Name: 潜在土壤胞外酶活性的高通量荧光测量 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-15T18:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 33 s
Description: 了解土壤胞外酶活性的高通量荧光测量方法，用于微生物生态学和土壤生物地球化学研究。该技术通过荧光底物释放定量分析酶活性，可同时处理大量样品，帮助研究人员深入理解微生物生理与生态系统过程之间的联系。

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本出版物由美国国家科学基金会（DEB# 1021559）资助的“环境中的酶研究协调网络”项目支持。本研究得到了美国国家科学基金会（DEB# 1021559）以及美国能源部科学办公室（生物与环境研究）的支持。本文材料中表达的任何观点、发现、结论或建议均为作者观点，不一定反映美国国家科学基金会（NSF）的观点。

1. 实验设置
<ol>
	<li>标记3个深孔板： &#34;样本&#34;, &#34;MUB 标准&#34;，以及 &#34;MUC 标准&#34;.</li>
	<li>将各标准品（MUB 浓度分别为 0、2.5、5、10、25、50 和 100 μM）以及底物（BG、CB、NAG、PHOS、XYL、AG、LAP）分别加入已预先标记的洁净储液槽中（按行排列）。</li>
	<li>将适量的MUB标准品加入MUB标准品板的相应孔中（表1).
	<ol>
		<li>将 200 μl 的 0 μM MUB 移液至 MUB 标准品板的 A 行。</li>
		<li>将 200 μl 的 2.5 μM MUB 加入 MUB 标准品板的 B 行。</li>
		<li>将200 μl的5 μM MUB移液至MUB标准品板的C行。</li>
		<li>将 200 μl 的 10 μM MUB 移液至 MUB 标准品板的 D 行。</li>
		<li>将200 μl的25 μM MUB移液至MUB标准品板的E行。</li>
		<li>将200 μl的50 μM MUB移液至MUB标准品板的F行。</li>
		<li>将200 μl的100 μM MUB移液至MUB标准品板的G行。</li>
		<li>重复步骤&#160;1.3.1 - 1.3.8&#160;将 MUC 标准品加入 MUC 标准品板的相应孔中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为每份土壤样品制备土壤悬液。
	<ol>
		<li>称取2.75 g田间湿润土壤放入搅拌器中。</li>
		<li>加入91 ml 50 mM缓冲液。高速混合1分钟。</li>
		<li>将搅拌器中的内容物倒入一个干净的玻璃碗中，碗的直径至少与8通道移液器相当，并放入一个搅拌子。</li>
		<li>置于搅拌器上，低速搅拌土壤悬液。</li>
		<li>将800 μl土壤悬液移液至样品板的第一列中（表2).</li>
		<li>重复一次st MUB标准品和MUC标准品板的列表1).</li>
		<li>用去离子水冲洗搅拌机、磁力搅拌器和搅拌子2O 或缓冲液用于土壤样品之间。</li>
		<li>重复步骤&#160;1.4.1 - 1.4.7）为每个样品操作，每处理一个后续土壤样品时移至下一列（表1 和&#160;2).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将适当的底物（在此示例中为200 μM浓度）移液至样品板的相应孔中（表 2).
