Name: 从人类胸腺髓样树突状细胞和上皮细胞的分离 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-19T21:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 7 s
Description: 学习从人类胸腺组织中分离髓样树突状细胞和上皮细胞的方法。本方案采用机械破碎、酶消化和密度梯度离心技术，可获得高纯度细胞群体，为免疫学和细胞生物学研究提供高效、可重复且经济实用的实验手段。

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我们感谢图宾根大学医院胸心血管外科的外科医生们为我们提供了胸腺样本，感谢德国海德堡DKFZ的Bruno Kyewski提供了CDR2抗体。我们还要感谢图宾根大学分选设施的Hans-Jörg Bühring和Sabrina Grimm。本工作得到了SFB 685和Hertie基金会的资助。

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未声明利益冲突。

本文所述方案是对 Gotter et al4 发表方案的修改。该方案中的关键步骤包括组织的状态与初始处理，以及 Percoll 密度梯度分离。我们强烈建议在组织采集后尽快进行处理。在清洗和切割组织时，操作应迅速且彻底。在步骤 2.3 所述的胸腺细胞洗涤过程中，使用注射器活塞背面按压组织块时，需掌握适当的压力平衡，因为过于剧烈或持续时间过长的压力可能会损伤基质细胞。将培养基缓慢铺加在 Percoll 溶液/细胞悬液上方而不引起扰动，也可能需要一定的操作经验。离心后，应尽快从 Percoll 层中收集全部低密度组分的细胞，并尽量减少 Percoll 溶液的混入。
总体细胞得率和相对APC数量可能差异较大（见表1），并取决于供体（尤其是年龄因素）以及实验操作人员的技术水平。简要概述而言，可根据需要在方案的不同步骤后，使用HLA-DR和/或其他标志物对细胞悬液进行染色。用于表型分析的所有抗体均应进行滴定，以获得最佳结果。
由于与胸腺细胞相比，胸腺中抗原呈递细胞（...

胸腺是T细胞发育的器官。随着年龄增长，胸腺的相对和绝对体积逐渐减小，并逐步被脂肪组织取代，尽管在老年人中仍可检测到胸腺活性。其在免疫应答中的重要性于20世纪60年代初得到证实1。
T细胞受体与不同类型的胸腺抗原提呈细胞（APC）表面的肽-MHC复合物相互作用，从而塑造T细胞受库，这些相互作用为发育中的T细胞提供存活或死亡信号，最终形成具有功能且在很大程度上对自身耐受的T细胞受库2。
人类胸腺中约98%的细胞是正在发育的T细胞，称为胸腺细胞。其余2%由多种不同类型的细胞组成，包括多种胸腺上皮细胞（皮质型、髓质型、被膜下型）、髓系和浆细胞样树突状细胞（mDC、pDC）、巨噬细胞、B细胞、成熟的再循环T细胞、粒细胞、成纤维细胞、内皮细胞，以及极少数表达表型类似于其他组织（如肌肉、神经元和呼吸道上皮）细胞的上皮细胞（图1）。其中，胸腺上皮细胞（TEC）和树突状细胞（DC）是正常胸腺中主要的抗原呈递细胞（APC）类型。近年来，对这些APC类型进行分离培养和分子特征分析的研究兴趣日益增加。由于这些细胞类型的频率较低，对其进行深入分析所需的分离过程必须高效、可重复且成本较低。本文所述方法是在先前已发表研究3,4的基础上进行的改进。
与其它组织一样，胸腺组织的细胞提取可通过酶解方法破坏细胞间及细胞与基质间的相互作用网络，从而获得单细胞悬液。在成功分离这些稀有细胞群体的过程中，某些参数至关重要，需进行优化，包括良好的解离效率、细胞得率、细胞活力以及细胞表面标志物的保留情况。
在本实验方案中，通过机械破碎和酶消化将组织制成单细胞悬液，以分离树突状细胞（DC）和胸腺上皮细胞（TEC）亚群。我们使用来自Clostridium histolyticum的胶原酶A，该酶具有多种酶活性的平衡比例，可降解维持组织结构的天然胶原。在酶解液中加入DNase I，以减少因死细胞（胸腺细胞非常敏感）释放的游离DNA导致的细胞聚集。我们还提供了一种替代传统酶消化的方法，即结合使用组织解离仪辅助进行机械和酶法处理组织。随后，将单细胞悬液进行单次Percoll密度梯度离心，以富集低密度细胞组分（LDF）。从该细胞组分中，可通过标记DC表面标志物（即 CD11c+）并结合磁性分离或荧光激活细胞分选（FACS）来分离DC。与构成胸腺中绝大多数细胞的淋巴细胞不同，TEC不高水平表达CD45，但表达上皮细胞黏附分子EpCAM。通过CDR-2（cortical dendritic reticulocyte-2）抗体识别的一种尚未明确的抗原的表达情况，以及相对较低的EpCAM表达水平，可将皮质型TEC（cTEC）与髓质型TEC区分开来4,5。EpCAM与CDR2的差异性共表达使得可通过高速细胞分选技术高效分离这些TEC亚群6。
本方案经过优化，适用于人胸腺组织。实验所需时间取决于组织量、操作者的熟练程度以及细胞分选仪的分选速度（如果使用FACS分选）。通常情况下，树突状细胞（DC）的分离可在5-6小时内完成，胸腺上皮细胞（TEC）的分离则需8-10小时。从胸腺组织中分离DC和TEC亚群对时间较为敏感，分离过程越快，细胞状态越好。最终获得的细胞可用于后续多种研究，如mRNA和蛋白质表达的比较分析、PCR实验、蛋白质提取、分子谱型分析（即转录组学、微小RNA分析）以及细胞培养6。
伦理声明
为了能够使用人胸腺组织进行研究，研究人员需要获得当地伦理委员会或相关主管部门的批准，以及供体（通常为其父母，因为组织通常来自未成年儿童）的书面知情同意。此外，所有人体组织均应被视为可能具有传染性，并应采取适当的防护措施，例如佩戴手套操作。 等等.

