调查纤维素酶与基于AFM的单分子力谱受体 - 配体系统
2013年12月20日
纤维素小体是专为消化纤维素而设计的多酶复合物。基于 AFM 的 SMFS 用于研究纤维素小体相关蛋白质组装体的机械性能和折叠构型。我们提出了一个完整的蛋白质固定、数据采集和数据分析工作流程，以研究参与纤维素体组装的单个受体-配体复合物的相互作用。
以下实验的总体目标是使用基于 FM 的单分子力谱研究融合蛋白结合伴侣的机械性能和折叠状态。这是通过将蛋白质结合伴侣共价固定在载玻片和 A FM 悬臂上来实现的，以实现明确的拉动几何形状作为第二步。玻璃表面用悬臂凹陷，从而建立受体配体结合。
接下来，悬臂以恒定速度缩回，以展开单个蛋白质结构域并关联受体配体复合物，获得揭示三级结构元件，这些元件在展开路径上充当能量屏障，这在聚合物弹性模型中显示。通过将动力学模型拟合到动态力谱，可以获得有关结合伴侣的进一步动力学和能量信息。该程序的总体目标是研究蛋白质在力作用下的展开途径。
这种方法可以深入了解蛋白质的机械稳定性。它可以应用于任何可以使用可访问文件组进行工程设计的蛋白质受体配体系统。第一次使用这种方法的研究人员我很挣扎，因为时机很关键，而且处理悬臂可能很困难。
这种方法可以帮助回答生物物理学领域的关键问题，例如多结构域蛋白质如何展开 To begin place。将两个直径为 24 毫米 x 0.5 毫米厚的玻璃盖玻片放入 A-P-T-F-E 支架中，然后进行超声处理。盖子在 50 到 50 的乙醇和超纯水混合物中滑动 15 分钟。
超声处理完成后，用超纯水冲洗盖玻片，并在食人鱼溶液中蚀刻 30 分钟。30 分钟后，取下盖玻片，用超纯水冲洗，然后在温和的氮气流下晾干。接下来，将盖子浸入乙醇超纯水和 3 氨基丙基二甲基 ahoy 的 45 比 5 比 1 混合物中。
将浸入样品的摇床上，在室温下以每分钟约 50 转的速度放置 60 分钟。然后将盖玻片依次浸入 100% 乙醇中，然后加入超纯水各 2 次。再次，在温和的氮气流下擦干盖玻片。
干燥后，将盖玻片放入 80 摄氏度的烤箱中烘烤 30 分钟。将未使用的盖玻片在 Argonne 下存放长达 6 周，以进行硅胶悬臂尖端的氨基化。首先将四个硅胶悬臂放在干净的载玻片上，用紫外线臭氧处理 15 分钟。
然后将悬臂浸入 3 分钟，加入 50 至 50 的乙醇和三氨基丙基二甲基氧基 Ilene 溶液，以及点 25% 超纯水。接下来，在甲苯、乙醇和超纯水的烘焙器中依次冲洗悬臂 60 秒。最后一次冲洗后，在 RIN 之间小心地擦干滤纸上的悬臂。
将悬臂放在干净的载玻片上，在 80 摄氏度下烘烤 30 分钟。准备两个 Ts TEP diss 硫化物还原珠，首先从 200 微升移液器吸头上切下尖端以加宽其直径，然后将 100 微升储备珠溶液移液到每个 1.5 毫升微管中。接下来，向 TEP 微珠浆液 OTT 中加入 1 毫升 TBS，并通过短暂涡旋微管来冲洗微珠。
然后以 850 G 离心样品 3 分钟，使磁珠沉淀。用微量移液管小心取出并丢弃上清液，然后用 1 毫升 TBS 再冲洗珠子两次。在最后一次冲洗后，将每毫升 3 毫克的浓缩蛋白质溶液以 1 比 2 的比例添加到 TEP 珠子中，并通过用微量移液器吸头搅拌轻轻混合浆液，以避免引入气泡。
然后将蛋白质 TEP 珠浆混合物放在旋转器上 2.5 小时。将氨基眼悬臂和盖玻片浸泡在 pH 值为 8.5 的 Bate 钠缓冲液中 45 分钟，以使表面的伯胺基团去质子化。然后将 N-H-S-P-E-G 马拉姆粉加热至室温，并在钠男孩八号缓冲液中涡旋，以 25 微摩尔制备 210 微升。
由于 NHS 的半衰期极短，应尽快使用该溶液。在 pH 值为 8.5 时，将 30 微升 N-H-S-P-E-G 马拉姆溶液液滴快速沉积到培养皿上，将 90 微升液滴沉积到每隔一个玻璃盖玻片上。小心地将悬臂放入 30 微升液滴内。
然后将没有液滴的盖玻片翻转到带有 N-H-S-P-E-G malam 溶液的盖玻片上，与 N-H-S-P-E-G MALAM 溶液形成三明治。在中间，将悬臂和盖玻片与 N-H-S-P-E-G MALAM 溶液在室温下孵育一小时。将 TEP 微珠和还原蛋白溶液在 100 GS 下离心 1 分钟，然后收集 snat。
接下来，用 TBS 稀释蛋白质溶液。表面偶联过程中的蛋白质浓度目标为 0.5 至 2 毫克/毫升。然后将还原和稀释的蛋白质溶液放在一边几分钟，同时冲洗悬臂和盖玻片。
在三个连续的超纯水烧杯中冲洗盖玻片。小心地触摸滤纸的边缘，去除盖玻片上的残留液体。然后将盖玻片安装在与 A FM 仪器兼容的适当样品架中，并在温和的氮气流下干燥残留液体。
将 20 微升稀释的蛋白质溶液作为液滴滴涂在盖玻片的中心。然后在三个连续的超纯水烧杯中冲洗悬臂，然后用 30 微升液滴第二种稀释的蛋白质溶液冲洗。将聚乙二醇化盖玻片和悬臂与相应的稀释蛋白质溶液在室温下在湿度室中孵育 1 至 2 小时。
接下来，使用移液管用 1 毫升 TBS 冲洗盖玻片至少 10 次，然后将它们存放在 TBS 中直至测量。还要使用三个含有 TBS 的连续烧杯冲洗悬臂，以去除未结合的蛋白质并将其也储存在 TBS 中。将功能化、悬臂式和载玻片安装在 A FM 型号中，该型号适用于液体测量，并支持 Z 型压面镜上大约每秒 200 至 5， 000 纳米的可接近速度范围。
安装罐头时，应尽量减少与空气的接触，确保在正确调整激光束后，在整个过程中表面保持缓冲覆盖。让系统平衡至少 30 分钟以减少任何漂移效应，并在必要时重新调整。然后在内聚力成功结合后开始测量。