	<ol>
		<li>将200 μl BG底物加入样品板的A排。</li>
		<li>将200 μl CB底物移液至样品板的B行。</li>
		<li>将200 μl NAG底物加入样品板的C行。</li>
		<li>将200 μl PHOS底物加入样品板的D行。</li>
		<li>将200 μl XYL底物加入样品板的E行。</li>
		<li>将 200 μl AG 底物移液至样品板的 F 行。</li>
		<li>将200 μl LAP底物加入样品板的G行。</li>
		<li>重复步骤 1.5.1 - 1.5.7&#160;每个孵育温度的样品板。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 检测板的孵育
<ol>
	<li>用板封膜将深孔板（&#34;Sample&#34;、&#34;MUB standard&#34; 和 &#34;MUC standard&#34;）密封。</li>
	<li>用手轻轻倒置每个（已密封的）板，直至溶液充分混匀（约10次）。</li>
	<li>将板放入相应的培养箱中，按照所需孵育时间进行孵育（表3）。</li>
	<li>记录初始时间为时间0。同时记录相应的孵育时间，以便知晓何时将板从培养箱中取出（表3）。</li>
	<li>每次孵育结束后，将密封的板在约2,900 × g 条件下离心3分钟。</li>
	<li>离心完成后，从孵育后的深孔板各孔中转移250 μl 液体至黑色平底96孔板的相应孔中（每个孵育后的深孔板使用一个黑色板）。重要的是，需将样品从孵育后的深孔板转移至黑色平底96孔板的相同孔位（即 A1…A12，等等）（表1、2）。</li>
</ol>
3. 微孔板荧光仪上的荧光测量
<ol>
	<li>根据所用荧光酶标仪的制造商说明，将激发波长设置为 365 nm，发射波长设置为 450 nm（或使用适当的滤光片）。</li>
	<li>在荧光计上读取三块板。重要提示：样品板和标准品板（i.e. MUB 或 MUC）必须使用相同的增益进行读数。
	<ol>
		<li>将光谱仪设置为自动增益，并读取 MUC 和 MUB 标准品板。</li>
		<li>将增益设置为手动模式，并将数值从最优值降低至下一个最低的、四舍五入到最接近 5 的整数，针对每块标准品板重复此操作 2 次。</li>
		<li>将增益设回自动模式并运行样品板。随后手动重新运行样品板，使其增益与每块标准品板（i.e. MUB 和 MUC）的最高增益相匹配。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 数据分析
<ol>
	<li>将MUB（表4a）和MUC标准品（表4b）的标曲荧光数据输入电子表格
	<ol>
		<li>将浓度单位从（μM）转换为（μmol）（表4a 和 表4b）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>针对每个样品的标曲荧光数据，计算MUB和MUC（μmol）标准浓度的斜率、y轴截距和R2值。每个样品的R2值应大于0.98（表4a 和 &#160;表4b）。建议使用散点图可视化标准曲线，其中荧光读数作为因变量（y轴），标准品浓度（μmol）作为自变量（x轴）（图1）。</li>
	<li>您将使用MUB和MUC标准曲线的斜率和y轴截距值，将样品+底物的原始荧光数据换算为潜在的胞外酶活性（EEAs）。首先需将样品+底物的原始荧光数据输入一个新的电子表格（表5a）。还需输入每个样品的孵育时间（hr）和土壤干重（表5b）。注意，本示例中输入的时间值为3小时，因为样品在25 °C下孵育（表3）。
	<ol>
		<li>从相应样品的荧光值中减去标准曲线的截距值，然后除以相应标准曲线的斜率（表5c）。为此，可将标准曲线方程重排以求解样品酶浓度（x）：x = (y - b) / m，其中：[y = 样品荧光原始读数；b = MUB或MUC标准曲线的截距；m = MUB或MUC标准曲线的斜率]。</li>
		<li>将步骤&#160;4.3.1&#160;中得到的样品μmol值乘以91 ml（土壤悬液中使用的缓冲液体积）（表5d）。</li>