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;试剂与材料&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>PAA</td><td>E15-842</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Dulbecco's PBS</td><td>PAA</td><td>H15-002</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>胎牛血清-Gold</td><td>PAA</td><td>A15-151</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>PAA</td><td>K41-001</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>胶原酶A</td><td>Roche</td><td>10 103 586 001</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>DNase I，II型牛胰腺来源</td><td>Roche</td><td>10 104 159 001</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA 10倍PBS溶液</td><td>PAA</td><td>L11-001</td><td>储存浓度 20 mg/ml</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 蛋白标记试剂盒</td><td>Molecular Probes</td><td>A-10235</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>抗人CDR2（纯化）</td><td>Bruno Kyewski, DKFZ- Heidelberg, Germany</td><td></td><td>用Alexa Fluor 488标记</td></tr><tr><td>抗人CD45（Pacific Blue）</td><td>Biolegend</td><td>304022</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>抗人EpCAM（APC）</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-254</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>抗人CD11c（PE）</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-411</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>抗PE微珠</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-048-801</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>抗CD45微珠，人源</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-045-801</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>LS柱</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>gentleMACS C管</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-237</td><td>用于组织解离仪</td></tr><tr><td>Percoll（密度1.130 g/ml）</td><td>GE Healthcare, Life Sciences</td><td>17-0891-01</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>无菌蒸馏水（无DNA酶/RNA酶）</td><td>GIBCO</td><td>10977-035</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Gamunex 10%</td><td>Tajecris-Biotherapeutics</td><td>G120052</td><td>1:10预稀释，使用20 &amp;mu;l/1 × 10&lt;sup&gt;6&lt;/sup&gt;细胞</td></tr><tr><td>0.22 &amp;mu;m滤器</td><td>Millex GS</td><td>SLGS033SS</td><td>注射器驱动</td></tr><tr><td>Stericup滤器单元</td><td>Millipore</td><td>SCGPU05RE</td><td>泵驱动</td></tr><tr><td>50 ml PC橡树岭离心管</td><td>Nalgene</td><td>3118-0050</td><td>50 ml</td></tr><tr><td>50 ml PP锥形管</td><td>Becton Dickinson</td><td>352070</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>12 mm × 75 mm 5 ml试管</td><td>Becton Dickinson</td><td>352058</td><td>用于FACS染色</td></tr><tr><td>70 &amp;mu;m细胞筛</td><td>Becton Dickinson</td><td>352350</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;仪器&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>流式细胞仪-分选仪（BD FACSAriaTMIIu）</td><td>Becton Dickinson</td><td></td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Sorvall Evolution R6（转子）</td><td>Kendro</td><td></td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Rotator REAX 2</td><td>Heidolph</td><td></td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>gentleMACS解离仪</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093 235</td><td>组织解离仪</td></tr></tbody></table>

