一种新型三维流室装置研究生理流量条件下的趋化因子的细胞循环外渗
July 15th, 2013
的三维流室装置是一种新型的在体外
以下实验的总体目标是定量测量循环细胞向趋化因子梯度的方向。在生理纯粹应激条件下，这是通过首先将单层内皮细胞培养到胶原蛋白包被的微孔插入物上，然后将它们组装到流动室中，在那里它们覆盖一个包含趋化因子的单独静态隔室来实现的。然后对细胞施加剪切应力，以模拟脉管系统中的生理条件。
作为第二步，测试感兴趣的细胞，如白细胞、干细胞或肿瘤细胞，在循环过程中允许在 3D 系统中循环。静态隔室中的内容物会影响循环细胞和内皮细胞之间相互作用的效率，从而影响测试细胞跨内皮层的迁移速率。接下来，拆卸 3D 系统并从下部静态室收集反式迁移的测试细胞，以便使用各种最先进的方法定量测量细胞化，获得的结果显示循环测试细胞在生理流动条件下与内皮细胞相互作用的能力，并根据静态室中趋化因子的浓度退出循环。
与使用平行层流室和静态转移测定等现有方法相比，该技术的主要优点是它结合了上室的 she 应力和下部静态室中的 kines。这使研究人员能够定量测量循环细胞对 kin 梯度和生理流动条件的外化。该方法还可用于研究局部微环境细胞和内皮细胞之间的串扰对循环细胞外渗的影响。
通过在内皮细胞下方的单独插入物上辅助额外的细胞层来演示该程序，这将是 Valentina 对抗我实验室的技术人员 rova。首先，计算实验所需的插入片段数量，并将每个插入片段放入单独的无菌培养皿中。根据个人设置，通过伽马辐照对它们进行消毒，直到总剂量达到 11 戈瑞。
然后稀释原液胶原蛋白。使用储存在 4 摄氏度的 0.01 摩尔盐酸，将 1 溶液定为 50 μg/mL，并为每个插入片段制备 154 微升等分试样的最终溶液。接下来，将一个 Eloqua 的几滴水以圆形形式滴到插件表面。
然后加入其余的等分试样，在插入表面上形成一大滴。确保移液器吸头在任何位置都不接触插件，并且胶原蛋白覆盖了插件的整个表面，但不会流走。盖上插件后，将盖子放在培养皿上，然后小心地将其放在平坦的表面上。
孵育后，将插入片段在室温下孵育 1 小时，吸出胶原蛋白溶液并用 160 μL PBS 洗涤膜。然后吸出 PBS。盖上盖子，用 paraform 包裹盘子。
如果插入物将在同一天使用，请将培养皿置于室温下的干燥处。否则，将培养皿置于 4 摄氏度，并在 7 天内使用插件。在使用前收获培养的人脐静脉内皮细胞，并以每毫升 250 万个细胞的浓度重新悬浮于所需的培养基中。
计数细胞时，使用 trian blue 确保细胞活力大于 98%，然后将 160 μL 细胞悬液添加到每个插入片段中。首先将几个小滴剂以圆圈的形式滴在胶原蛋白涂层插入物的表面，然后小心地加入其余的细胞悬液以形成一个大滴。完成后，盖上盖子，小心地将培养皿放入 37 摄氏度、含有 5% 二氧化碳的培养箱中，孵育 30 分钟，让细胞附着在膜上。
30 分钟后，从培养箱中取出板，并在每个插件上轻轻添加 5 mL 预热培养基。注意确保插入物留在培养皿的底部并完全被培养基覆盖。然后盖上盖子，小心地将培养皿放回培养箱培养物中。
细胞在 37 摄氏度下过夜。要首先组装流通室，请将上下板拧在一起。然后使用 1.42 毫米孔径、0.8 毫米厚壁的 PVC 管将板连接到气体交换装置。
接下来，将组装好的装置放入干净的塑料袋中，并通过伽马射线照射对其进行消毒，直到总剂量达到 11 戈瑞。下一步是取出培养箱托盘，将其放入无菌组织培养罩中，并用 70% 乙醇消毒。然后用一张大的无菌餐巾盖住托盘。
接下来，从塑料袋中取出设备并将其放在无菌培养箱托盘上。然后将设备连接到蠕动泵，并对泵进行编程，使其以每分钟 0.2 毫升的速度运行。将 5 至 7 mL 所需培养基移液到无菌 15 mL 试管中，用于进样口。
然后，使用小的无菌餐巾纸将金属针从管道中拉出，以断开入口管与出口的连接，以保持管道的无菌性，将金属入口针头放入装有培养基的 15 毫升管中，并将出口管放入空的 15 毫升管中。接下来，打开泵，使流动逆时针方向。让负压将介质从 15 mL 入口管吸入管道中，并在介质到达管道末端时停止泵，然后再进入设备。
然后拧下管板打开设备，小心地将上板移液管 1500 至 1， 550 微升培养基移入下孔中，确保孔中含有足够的培养基以形成一个半球，达到下板上方 1 至 2 毫米。接下来，将准备好的插入物从培养皿转移到下板的孔中。使用无菌镊子，确保插入物下方没有气泡，并吸出出现在下板表面的任何介质。
然后将上板放回下板上并重新连接。使用螺钉立即打开蠕动泵，让介质流过 3D 设备。抬高设备的出口端并将腔室保持在该位置，以防止在板之间的空间内形成气泡。
继续用介质填充将腔室连接到气体交换装置的管道，直到它到达气体交换装置。接下来，将 3 毫升培养基放入气体交换装置中。打开泵，让气泡通过它逸出。
抬高装置，让介质充满从其流出的管道，并在介质结束前 2 到 3 厘米时停止泵。完全灌注后，使用无菌小餐巾纸将入口针连接到出口管。然后反转泵，使介质顺时针流向气体交换装置，并确保去除任何残留的气泡。
泵再次逆时针流动。将 100 微升测试细胞悬液添加到气体交换装置中。然后盖上呼吸器的盖子。
将托盘放回培养箱中，让测试细胞在 37 摄氏度下在设备中循环。所需时间过后，从培养箱中取出装有工作系统的托盘，并将其放入通风橱中。停止泵，断开入口和出口，将末端放入 15 毫升无菌空管中。
然后打开泵并从系统中收集细胞悬液。将细胞悬液置于冰上直至使用。接下来，通过卸下螺钉并提起上板来拆卸腔室。