		<li>将步骤&#160;4.3.2&#160;中得到的数值除以样品对应的孵育时间及干土壤质量（表5e）：[酶量（μmol）×&#160;91 ml ×&#160;孵育时间（hr）×&#160;干土壤质量（g）×&#160;0.8 ml ×&#160;1,000] 
		注：0.8 ml为每孔中使用的悬液体积，1,000用于校正每孔中的实际土壤量。</li>
		<li>将步骤&#160;4.3.3&#160;中得到的数值乘以1,000，以获得目标单位（nmol 活性/g 干土/hr）（表5f）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

基于实验室测定的潜在土壤胞外酶活性（EEA）可为微生物对其非生物环境的响应及其对生态系统功能的影响提供重要见解。本示例数据集的结果表明，不同气候处理样地之间的土壤酶活性或酶动力学差异较小。然而，样地间呈现相反的变化趋势，提示需进一步探究可能影响微生物EEA产生的协变量，例如土壤含水量、土壤pH或植物生长状况。总体而言，从以下四个方面评估EEA：（1）土壤中总体EEA水平，（2）EEA化学计量比，（3）阿伦尼乌斯图/活化能，以及（4）Q10，可提供一系列广泛的方法，用于表征反映生态系统尺度过程的土壤生态系统功能动态特征。
基于荧光的高通量 EEA 检测是一种有用的工具，广泛用于研究土壤及其他环境中潜在的 EEA。重要的是，潜在活性反映的是酶库的大小，但其本身并不能量化酶的生成或周转速率46。尽管该技术相对简单，但实验室间实验方案中看似微小的差异仍可能影响结果的可比性13。遗憾的是，目前我们尚无适用于 EEA 的标准化阳性对照。使用化学计量比是克服这些挑战的一种方法。此外，高通量技术的出现推动了环境酶学研究的发展4。对这些检测所产生的数据进行仔细解读，有助于揭示微生物活性的重要趋势。
该方案的稳健性源于能够针对不同样本选择特定条件，但这同样可能导致局限性。为确保对各个野外采样点的样本进行准确测量，需要进行一系列的优化调整：
缓冲液
所选缓冲液取决于土壤的pH值。缓冲液还能稳定荧光标准品的荧光强度，而荧光强度对pH高度依赖27,47。我们通常用于制备土壤悬液的缓冲液是50 mM醋酸钠或Tris缓冲液，选择依据是缓冲液的特定酸解离常数（pKa），以最好地匹配土壤样品的pH水平。醋酸钠的pKa为4.76，Tris的pKa为8.06，因此需根据各个样品所需的pKa调整这两种缓冲液的用量。对于中性或弱碱性土壤，有研究建议使用磷酸盐缓冲液（pKa = 7.2）。然而，我们提醒在初步研究中应先检测该缓冲液可能引起的分析变异性，因为高浓度的磷酸盐可能干扰酶活性。
荧光底物的处理与保存
荧光检测可能受到杂质和/或许多荧光化合物在光照下不稳定性的干扰，因此在处理荧光底物时需格外小心。我们强烈建议尽量减少荧光标记底物以及MUB和MUC标准品的光照暴露。推荐使用棕色玻璃瓶，或对配制和储存荧光底物及标准品所用的玻璃器皿和容器进行遮光处理；用铝箔包裹玻璃器皿和容器效果良好。同样，平板接种后应尽快转移至避光培养箱中培养，这是最佳操作实践。我们建议将底物和标准品在-20 °C避光保存，且保存时间不超过两个月；在开始酶活性检测前约24–48小时，将底物于5 °C条件下解冻。
设计与重复
为了最大程度地控制孔间样本差异，建议设置阴性检测对照，并在可能的情况下进行检测重复。变异通常源于各孔中土壤颗粒数量的差异以及移液操作误差。因此，充分混匀和良好的移液技术将显著减少孔间差异。此外，我们强烈建议设置阴性检测对照（缓冲液 + 底物溶液），以监测底物随时间可能发生的变化。在读取酶标板时，可通过比较阴性对照孔（我们通常使用96孔板的最后一列）来轻松监控该变化。阴性底物对照通常应保持稳定，若信号显著高于检测限，则提示可能存在污染或底物不稳定，此时需要更换底物和/或标准溶液。
为最大限度提高通量，本方案在一个深孔微孔板中同时包含多种可能的EEA，而其他方案通常每个板仅进行一种类型的检测（即 每块平板使用一种底物），因为不同的胞外酶活性（EEAs）反应速率不同。然而，在采用高通量方法或单板法之前，必须首先对土壤样品进行酶促反应条件优化。如果在孵育时间内各酶的反应速率相对一致，也可在同一块平板上使用多种底物。
