一种用于研究趋化因子引导细胞在生理流体条件下循环并外渗的新型三维流动腔装置

以下实验的总体目标是定量测量循环细胞向趋化因子梯度迁移的能力。在生理性的剪切应力条件下，首先将内皮细胞培养于经胶原蛋白包被的微孔插入膜上形成单层，然后将其组装到流室系统中，覆盖在含有趋化因子的静态隔室上方。随后对细胞施加剪切应力，以模拟血管系统中的生理条件。

作为第二步，让待测细胞（如白细胞、干细胞或肿瘤细胞）在循环过程中流经3D系统。静态室中的成分会影响循环细胞与内皮细胞之间相互作用的效率，进而影响待测细胞穿越内皮层的跨内皮迁移速率。随后，拆解3D系统，并从下方的静态室中收集已迁移的待测细胞，以便利用多种先进的方法对细胞迁移情况进行定量分析。所得结果可反映在生理流动条件下，循环中的待测细胞与内皮细胞相互作用的能力，以及其根据静态室中趋化因子浓度脱离循环的能力。

与现有的平行板层流室和静态转移实验等方法相比，该技术的主要优势在于它结合了上层腔室中的剪切应力和下层静态腔室中的趋化因子梯度。这使得研究人员能够定量测量循环细胞向趋化因子梯度的外移以及在生理流动条件下的行为。该方法还可用于研究局部微环境中的细胞与内皮细胞之间相互作用对循环细胞外渗的影响。

在内皮细胞下方的独立插件上添加另一层细胞，以演示该实验步骤。本实验操作将由我实验室的技术员 Valentina against rova 进行。首先，计算实验所需的插件数量，并将每个插件放入单独的无菌培养皿中。根据各自的设置，通过γ射线辐照进行灭菌，直至总剂量达到11 gray。

然后用储存于 4°C 的 0.01 摩尔盐酸将储备胶原蛋白 I 型溶液稀释至 50 微克/毫升，并为每个插入物准备 154 微升该终浓度溶液的分装 aliquot。接下来，将 ECL 溶液中的数滴液体以环形模式滴加到插入物表面。

然后将剩余的等分试样加入，使插入物表面形成一个较大的液滴。确保移液器吸头在任何步骤中均不接触插入物，并确保胶原蛋白覆盖插入物的整个表面，但不流失。一旦插入物表面被覆盖，盖上培养皿的盖子，并小心地将其放置在平坦的表面上。

孵育插入物在室温下1小时，孵育后吸出胶原溶液，并用160 µL PBS洗涤膜。然后吸去PBS。盖上盖子，并用帕拉膜包裹培养皿。

如果插入物将在当天使用，请将培养皿置于室温下的干燥处。否则，将培养皿置于4°C保存，并在七天内使用插入物。在使用前立即收集培养的人脐静脉内皮细胞，并将其重悬于所需培养基中，浓度为每毫升250万个细胞。

计数细胞时，使用台盼蓝检测确保细胞活力高于 98%，然后将 160 µL 细胞悬液加入每个插入物中。先在胶原包被的插入物表面以环形方式滴加数个小液滴，再小心地将剩余细胞悬液加至中央，形成一个大液滴。操作完成后，盖上培养皿盖子，轻柔地将培养皿放入 37 °C、含 5% CO₂ 的培养箱中，孵育 30 分钟，使细胞贴附于膜上。

30分钟后，从培养箱中取出培养板，轻轻在每个插入物上加入5毫升预热的培养基，注意确保插入物仍位于培养皿底部并完全被培养基覆盖。然后盖上盖子，小心地将培养皿放回培养箱中继续培养。

将细胞在37摄氏度下培养过夜。组装流式室时，首先将上板和下板拧紧固定，然后使用内径1.42毫米、壁厚0.8毫米的PVC管将两板连接至气体交换装置。

接下来，将组装好的装置放入干净的塑料袋中，并通过γ射线辐照进行灭菌，直至总剂量达到11戈瑞。下一步是取出培养箱托盘，将其放入无菌细胞培养操作台中，并用70%乙醇进行表面消毒。然后用一张大的无菌纸巾覆盖托盘。