从下板中取出插入物，并将其转移到培养皿中进行染色或细胞收集。最后，从下孔中取出细胞悬液，并将其放入 15 毫升试管中。用 1.5 ml 培养基冲洗每个孔两次，然后加入相应的试管中。
然后以 200 Gs 离心试管 5 分钟，并根据特定的实验目标（如随附文本实验方案中列出的目标）处理细胞。以下是可以使用此系统执行的众多测试之一的示例。该设置包括镜像骨髓来源的内皮细胞生长在插入片段上，插入片段下方有 5 个微孔，基质细胞来源的因子 1 或 SDF 1 以 0、5 或 50 ng/mL 的浓度添加。
允许骨髓细胞在 3D 系统中循环。收集通过插入片段迁移的细胞，然后在含有甲基纤维素培养基的平板上培养。在导致祖细胞形成集落的造血生长因子存在的情况下，在 14 天后对集落数量进行评分，以确定每个孔中的祖细胞数量并揭示它们向 SDF 迁移的能力。
一个在生理流动的条件下。随着在静态室的下插入物上生长的基质成纤维细胞的增加，随着 sdf 的加入，更多的造血细胞从循环中迁移到腔室中，一个以每毫升 50 纳克的速度迁移到一个，而不是单独使用 SDF 一个在它发育后。这项技术为医学和生物科学不同领域的研究人员在体外模拟组织特异性血管床并探索细胞和分子机制铺平了道路，介导循环细胞向正常组织迁移至患病组织。
概述
三维流动室装置是一种新型的体外技术，旨在定量评估生理剪切应力下细胞的血管外迁移级联。该装置对于推进细胞迁移的基础、临床前和临床研究至关重要。
关键研究组成部分
科学领域
- 细胞迁移
- 血管外迁移过程
- 体外实验技术
背景
- 理解细胞迁移对于各种生物过程至关重要。
- 血管外迁移是免疫反应和癌症转移的关键步骤。
- 现有的方法通常缺乏有效模拟生理条件的能力。
- 3D流动室的开发解决了这些局限性。
研究目的
- 定量测量循环细胞向趋化因子梯度的迁移。
- 使用剪切应力模拟血管内生理条件。
- 评估循环细胞与内皮细胞之间的相互作用。
使用的方法
- 在胶原蛋白涂层的插入物上培养内皮细胞。
- 组装流动室以施加剪切应力。
- 允许测试细胞循环并与内皮层相互作用。
- 收集并定量测量跨膜迁移的细胞。
主要结果
- 该装置允许在生理流动下测量细胞相互作用。
- 结果表明趋化因子浓度影响细胞跨膜迁移率。
- 该方法比传统的静态检测方法具有优势。
- 它能够研究微环境对细胞血管外迁移的影响。
结论
- 3D流动室是研究细胞迁移的重大进步。
- 这项技术可以增强我们对免疫反应和癌症生物学的理解。
- 未来的应用可能包括研究各种类型的细胞和条件。
常见问题
Executive Industry Relevance
The 3D flow chamber device enables quantitative assessment of chemokine-directed cell extravasation under physiological shear stress, addressing a critical gap in preclinical models of cell migration. By integrating flow dynamics with chemotactic gradients, it improves predictive confidence in evaluating therapeutic candidates targeting cell trafficking processes such as stem cell homing and tumor metastasis. This supports early-stage target validation and mechanistic de-risking in discovery pipelines focused on migration-modulating interventions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses involving chemokine receptor signaling and endothelial interactions under flow.
- Operational Value: Provides quantitative readouts of cell rolling, adhesion, and transmigration to de-risk target mechanisms.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by correlating in vitro migration with chemokine gradient potency.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, reproducible extracellular matrices and endothelial monolayers for consistent compound screening.
- Quantitative Output: Measures migrated cell counts as a functional endpoint for dose-response analysis of migration inhibitors.