本方案建议使用约 2.75 g 土壤制备泥浆溶液，而其他方案通常建议使用约 1 g 土壤24。我们建议在条件允许的情况下使用更多土壤，这是一种更有效地反映样品内土壤酶活性水平变异的有效方法。在本方案中，我们将 800 μl 土壤泥浆与 200 μl 底物共同孵育，而其他方法通常仅将 200 μl 土壤泥浆与 50 μl 底物孵育。这仅仅是按比例放大的结果，最终不会改变测得的酶活性。使用较大体积还具有若干实际优势：第一，在将样品移入黑色平底 96 孔板并用荧光计记录荧光强度之前，较大体积更易于避免移液时吸入土壤颗粒；第二，在将黑色平底 96 孔板转移至荧光计进行酶相关荧光强度检测过程中，若发生意外洒漏，额外的体积可提供缓冲余地。即使孔间体积存在微小差异，也可能显著降低荧光信号。最后，由于本方案具有高通量特性，我们通常选择依赖实验重复来反映酶活性水平的变异，而非进行分析重复（assay replicates）。尽管包含分析重复始终是最佳实践，但在实际操作中，我们认为在资源有限的情况下，本方案在分析重复与实验重复之间提供了合理的权衡。同样，本方法在每次测定中使用了相对更多的充分均质化土壤（2.75 g）25，这本身有助于降低土壤内部的变异。是否采用分析重复应通过预实验评估分析误差后谨慎决定48。然而，我们建议：对于处理组重复少于 4 次的实验设计，应强烈考虑使用测定重复（assay replicates）。
土壤、缓冲液体积和底物浓度的优化
土壤缓冲液与底物的浓度比例是进行酶活性测定时影响荧光测定值的一个重要变量。根据土壤样品中酶的活性，可能需要调整加入测定体系的土壤悬液中的土壤量或底物浓度。本示例中所选用的用量是基于对这些土壤的前期测试结果，以确保底物供应充足、不成为限制因素，从而在测定条件下测量的是酶的最大潜在反应速率（Vmax）44,45。然而，对于酶浓度较高的土壤样品，则必须增加土壤用量或提高底物浓度。我们发现，提高底物浓度（并相应调整标准曲线）可能会影响曲线的线性关系。因此，建议根据需要减少土壤用量，和/或按比例调整缓冲液体积。无论如何，针对每种被测土壤类型优化底物浓度至关重要，因为在底物饱和与未饱和条件下所测得的胞外酶活性（EEAs）可能相差一个数量级以上26。因此，在底物未饱和条件下，不同实验处理之间（例如）的差异更容易出现II类统计学错误，且更难以被检测到，并增加统计误差27,35。为了优化底物浓度，应首先选取具有代表性的土壤样品，使用一系列广泛的底物浓度进行初步酶活性测定。记录荧光值后，只需将数据绘制成图（类似于标准曲线示例；图1），找出酶活性（y轴）随底物浓度（x轴）变化时斜率趋于平缓（约等于0）的点。同样，斜率趋于平缓（约等于0）时对应的底物浓度，即可作为该特定土壤的最佳底物浓度的合理参考值。
该实验最终通过检测酶介导底物解聚过程中从底物上裂解释放出的荧光基团在特定时间内的荧光强度来实现测定。因此，第5步（底物添加）至关重要，必须尽可能高效地完成，以最大限度缩短底物加入土壤样品到开始孵育实验之间的时间。同样，一旦底物与样品接触，酶促反应即会开始发生。出于这一原因，我们推荐使用多通道移液器。强烈建议在进行酶活性测定实验之前，提前熟练掌握多通道移液器的操作。为此，可通过用水练习移液操作，直至能够熟练地使用移液器将液体准确转移至96孔板中。
土壤淬灭
淬灭是指由于土壤悬浊液培养物中的颗粒物和/或有机物质导致荧光强度降低的现象26。通过调整土壤与缓冲液的比例可影响淬灭效应25。由于各个样品本身存在背景荧光，因此必须在检测样品的同时运行标准品，以校正背景（即淬灭）荧光。尽管某些实验方案在验证信号呈线性后仅使用单一浓度标准品，但我们强烈建议为每个样品设置标准淬灭对照，以最大程度地控制淬灭效应。若未进行此操作，所得标准曲线将不适用于该样品，从而导致对酶活性的错误估算。向土壤悬浊液中添加标准品无需严格控制时间，因为标准品的加入不会影响样品的背景荧光。
加入 NaOH
在某些方案中，添加 NaOH 可优化荧光酶活性测定，因为合成底物释放的荧光染料在 pH&#62;9.0 时呈现最强荧光26,49。考虑此建议时，使土壤悬液达到所需 pH（即 pH&#62;9）所需的 NaOH 浓度会因具体土壤类型及所用 pH 缓冲液的不同而有所差异26。然而，也有观点认为 NaOH 可能并非必需，因为在较低 pH 下信号强度通常已非常高，且添加 NaOH 会引入额外的测量误差来源。例如，NaOH 的加入会影响悬液的 pH，从而导致 MUB 或 MUC 荧光随时间发生变化25。研究表明，加入 NaOH 后，MUB 偶联底物的荧光在 20 分钟内持续增强，之后趋于平稳；而 MUC 则在长达 60 分钟内表现出稳定的荧光下降26。因此，必须标准化 NaOH 加入后至荧光测定之间的时间间隔。或者，若不添加 NaOH 时荧光信号仍可被充分检测，则建议采用不添加 NaOH 的方法进行测定，这也被认为是一种同样可接受的替代方案26。
