钠</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>氯化钙</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pH 计</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>硼酸钠</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>镊子</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>Thermo Scientific, Menzel-Gl&amp;auml;ser</td><td></td><td>直径 24 mm，厚度 0.5 mm</td></tr><tr><td>聚四氟乙烯样品台</td><td></td><td></td><td>定制</td></tr><tr><td>超声波清洗仪</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td></td><td></td><td>分析纯</td></tr><tr><td>硫酸（浓）</td><td></td><td></td><td>分析纯</td></tr><tr><td>过氧化氢（30%）</td><td></td><td></td><td>分析纯</td></tr><tr><td>旋转摇床</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>甲苯</td><td></td><td></td><td>分析纯</td></tr><tr><td>滤纸</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>载玻片</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>微量离心管</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>移液器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td></td><td></td><td>适用于微量离心管</td></tr><tr><td>旋转混合器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>培养皿</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>烧杯</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>光学显微镜</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

利用基于原子力显微镜的单分子力谱研究纤维素体的受体-配体系统

Investigating Receptor-ligand Systems of the Cellulosome with AFM-based Single-molecule Force Spectroscopy

纤维素小体是一类由部分厌氧细菌和真菌用来降解木质纤维素底物的离散多酶复合物。这些酶通过一系列相关的受体-配体相互作用，组装到非催化性的骨架蛋白上，该过程由相互作用的黏连模块（cohesin）和对接模块（dockerin）介导。黏连模块与对接模块之间具有极强的结合力，解离常数处于低皮摩尔至纳摩尔范围，这可能阻碍传统群体方法对解离速率的精确测量。原子力显微镜单分子力谱（SMFS）可测量单个生物分子对施加力的响应，与其他单分子操纵技术相比，即&#160;光镊）最适合研究高亲和力受体-配体相互作用，因其能够探测高力区间（&#62;120 pN）。本文介绍了我们在单分子水平上研究纤维素体蛋白组装的完整实验方案。基于天然纤维素体的蛋白拓扑结构，我们采用了酶- dockerin 融合蛋白以及碳水化合物结合模块-共济素（CBM-cohesin）融合蛋白，每种蛋白均在设计的半胱氨酸残基处具有可及的游离巯基。我们展示了位点特异性表面固定化方案，以及用于获取高亲和力复合物详细结合参数的测量与数据分析流程。文中阐述了如何量化单个亚结构域的解折叠力、复合物解离力、解离速率常数（kinetic off-rates）以及结合势阱的势阱宽度。此外，还进一步描述了这些方法在表征介导多结构域纤维素降解复合物组装的共济素（cohesin）-dockerin 相互作用中的成功应用。

我们采用所述方法研究了来自 C. thermocellum 的一种I型卷曲蛋白-对接蛋白配对。当卷曲蛋白与对接蛋白成功结合后，记录到的力-距离曲线显示出特征性的峰值模式。图4a展示了一条典型的曲线。曲线中的每个峰值代表一个蛋白质亚结构域的解折叠过程，最后一个峰值对应于受体-配体复合物的解离。
对于本研究中所考察的CBM-黏连素-对接素-木聚糖酶复合物，初始的力上升对应于PEG连接分子的拉伸。随后出现的最多三个递减的力谷反映了木聚糖酶结构域的展开。最终的峰值代表黏连素-对接素结合界面的断裂。
所有记录的力-距离曲线均被转换为力-轮廓长度空间。结果得到的能垒位置直方图如图4B所示。数据显示轮廓长度增加了约89 nm。木聚糖酶结构域由378个氨基酸组成，其中260个位于工程化半胱氨酸残基的C端。根据晶体结构，该结构域的折叠长度约为6 nm。进一步假设每个拉伸氨基酸的长度为0.365 nm35，则测得的89 nm增量可明确归因于...