接下来，将装置从塑料袋中取出，并放置在无菌培养箱托盘上。然后将装置连接至蠕动泵，并将泵设置为以 0.2 毫升/分钟的速度运行。用移液器吸取 5 至 7 毫升所需培养基，加入无菌的 15 毫升离心管中，用于进液端。

然后，使用无菌小纱布包裹管路，将金属针头从管路中拔出，从而将入口管路与出口断开，保持管路无菌；将金属进液针插入含有培养基的15毫升离心管中，并将出液管插入另一个空的15毫升离心管中。接着，启动泵，使液体流动方向为逆时针。利用负压使培养基从15毫升进样管经管路吸入，当培养基流至即将进入装置前的管路末端时，停止泵的运行。

然后通过拧开管板打开装置，小心取下上层板，用移液器将1500至1550微升培养基加入下层孔中，确保各孔中含有足够的培养基，以形成高出下层板1至2毫米的半球形液面。接着，将已准备好的插入式培养小室从培养皿转移至下层板的孔中。使用无菌镊子操作，确保插入物下方无气泡滞留，并吸除出现在下层板表面的任何培养基。

然后将上层板重新放回下层板上并重新连接。使用螺丝立即启动蠕动泵，使培养基流经3D装置。抬高装置的出口端，并保持腔室处于此位置，以防止在两板之间的空间内形成气泡。

继续用培养基填充连接腔室与气体交换单元的管路，直至培养基到达气体交换单元。随后，向气体交换单元中加入3 mL培养基。打开泵，使气泡通过泵排出。

将装置抬高，使培养基充满从装置中引出的管路，并在培养基距离管路末端2至3厘米时停止泵送。待管路完全引流通畅后，使用无菌小纱布将进液针与出液管连接。然后反转泵的方向，使培养基顺时针流向气体交换装置，并确保排尽所有残留的气泡。

再次使泵以逆时针方向流动。向气体交换单元中加入 100 µL 的待测细胞悬液，然后关闭呼吸仪的盖子。

将培养皿放回培养箱，使测试细胞在37摄氏度下于装置内循环。达到预定时间后，从培养箱中取出带有工作系统的培养皿并放入生物安全柜中。停止泵运行，断开进液口和出液口，并将管端插入空的无菌15毫升离心管中。

然后打开泵，从系统中收集细胞悬液。将细胞悬液置于冰上保存，直至使用。接着，通过卸下螺钉并取下上层板来拆卸腔室。

从下层板中取出插入物，并将其转移至培养皿中进行染色或细胞收集。最后，从下层孔中移除细胞悬液，并将其放入15毫升离心管中。用1.5毫升培养基将每个孔冲洗两次，并将冲洗液加入相应的离心管中。

然后以200 × g离心试管5分钟，并根据具体实验目标对细胞进行处理，实验目标可参见随附文本方案中所列内容。以下是利用该系统可开展的众多检测示例之一。实验装置包括在插入物上培养骨髓来源的内皮细胞，插入物下方含有5微米孔径的滤膜，在插入物下方的基质细胞衍生因子1（SDF-1）以0、5或50纳克/毫升的浓度加入。

让骨髓细胞在3D系统中循环。收集穿过插入物的细胞，然后将其接种于含有甲基纤维素培养基的培养板中进行培养。在存在造血生长因子的条件下，祖细胞形成集落，14天后计数集落数量，以确定每孔中祖细胞的数量，并揭示其向sdf迁移的能力。

在生理流动条件下，当静态培养室的下层插入物上添加了培养的基质成纤维细胞后，相较于仅加入SDF-1的情况，在SDF-1浓度为每毫升50纳克时，有更多造血细胞从循环体系迁移进入培养室。该技术的建立为医学与生物科学不同领域的研究人员提供了在体外模拟特定组织血管床的途径，并可用于探索循环细胞向正常组织与病变组织迁移过程中的细胞与分子机制。