温度
在确定孵育温度时，应考虑温度敏感性。如果主要研究目的是了解酶动力学，采用三种或更多温度（如结果部分所示的阿伦尼乌斯图）是一种可靠的方法。如果采样地点具有典型的低温特征（例如永久冻土土壤），则可能需要延长孵育时间，以使酶在较低的孵育温度下发生反应。尽管传统酶动力学表明，温度升高会导致酶活性增加，但我们发现酶在温度敏感性方面可能具有位点特异性50。因此，为了理解特定地点的酶活性潜力，关键是要调整孵育温度和孵育时间，以反映野外采样点的实际条件。
结论
胞外酶（EE）是土壤中生物地球化学过程的关键驱动因素，因此我们需要能够测定其活性。测定土壤中胞外酶活性（EEA）面临诸多挑战，包括干扰和抑制效应。尽管存在这些挑战，标准化的实验方案（如本文所述方案）仍可普遍应用于多种酶的EEA测定。虽然遵循这些方案相对容易获得高质量的数据，但在生态学背景下解读这些数据时，必须仔细考虑这些测定实际反映的内容，以及测定条件下的EEA与原位（in situ）条件下EEA的差异。

土壤细菌、真菌和古菌产生的胞外酶（EEs）参与了无数的生物地球化学过程，在陆地生态系统中对土壤有机质的转化、稳定与不稳定化以及养分循环起着核心作用1。土壤微生物通过分泌胞外酶将聚合态有机物分解并转化为更小的可溶性分子，从而释放出原本被束缚的微量和大量营养元素，使植物和微生物能够从土壤中吸收利用这些有效养分。数十年来，研究人员主要通过实验室测定酶活性来研究胞外酶2-4，因为直接检测和定量酶的含量极为困难。
胞外酶活性（EEA）主要受酶及其相应底物浓度的调控。土壤中各类碳（C）、氮（N）和磷（P）降解酶的丰度受多种因素影响，包括微生物生物量、群落组成、底物可利用性、微气候条件以及化学计量需求。5,6。然而， 原位 土壤环境中的EEAs也受到温度的影响7,8 ，酶与土壤黏粒及腐殖质特性的结合2，以及扩散限制 9，最终在酶池的大小、底物可及性和周转速率方面调控活性酶的水平10-12因此，承认 原位 在利用实验室酶活性测定来解读不同环境样地土壤微生物功能时，考虑土壤条件至关重要。
可使用多种合成底物通过实验室检测方法定量测定不同类别的 EEA（详见 &#34;试剂列表表格&#34; 有关更多细节，请参见下文）。某些方案在检测中使用与显色反应偶联的底物，可通过分光光度计检测；而其他方案（包括本文所述的方案）则使用与荧光基团偶联的底物。荧光法EE检测通常比显色法检测（使用与合成底物连接的发色基团）更灵敏（灵敏度高一个数量级）。12-14. EEA检测的灵敏度包含两个方面：一是与检测目标化合物的量有关，二是与可检测的最低潜在酶活性有关。基于比色法检测对硝基苯酚（pNP）的方法可在以往的研究中找到15,16简而言之，土壤（通常过筛至 &#60;2 mm并风干）在最佳或与实际环境相关的温度和pH条件下孵育。通过分光光度计进行比色法测定反应产物的释放速率。14荧光酶法检测的更高灵敏度部分归因于对底物降解过程中荧光基团释放的检测更为敏感，而非通过特定波长下显色基团分离后的吸光度进行检测。两种最常用的合成荧光指示剂是4-甲基伞形酮（MUB）17 和7-氨基-4-甲基香豆素（MUC）18,19MUC 相关底物通常与富含氮的合成底物相关联，例如蛋白质和/或氨基酸。针对水体样品的荧光技术最早被开发出来20,21，且将其应用于土壤时需控制信号淬灭和干扰22,23. 检测可采用传统方法进行 &#34;台式&#34; 化学分析可使用大体积样品，也可应用于基于微孔板的方案，在提高通量的同时可能增加测量误差。尽管目前已有多种被广泛引用的土壤中胞外酶活性（EEAs）荧光检测方案24许多实验室在采用这些实验方案时会引入细微的差异，这些差异往往是无意造成的，或源于实验室设备与试剂的不同。方案细节上看似微小的差异，可能对测得的胞外酶活性（EEAs）产生显著影响。25,26 缺乏标准化酶制剂使得不同实验室之间的测定校准变得困难，因此迫切需要广泛传播详细的实验方案，以推动EEA测定的标准化。
在本实验方案中，通过将土壤样品与pH缓冲液混合，并使用搅拌器均质化来制备土壤样品。然后向所得悬液中加入足量的荧光标记的富碳（C）、富氮（N）或富磷（P）底物，具体底物的选择取决于所研究的科学问题。在酶活性测定中使用土壤悬液可有效控制并最小化底物扩散限制。荧光基团在未被相应底物释放前处于淬灭状态，因此当酶催化反应将荧光染料从底物上切割下来时，即可检测到酶活性。随时间递增的荧光强度反映了酶催化反应的速率。