Docker 将此处显示的记录的力距离轨迹配对。表现出特征性的峰模式。轨迹中的每个峰都代表一个蛋白质亚结构域的去折叠，最后一个峰对应于受体配体复合物的解离。
然后将记录的力距离轨迹转换为力等值线长度空间，并组装在屏障位置直方图中。数据显示等值线长度增量约为 89 纳米，可以明确地分配给 xin 域的展开，以探测内聚泊坞窗和相互作用的能量景观。在四种不同的池化速度下，总共获得了 186 条数据轨迹。
由此产生的动态力谱显示为蓝色大圆圈，表示在给定载荷速率下最可能的断裂力。然后将这些值拟合到 Bell Evans 模型中，拟合得到 Koff 和 delta X 的值，发现它们与以前发布的结果非常一致。一旦掌握，这项技术的实验部分可以在 8 到 9 小时内完成。
按照此程序，可以在后续实验中进行位点特异性诱变，以确定其发育后对结合至关重要的氨基酸。这项技术为单分子生物物理学领域的研究人员探索蛋白质折叠景观铺平了道路。我们用它来研究纤维素 SOE 的机械性能，这是已知的机械稳定性最稳定的蛋白质系统之一。
看完这个视频后，您应该对如何对蛋白质受体配体对进行单分子力谱有很好的了解。
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概述
本研究使用基于原子力显微镜的单分子力谱法（SMFS）来研究细胞糊体相关蛋白组合的机械性质和折叠状态。提出了一套完整的蛋白质固定、数据采集和分析流程，用于探索细胞糊体组装中的受体-配体相互作用。
研究的关键组成部分
科学领域
- 神经科学
- 生物物理学
- 蛋白质化学
背景
- 细胞糊体是能够消化纤维素的多酶复合物。
- 了解它们的机械性质对生物技术应用至关重要。
- 单分子力谱法提供了关于蛋白质相互作用的见解。
- 原子力显微镜技术允许对蛋白质的折叠和展开进行精确测量。
研究目的
- 研究细胞糊体蛋白的机械性质。
- 分析蛋白质组合的折叠构型。
- 了解细胞糊体组装中的受体-配体相互作用。
所用方法
- 在玻璃片和原子力显微镜悬臂上共价固定蛋白质。
- 用悬臂在玻璃表面进行压痕以建立结合。
- 以恒定速度回撤悬臂以展开蛋白质结构域。
- 对动态力谱拟合动力学模型以进行进一步分析。
主要结果
- 揭示了在展开过程中作为能量屏障的三级结构元件。
- 提供了关于蛋白质结合伙伴的动力学和能量信息。
- 证明了聚合物弹性模型在分析数据中的实用性。
- 为理解蛋白质在力作用下的展开途径做出了贡献。
结论
- 该研究增进了对细胞糊体蛋白相互作用的了解。
- 它为未来使用SMFS的研究建立了框架。
- 研究结果可能对涉及纤维素降解的生物技术应用产生影响。
常见问题
Executive Industry Relevance
Atomic force microscopy-based single-molecule force spectroscopy (AFM-SMFS) enables direct quantification of high-affinity receptor-ligand interactions, such as those in cellulosome assembly, which are inaccessible to conventional bulk assays. This capability provides mechanistic de-risking and predictive confidence at the earliest stages of target validation for protein-protein interaction networks. Integrating these quantitative biophysical measurements supports portfolio triage and informs go/no-go decisions in biologics discovery pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Quantifies binding kinetics and mechanical stability of receptor-ligand pairs at the single-molecule level.
- Enables mechanistic de-risking by revealing energy barriers and unfolding pathways in protein complexes.
- Supports functional target validation by directly measuring dissociation forces and kinetic off-rates.
- Facilitates identification of critical binding residues through follow-up mutagenesis studies.
Screening & Assay Development
- Establishes validated, site-specific immobilization protocols for reproducible single-molecule assays.
- Generates quantitative rupture force and unfolding data to benchmark assay performance.