从人胸腺中分离髓系树突状细胞和上皮细胞

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

本方案提供了一种从人胸腺中分离树突状细胞（DC）和胸腺上皮细胞（TEC）的方法。DC和TEC是正常胸腺中存在的主要抗原提呈细胞（APC）类型，它们在胸腺选择过程中发挥着明确且不同的作用。这些细胞定位于胸腺内不同的微环境，且每种APC类型仅占细胞总数的极小比例。为了进一步理解这些细胞类型的生物学特性，对它们进行表征非常必要；但由于其频率较低，分离任一类细胞均需要高效且可重复的操作流程。本方案详细描述了一种获取适用于多种细胞特性表征的细胞的方法。胸腺组织经机械破碎后，进行多步酶消化处理，所得细胞悬液通过Percoll密度梯度离心进行富集。对于髓系树突状细胞（CD11c+）的分离，采用磁性细胞分选法从低密度组分（LDF）中免疫富集目标细胞。TEC群体（mTEC、cTEC）的富集则是通过从Percoll低密度细胞组分中去除造血系（CD45hi）细胞实现，随后利用特异性细胞标志物通过荧光激活细胞分选（FACS）完成进一步分离。所获得的细胞可用于多种下游应用。

本方案中使用的起始材料为接受矫正性心血管手术的儿童所切除的胸腺组织（德国图宾根大学医院胸心血管外科提供），在获得知情同意并遵循机构指导原则的前提下获取。这种废弃组织的大小差异较大，可从2-30克甚至更大。所获得的成熟树突状细胞（mDC）以及胸腺上皮细胞亚群（cTEC和mTEC）的数量取决于用于分离的胸腺组织样本的大小及其年龄。
图2 显示从一名六岁儿童获取的一块较大的组织（约9 cm）。本方案中一个重要的初步准备步骤是清除组织中不需要的部分（由白色箭头指示）。
胸腺组织按照方案第2节和3.1节所述方法处理，以获得单细胞悬液，并通过单次Percoll密度梯度离心进行分离。单细胞悬液中约含有3%的HLA-DR+细胞（图3A），经Percoll离心后，该比例在低密度组分（LDF，含有较大细胞）中升高至15–40%，而主要由均一的小型胸腺细胞组成的高密度组分（HDF）则几乎不含此类细胞（图3B）。随后收集富含抗原呈递细胞（APC）的目...

本方案详细介绍了通过一系列酶消化步骤从人胸腺中分离抗原提呈细胞的方法，随后对单细胞悬液进行密度梯度离心，最后通过磁珠分选和/或荧光激活细胞分选（FACS）分离目标细胞群体。