荧光酶分析法的基本原理是将带有荧光生色团（荧光染料）的合成底物加入土壤样品中 27在酶催化底物降解过程中，荧光染料与底物之间的化学键发生断裂。从底物上释放出的荧光染料可间接反映酶活性，其荧光强度可通过酶标仪进行定量检测。简而言之，荧光定量的原理在于：游离的染料在吸收特定波长的光后，会发射出另一波长的光。酶标仪通过激发光源并检测发射光信号，记录荧光强度。随后可根据底物中已知浓度的荧光染料，对酶活性进行定量分析。即 已知量的合成底物添加至土壤样品中），并参照所用底物特异性荧光基团的荧光强度标准稀释曲线（即 4-甲基伞形酮（MUB）或7-氨基-4-甲基香豆素（MUC）。（有关酶活性定量的具体细节，请参见实验方案部分）。
实验室土壤酶活性测定对于评估微生物群落功能具有重要意义，但使用者应认识到其中存在的一些技术局限性10荧光检测可能受到杂质和/或多种荧光化合物在光照下不稳定性的干扰，因此在处理荧光底物时需格外谨慎25土壤悬液中的土壤颗粒和/或有机物质也可能干扰荧光强度，该现象称为淬灭效应。 26此外，实验室酶活性测定仅能评估在实验室条件下潜在的胞外酶活性（EEAs）。 体外 检测在底物扩散和丰度不受限制的条件下测定胞外酶活性（EEAs）。因此，这些检测所提供的数据可能无法准确代表实际环境中底物受限条件下的胞外酶活性（EEAs） 原位 土壤条件10总体而言，当土壤类型相似时，酶活性对于相对比较非常有用。然而，在使用该方法对物理或化学性质不同的土壤之间进行活性比较时，应谨慎对待。这是因为土壤类型和温度的差异可能会极大地改变酶的状态 原位 酶动力学。另一个局限性是，与自然环境相比，市面上可获得的底物种类相对较少。此外，酶活性测定中所用的合成底物结构相对简单且易溶，可能无法准确代表土壤中实际存在或可利用的底物状况 原位另一个需要考虑的因素是，使用土壤悬液会引入一些稳定化酶的活性（即 被有机质或黏土固定而可能不具有活性的 原位 条件 2实验室酶活性测定也无法提供有关酶在土壤中持久性（酶周转率）或产生土壤酶的特定微生物种类的信息。

<table><tbody><tr><td>&lt;强&gt;试剂： &lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4-甲基伞形基 &amp;alpha;-D-葡萄糖吡喃糖苷（AG）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M9766</td><td>糖降解</td></tr><tr><td>4-甲基伞形基 &amp;beta;-D-吡喃葡萄糖苷（BG）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M3633</td><td>糖降解</td></tr><tr><td>4-甲基伞形基 &amp;beta;-D-纤维二糖苷（CB）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M6018</td><td>纤维素降解</td></tr><tr><td>L-亮氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素盐酸盐（LAP）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L2145</td><td>蛋白质降解</td></tr><tr><td>4-甲基伞形基-N-乙酰-&amp;beta;-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷（NAG）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M2133</td><td>几丁质降解</td></tr><tr><td>4-甲基伞形基磷酸盐（PHOS）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M8883</td><td>磷矿化</td></tr><tr><td>4-甲基伞形基-&amp;beta;-D-木糖吡喃