纤维素体是用于降解纤维素的多酶复合物。本研究采用基于原子力显微镜的单分子力谱技术（AFM-based SMFS）来研究与纤维素体相关的蛋白质组装体的力学性质及其折叠构型。我们提供了一套完整的工作流程，用于蛋白质固定、数据采集和数据分析，以研究参与纤维素体组装的单个受体-配体复合物之间的相互作用。

纤维素小体是一类由部分厌氧细菌和真菌用于降解木质纤维素底物的离散多酶复合物。该复合物的组装过程涉及……

以下实验的总体目标是利用基于原子力显微镜（AFM）的单分子力谱技术，研究融合蛋白结合伴侣的力学特性及其折叠状态。该目标通过以下步骤实现：首先将蛋白结合伴侣共价固定在玻璃载片和AFM悬臂梁上，以获得明确的拉伸几何构型；随后用悬臂梁压入玻璃表面，从而建立受体-配体结合。接下来，以恒定速度撤回悬臂梁，以展开单个蛋白质结构域并解离受体-配体复合物，获得的结果可揭示在去折叠路径中充当能量势垒的三级结构元件，这些元件可在聚合物弹性模型中得以体现。通过将动力学模型拟合到动态力谱数据，可以获得有关结合伴侣的更多动力学和能量信息。该实验方法的总体目标是研究蛋白质在受力条件下的去折叠路径。该方法可用于研究蛋白质的机械稳定性。它适用于任何可通过基因工程引入可及性巯基的蛋白质受体-配体系统。初次使用该方法的研究人员可能会遇到困难，因为实验时机至关重要，且对悬臂梁的操作较为困难。该方法有助于回答生物物理学领域的一些关键问题，例如多结构域蛋白质如何解折叠。首先，将两个直径为24毫米、厚度为0.5毫米的圆形玻璃盖玻片放入A-P-T-F-E支架中，然后在体积比为50:50的乙醇与超纯水混合液中进行超声处理15分钟。超声处理完成后，用超纯水冲洗盖玻片，并将其浸入piranha溶液中蚀刻30分钟。30分钟后，取出盖玻片，用超纯水冲洗，并在温和的氮气气流下干燥。接着将盖玻片浸入由乙醇、超纯水和3-氨基丙基二甲基硅烷按45:5:1比例配制的混合溶液中。将浸没的样品置于室温下，以每分钟约50转的速度在摇床中振荡60分钟。随后将盖玻片依次浸入100%乙醇中，再用超纯水冲洗两次，每次各一次。再次在温和的氮气气流下干燥盖玻片。干燥后，将盖玻片置于80摄氏度的烘箱中烘烤30分钟。未使用的盖玻片可在氩气环境中保存长达六周，用于硅胶悬臂探针尖端的氨基化处理。首先将四个硅胶悬臂探针放置于洁净的玻璃载片上，并用紫外臭氧处理15分钟。然后将悬臂浸入由乙醇与三氨基丙基二甲基氧化硅按50:50配制的溶液中3分钟，并加入0.25%超纯水。接着，依次在甲苯、乙醇和超纯水中分别冲洗悬臂60秒。最后一次冲洗后，在滤纸上小心干燥悬臂，每次冲洗之间均需更换滤纸。将悬臂置于干净的玻璃载片上，在 80 摄氏度下烘烤 30 分钟。准备两管 TEP 二硫键还原珠：首先剪去 200 微升移液器吸头的尖端以增大其直径，然后将 100 微升储存珠溶液分别移入两个 1.5 毫升微量离心管中。接着，向 TEP 珠悬液管中加入 1 毫升 TBS，并通过短暂涡旋振荡微量离心管来洗涤珠子。然后以850 ×g离心3分钟，使磁珠沉淀。用微量移液器小心吸除并弃去上清液，再用1毫升TBS缓冲液将磁珠清洗两次，每次清洗之间均需离心。最后一次清洗后，向TEP磁珠中加入浓度为3毫克/毫升的浓缩蛋白溶液，磁珠与蛋白溶液的体积比为1:2，用微量移液器枪头轻轻搅拌混合液，避免引入气泡。然后将蛋白TEP磁珠悬液混合物置于旋转仪上旋转2.5小时。