在此方案中，我们提供了一种从人胸腺中分离树突状细胞（DC）和胸腺上皮细胞（TEC）的方法。DC和TEC是主要的抗原呈递细胞……

本实验的总体目标是从人胸腺中分离树突状细胞和上皮细胞。首先通过机械破碎法将解剖获得的组织剪碎，实现组织的初步解离。随后，利用酶消化法进一步处理组织碎片，以获得单细胞悬液。最后，通过 Percoll 分离法对细胞悬液进行富集，以获得低密度的细胞组分。最终，可利用磁性分选或流式分选，或两种方法结合，从该组分中分离出树突状细胞和上皮细胞。本文所介绍的方法为成功分离并进一步研究存在于人胸腺中的稀有细胞群体（如树突状细胞和胸腺上皮细胞）提供了一种高效、可重复且经济的实验流程。我实验室的一名研究生 I rotta 将为您演示该操作步骤。首先，将胸腺组织放入含有无菌室温 PBS 的培养皿中，冲洗掉任何残留的血液。然后向培养皿中加入新鲜 PBS，使用镊子和剪刀清除所有血块、结缔组织和脂肪组织，以及任何看起来不健康的组织部分。待胸腺组织清洗干净后，称重以作参考，然后将组织切成大小均匀的1厘米³组织块。接着用PBS覆盖组织块，并置于冰上。随后用一支10至20毫升无菌注射器活塞的尾部，迅速对组织施加轻微压力，以去除大部分胸腺细胞，并减少待消化组织的总体积。溶液将变得明显浑浊。当胸腺细胞释放出来后，轻轻搅拌培养皿，然后使用玻璃吸管小心吸走上清液，注意不要意外吸走组织块。可使用无菌细胞刮棒将所有组织块集中到培养皿的一侧，然后将培养皿倾斜至45度角，吸除剩余的上清液。用新鲜的PBS冲洗培养皿，并继续收集上清液，直至PBS相对透明。最后用RPMI进行一次洗涤，然后使用锋利的剪刀将组织尽可能剪碎，至少剪至足够细小以通过5毫升移液管，以便分离树突状细胞（dendritic cells或dc）。首先将每5克组织对应10毫升胶原酶DNA溶液和10毫升RPMI的比例，将最多10克的网状组织碎片放入50毫升离心管中。然后将组织悬液置于37摄氏度的恒温孵育箱中，在缓慢旋转条件下孵育40分钟。随着细胞释放到酶溶液中，溶液会逐渐变浑浊。消化结束后，将细胞悬液在室温下以110 ×g离心2分钟，使组织碎片沉淀，收集上清液，再将细胞悬液重新离心形成沉淀。此次弃去上清液，将细胞重悬于 10 至 50 毫升完全 RPMI 培养基中。根据细胞沉淀的大小，通过台盼蓝排斥法测定活细胞数量，然后将细胞悬液置于 37 摄氏度、松盖的培养瓶中，以分离胸腺上皮细胞或 T 细胞。接下来，将组织残余物重悬于 10 毫升新鲜胶原酶-DNA 溶液中，并加入 10 毫升 RPMI 和胰蛋白酶-EDTA。将组织碎片在37摄氏度下轻轻旋转孵育40分钟以进一步消化。在孵育的最后10至15分钟内，按1:5的比例加入胎牛血清以中和胰蛋白酶。离心沉淀组织碎片后，收集上清液，并再次离心沉淀细胞悬液。此次需仔细吸除并弃去上清液，注意保留松散的沉淀。计数活细胞数量后，也将该细胞悬液置于37摄氏度环境中。为富集低密度组分（LDF）细胞，首先将之前为树突状细胞（DC）和T细胞富集而保留的细胞悬液进行离心沉淀，同时让细胞完成离心过程。建立密度为1.07克/毫升的细胞密度梯度。根据此表格，将两个沉淀均重悬于6毫升预先配制的密度梯度溶液中，使细胞浓度达到每毫升1×10⁹个细胞。充分混匀细胞悬液以获得均一的悬浮液，随后将悬液转移至50毫升Oakridge聚碳酸酯螺口离心管中。接下来，使用移液器将每管 30 毫升完全 RPMI 培养基缓慢地铺加在 Percoll 细胞悬液上方。注意避免混合各层，小心将试管转移至预冷的带有固定角转子的离心机中，离心分离 35 分钟。然后使用无菌移液器小心地将界面处富含低密度细胞的组分（位于 Percoll 层与培养基之间）转移至含有冷的完全 RPMI 培养基的 50 毫升试管中。然后，我用额外的完全RPMI培养基填充试管，以稀释残留的细胞。最后，用不完全RPMI洗涤富集的细胞两次，再将细胞沉淀重悬于新鲜培养基中，并测定活细胞数量。在本图中，展示了一块刚获取的、来自一名6岁儿童的较大组织样本，大小约为9厘米。一个重要的初始步骤是清除组织中的不需要部分。如白色箭头所示，随后获得胸腺组织的单细胞悬液，并富集低密度组分细胞。虽然典型的单细胞悬液在密度梯度分离后大约含有3%的H-L-A-D-R阳性细胞，但在大尺寸细胞中，这一比例可增加至15%至40%。高密度组分中的低密度组分，主要由大小均一的小型胸腺细胞组成。此类细胞几乎不存在。胸腺。髓系树突状细胞可通过表达多种表面标志物来鉴定，其中包括CD11c。该图显示了在分离后，使用改良的磁性细胞分离方案高效分离CD11c阳性细胞的结果。通过免疫染色分析分离的细胞，证实CD11c阳性树突状细胞的纯度为93%。平均而言，每10^9个总胸腺细胞可获得5×10^5至5×10^6个CD11c阳性髓系树突状细胞。本表格展示了来自不同年龄和组织重量的多个胸腺样本的代表性数据，包括输入的单细胞悬液数量、总低密度组分细胞数，以及抗原呈递细胞富集组分中后续获得的CD11c阳性细胞的得率和纯度。大约0.5%的细胞为CD45低表达EPCA阳性或CD45阴性EPAM阳性的皮质上皮细胞和髓质上皮细胞，这些细胞可从胰蛋白酶消化后的CD45低表达或阴性富集的基质细胞中分选获得，分别表现为EPAM低表达且CDR2阳性，以及EPAM高表达且CD2阴性。该方法可用于从人胸腺中分离树突状细胞和胸腺上皮细胞亚群。该操作具有时间敏感性。越快完成超声处理步骤，细胞的状态就越好。一旦掌握本方案，可在五到六小时内分离出树突状细胞，八到十小时内分离出胸腺上皮细胞。观看本视频后，您将充分掌握如何处理人胸腺组织以成功分离树突状细胞和胸腺上皮细胞。分离得到的细胞可用于多种后续实验，进一步表征这些细胞并深入理解其生物学特性。

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