从人胸腺中分离髓系树突状细胞和上皮细胞

本实验的总体目标是从人胸腺中分离树突状细胞和上皮细胞。首先通过机械破碎法将解剖获得的组织剪碎，实现组织的初步解离。随后，利用酶消化法进一步处理组织碎片，以获得单细胞悬液。

最后，通过 Percoll 分离法对细胞悬液进行富集，以获得低密度的细胞组分。最终，可利用磁性分选或流式分选，或两种方法结合，从该组分中分离出树突状细胞和上皮细胞。本文所介绍的方法为成功分离并进一步研究存在于人胸腺中的稀有细胞群体（如树突状细胞和胸腺上皮细胞）提供了一种高效、可重复且经济的实验流程。

我实验室的一名研究生 I rotta 将为您演示该操作步骤。首先，将胸腺组织放入含有无菌室温 PBS 的培养皿中，冲洗掉任何残留的血液。然后向培养皿中加入新鲜 PBS，使用镊子和剪刀清除所有血块、结缔组织和脂肪组织，以及任何看起来不健康的组织部分。

待胸腺组织清洗干净后，称重以作参考，然后将组织切成大小均匀的1厘米³组织块。接着用PBS覆盖组织块，并置于冰上。随后用一支10至20毫升无菌注射器活塞的尾部，迅速对组织施加轻微压力，以去除大部分胸腺细胞，并减少待消化组织的总体积。

溶液将变得明显浑浊。当胸腺细胞释放出来后，轻轻搅拌培养皿，然后使用玻璃吸管小心吸走上清液，注意不要意外吸走组织块。可使用无菌细胞刮棒将所有组织块集中到培养皿的一侧，然后将培养皿倾斜至45度角，吸除剩余的上清液。

用新鲜的PBS冲洗培养皿，并继续收集上清液，直至PBS相对透明。最后用RPMI进行一次洗涤，然后使用锋利的剪刀将组织尽可能剪碎，至少剪至足够细小以通过5毫升移液管，以便分离树突状细胞（dendritic cells或dc）。首先将每5克组织对应10毫升胶原酶DNA溶液和10毫升RPMI的比例，将最多10克的网状组织碎片放入50毫升离心管中。

然后将组织悬液置于37摄氏度的恒温孵育箱中，在缓慢旋转条件下孵育40分钟。随着细胞释放到酶溶液中，溶液会逐渐变浑浊。消化结束后，将细胞悬液在室温下以110 ×g离心2分钟，使组织碎片沉淀，收集上清液，再将细胞悬液重新离心形成沉淀。

此次弃去上清液，将细胞重悬于 10 至 50 毫升完全 RPMI 培养基中。根据细胞沉淀的大小，通过台盼蓝排斥法测定活细胞数量，然后将细胞悬液置于 37 摄氏度、松盖的培养瓶中，以分离胸腺上皮细胞或 T 细胞。接下来，将组织残余物重悬于 10 毫升新鲜胶原酶-DNA 溶液中，并加入 10 毫升 RPMI 和胰蛋白酶-EDTA。

将组织碎片在37摄氏度下轻轻旋转孵育40分钟以进一步消化。在孵育的最后10至15分钟内，按1:5的比例加入胎牛血清以中和胰蛋白酶。离心沉淀组织碎片后，收集上清液，并再次离心沉淀细胞悬液。

此次需仔细吸除并弃去上清液，注意保留松散的沉淀。计数活细胞数量后，也将该细胞悬液置于37摄氏度环境中。为富集低密度组分（LDF）细胞，首先将之前为树突状细胞（DC）和T细胞富集而保留的细胞悬液进行离心沉淀，同时让细胞完成离心过程。

建立密度为1.07克/毫升的细胞密度梯度。根据此表格，将两个沉淀均重悬于6毫升预先配制的密度梯度溶液中，使细胞浓度达到每毫升1×10⁹个细胞。充分混匀细胞悬液以获得均一的悬浮液，随后将悬液转移至50毫升Oakridge聚碳酸酯螺口离心管中。

接下来，使用移液器将每管 30 毫升完全 RPMI 培养基缓慢地铺加在 Percoll 细胞悬液上方。注意避免混合各层，小心将试管转移至预冷的带有固定角转子的离心机中，离心分离 35 分钟。然后使用无菌移液器小心地将界面处富含低密度细胞的组分（位于 Percoll 层与培养基之间）转移至含有冷的完全 RPMI 培养基的 50 毫升试管中。

然后，我用额外的完全RPMI培养基填充试管，以稀释残留的细胞。最后，用不完全RPMI洗涤富集的细胞两次，再将细胞沉淀重悬于新鲜培养基中，并测定活细胞数量。在本图中，展示了一块刚获取的、来自一名6岁儿童的较大组织样本，大小约为9厘米。

一个重要的初始步骤是清除组织中的不需要部分。如白色箭头所示，随后获得胸腺组织的单细胞悬液，并富集低密度组分细胞。虽然典型的单细胞悬液在密度梯度分离后大约含有3%的H-L-A-D-R阳性细胞，但在大尺寸细胞中，这一比例可增加至15%至40%。

高密度组分中的低密度组分，主要由大小均一的小型胸腺细胞组成。此类细胞几乎不存在。胸腺。

髓系树突状细胞可通过表达多种表面标志物来鉴定，其中包括CD11c。该图显示了在分离后，使用改良的磁性细胞分离方案高效分离CD11c阳性细胞的结果。通过免疫染色分析分离的细胞，证实CD11c阳性树突状细胞的纯度为93%。平均而言，每10^9个总胸腺细胞可获得5×10^5至5×10^6个CD11c阳性髓系树突状细胞。

本表格展示了来自不同年龄和组织重量的多个胸腺样本的代表性数据，包括输入的单细胞悬液数量、总低密度组分细胞数，以及抗原呈递细胞富集组分中后续获得的CD11c阳性细胞的得率和纯度。大约0.5%的细胞为CD45低表达EPCA阳性或CD45阴性EPAM阳性的皮质上皮细胞和髓质上皮细胞，这些细胞可从胰蛋白酶消化后的CD45低表达或阴性富集的基质细胞中分选获得，分别表现为EPAM低表达且CDR2阳性，以及EPAM高表达且CD2阴性。该方法可用于从人胸腺中分离树突状细胞和胸腺上皮细胞亚群。

该操作具有时间敏感性。越快完成超声处理步骤，细胞的状态就越好。一旦掌握本方案，可在五到六小时内分离出树突状细胞，八到十小时内分离出胸腺上皮细胞。

观看本视频后，您将充分掌握如何处理人胸腺组织以成功分离树突状细胞和胸腺上皮细胞。分离得到的细胞可用于多种后续实验，进一步表征这些细胞并深入理解其生物学特性。