将氨基化AFM探针和盖玻片浸泡于pH为8.5的硼酸钠缓冲液中45分钟，以去质子化其表面的伯胺基团。随后将N-羟基琥珀酰亚胺-聚乙二醇马来酰亚胺（N-H-S-P-E-G malam）粉末恢复至室温，并用硼酸钠缓冲液通过涡旋振荡配制210微升浓度为25微摩尔的溶液。由于 NHS 的半衰期极短，溶液应尽快使用。在 pH 8.5 条件下，迅速将 30 微升 N-H-S-P-E-G 马来酰亚胺溶液滴加到培养皿上，每张其他玻璃盖玻片上滴加 90 微升。小心地将悬臂置于 30 微升液滴内。然后将没有液滴的盖玻片翻转，覆盖到含有 N-H-S-P-E-G malam 溶液的盖玻片上，形成含有 N-H-S-P-E-G MALAM 溶液的三明治结构。在室温下孵育悬臂和含有 N-H-S-P-E-G MALAM 溶液的盖玻片 1 小时。将 TEP 微珠和还原蛋白溶液在 100 ×g 下离心 1 分钟，并收集上清液。接下来，用 TBS 稀释蛋白质溶液。表面偶联时的蛋白质浓度应控制在每毫升 0.5 至 2 毫克范围内。然后将还原并稀释后的蛋白质溶液静置数分钟，同时清洗悬臂梁和盖玻片。将盖玻片依次在三个盛有超纯水的烧杯中冲洗。用滤纸轻轻接触盖玻片边缘，去除残留液体。然后将盖玻片安装在与原子力显微镜（AFM）仪器兼容的适当样品台中，并在温和的氮气流下吹干残留液体。将20微升稀释后的蛋白溶液以液滴形式加到盖玻片中央。随后将悬臂依次在三个盛有超纯水的烧杯中清洗，再分别加入30微升第二次稀释的蛋白溶液液滴。将经聚乙二醇修饰的盖玻片和悬臂分别与对应的稀释蛋白溶液在室温下于湿度 chamber 中孵育1至2小时。接下来，使用移液器以一毫升 TBS 对盖玻片至少冲洗 10 次，然后将其保存在 TBS 中直至进行测量。同时，使用三个盛有 TBS 的烧杯依次冲洗悬臂，以去除未结合的蛋白质，并将悬臂同样保存在 TBS 中。将已功能化的悬臂和玻片安装至适合在液体中测量的原子力显微镜（AFM）型号中，并确保其 Z 压电驱动器支持约 200 至 5,000 纳米每秒的可调速度范围。安装时应尽量减少暴露于空气，确保在整个过程中表面始终被缓冲液覆盖，并在正确调整激光束后使系统平衡至少30分钟，以减少任何漂移效应，必要时重新调整。然后在黏附成功结合后开始进行测量。此处显示的力-距离曲线通过配对方式由原子力显微镜（Docker）记录，呈现出特征性的峰形图谱。曲线中的每个峰代表一个蛋白质亚结构域的解折叠过程，最后一个峰对应于受体-配体复合物的解离。将记录的力-距离曲线转换为力-轮廓长度空间，并组装成能垒位置直方图。数据表明轮廓长度增加了约89纳米，可明确归因于xin结构域的展开，以探测共价dockerin结构域的结合能景及其相互作用。在四种不同的拉伸速度下共获得了186条数据曲线。以大蓝色圆圈显示的所得动态力谱代表了在特定加载速率下的最可能断裂力。随后将这些数值拟合到Bell-Evans模型，拟合结果得到了Koff和delta X的值，这些值与先前发表的结果高度一致。一旦掌握，该技术的实验部分可在八到九小时内完成。在后续实验中，可采用该方法进行位点特异性突变，以确定对结合至关重要的氨基酸。该技术的发展为单分子生物物理学领域的研究人员探索蛋白质折叠景观开辟了道路。我们利用该技术研究纤维素底物结合模块（SOEs）的力学特性，这类蛋白质系统是目前已知力学稳定性最高的蛋白质系统之一。观看本视频后，您应能充分理解如何对蛋白质受体-配体对进行单分子力谱分析。