- Enables standardization of high-affinity interaction measurements for downstream screening workflows.
- Provides robust data for comparing engineered protein variants or ligand candidates.
Translational & Preclinical Research
- Aligns biophysical measurements with disease-relevant protein complexes when applicable.
- Supports continuity from molecular discovery to preclinical validation by characterizing interaction robustness.
- Informs risk-adjusted advancement decisions based on quantitative stability and binding data.
Pipeline & Workflow Integration
AFM-SMFS positions as a discovery-stage tool bridging molecular target validation and early assay development, particularly for protein-protein interactions with ultra-high affinity.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing of binding mechanisms and energy landscapes in complex assemblies.
- Screening: Provides reproducible, quantitative force measurements for assay readiness and benchmarking.
- Analytics: Delivers kinetic off-rates, rupture forces, and contour length increments for comparative analysis.
- Translational Research: Offers mechanistic insights that can inform preclinical model selection when relevant.
- Enterprise Reuse: Protocols and analytical frameworks are adaptable to diverse receptor-ligand systems across R&D programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes single-molecule measurement workflows for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by providing high-resolution binding data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of protein targets and interaction networks.
Implementation Considerations
- Requires expertise in AFM operation, protein engineering, and single-molecule data analysis.
- Demands specialized instrumentation and controlled sample preparation environments.
- Necessitates rigorous cross-team standardization for reproducible immobilization and measurement protocols.
- Adaptable to various protein systems with accessible thiol groups for site-specific conjugation.
- Timing and technical handling are critical for successful data acquisition and interpretation.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:51
Aminosilanization of Glass Cover Slips and Cantilevers
4:21
Protein Disulfide Reduction
5:36
PEGylation of Cover Slips and Cantilevers
6:53
Protein Conjugation and AFM Setup
9:21
Results: Investigation of a Type I Cohesin-dockerin Pair from C. thermocellum
10:37
Conclusion