- Scalability: Compatible with multi-insert formats to enable parallel testing of chemokine concentrations or drug candidates.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models pathophysiological extravasation in inflammation and metastasis using patient-derived or diseased cell types.
- Translational Continuity: Bridges in vitro findings to in vivo expectations by simulating vascular shear and chemokine gradients.
- Risk-Adjusted Decisions: Informs go/no-go criteria based on migration efficacy under physiologically relevant conditions.
Pipeline & Workflow Integration
The device fits within the discovery continuum from target engagement to lead optimization, particularly for biologics or small molecules modulating cell migration.
- Discovery Biology: Supports mechanistic interrogation of chemokine gradients and endothelial crosstalk in cell migration pathways.
- Screening: Enables standardized assessment of compound effects on transmigration under shear stress.
- Analytics: Delivers quantitative cell migration metrics that allow comparison across experimental conditions.
- Translational Research: Models microenvironmental influences on extravasation using co-culture of stromal or tumor-associated cells.
- Enterprise Reuse: Functions as a modular platform adaptable to various cell types, chemokines, and shear stress settings across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in migration assays by incorporating physiological flow and gradient dynamics.
- Operational Value: Standardizes extravasation assessment through defined shear stress, insert preparation, and collection protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing physiologically contextualized migration data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of migration-modulating candidates based on quantitative extravasation outcomes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, endothelial monolayer formation, and sterile fluid handling.
- Depends on peristaltic pumps, gas exchange units, and gamma irradiation for sterilization.
- Necessitates standardization of insert coating, cell seeding, and flow rate settings across teams.
- Adaptability to different cell types (e.g., leukocytes, stem cells, tumor cells) and inserts with varying pore sizes.
- Limited by the need for sterile assembly and optimization of chemokine concentrations in the lower compartment.