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生物工程

调查纤维素酶与基于AFM的单分子力谱受体 - 配体系统

本文介绍了一种将多种单分子共价偶联到原子力显微镜（AFM）探针尖端的实验方案，并提供了测定这些分子在固体载体及生物界面黏附力和自由能的步骤与实例。...

通过原子力谱学研究单分子粘附

我们介绍一种制备支撑脂双层的方案，并利用原子力显微镜和力谱技术对其进行表征。...

原子力显微镜成像与支持性脂双层的力谱分析

我们介绍一种技术，可同时在单个T淋巴细胞中测量受力调控的单受体-配体结合动力学，并实时成像钙信号传导。...

荧光生物膜力探针：单细胞水平受体-配体动力学与结合诱导的细胞内信号通路的同步定量分析

本文介绍了一种利用原子力显微镜（AFM）通过单分子力谱测量技术，研究明确定义的无机表面与肽或氨基酸之间相互作用力的实验方案。该测量所获得的信息对于深入理解肽-无机材料界面具有重要意义。...

利用单分子力谱研究氨基酸和肽与无机材料相互作用的机制

我们描述了使用原子力显微镜测量单个蛋白质分子力学性质及其机械解折叠路径的详细步骤与策略。同时，我们展示了代表性结果，以作为筛选和判断高质量单个蛋白质分子记录的参考依据。...

使用原子力显微镜对单个蛋白质分子进行力谱分析

本方案描述了使用异双功能硅烷偶联剂将蛋白质共价固定在二氧化硅表面的方法，该表面专为基于原子力显微镜的单分子力谱技术而设计，并以肺炎链球菌（S.

用于单分子力谱的蛋白质共价固定

我们提出了一种用于免疫学研究的原子力显微镜（AFM）悬臂梁功能化方案，可在其上固定单个T细胞和微粒。本文展示了利用AFM探测单对T细胞-树突状细胞结合的步骤，以及结合荧光成像技术，利用AFM实时监测巨噬细胞对单个固体微粒的细胞反应的方法。...

原子力显微镜悬臂的功能化：负载单个T细胞或单颗粒用于免疫学单细胞力谱分析

本文介绍了一种利用酶促反应将蛋白质单体连接成具有可控序列的蛋白质聚合物，并将其固定在表面用于单分子力谱研究的实验方案。...

OaAEP1介导的聚合蛋白酶法合成及其在单分子力谱学中的固定

将探针分子共价连接到原子力显微镜（AFM）悬臂尖端是研究其物理性质的关键技术。通过基于AFM的单分子力谱法，可高度可重复地测定聚合物的拉伸力、脱附力及其长度。...

用于基于原子力显微镜的力谱单分子共价连接

本方案旨在对数百个微生物细胞实现原子力显微镜（AFM）测量的自动化。首先，将微生物固定在PDMS印章微结构中，随后对数百个固定的细胞自动进行力谱测量。...

对数百个C. albicans细胞进行生物原子力显微镜测量的自动化

原子力显微镜-红外光谱法（AFM-IR）为细菌研究提供了强大的平台，能够实现纳米级分辨率。该技术可在单细胞水平上对细菌进行亚细胞结构变化的成像（例如细胞分裂过程中）以及化学成分的比较研究（例如由药物耐药性引起的差异）。...

原子力显微镜结合红外光谱作为探测单个细菌化学特性的工具

了解基于原子力显微镜的单分子力谱技术，用于研究纤维素酶复合体中受体-配体系统的机械特性与蛋白质折叠状态。该方法为生物物理研究提供关键技术支持。

利用基于原子力显微镜的单分子力谱研究纤维素体的受体-配体系统

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