糖苷（XYL）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M7008</td><td>半纤维素降解</td></tr><tr><td>4-甲基伞形酮（MUB）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M1381</td><td></td></tr><tr><td>7-氨基-4-甲基香豆素（MUC）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9891</td><td></td></tr><tr><td>50 mM 无水乙酸钠缓冲液</td><td>Fisher Scientific</td><td>S210-500</td><td>酸性与中性土壤</td></tr><tr><td>50 mM Tris 碱缓冲液</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP154-1</td><td>基础土壤</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;仪器设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bel-Art Scienceware 一次性移液储液槽</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-512-65</td><td>移液储液槽</td></tr><tr><td>电子；Eppendorf Xplorer；8通道</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-684-265</td><td>8通道移液器，量程：50-1,200 &amp;mu;l</td></tr><tr><td>TipOne 101-1,250 &amp;mu;延长长度的天然发梢</td><td>USA Scientific</td><td>1112 - 1720</td><td>960 个吸头（10 盒，每盒 96 个）</td></tr><tr><td>加热板；加热表面：10 英寸 × 10 英寸</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-100-100SH</td><td>磁力搅拌器实验室转盘</td></tr><tr><td>沃林搅拌机</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-509-7P</td><td>双速；1 L（34 盎司）不锈钢容器</td></tr><tr><td>BRAND Dispensette III 瓶口分液器</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-688-231</td><td>移液器；量程：5-50 ml</td></tr><tr><td>Wheaton Unispense &amp;mu;P 蠕动泵</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-683-7</td><td>可选分配器</td></tr><tr><td>Fisherbrand 磁力搅拌子</td><td>Fisher Scientific</td><td>1451363SIX</td><td>用于混合后搅拌土壤悬液</td></tr><tr><td>Pyrex 玻璃碗</td><td>世界厨房</td><td>5304218</td><td>Pyrex 10 oz 带边布丁杯</td></tr><tr><td>Costar 96孔黑色固相板</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-590</td><td>用于酶标仪步骤</td></tr><tr><td>Costar 96孔检测板</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-700</td><td>V型底；2 ml；无菌</td></tr><tr><td>赛默飞世尔科技 Nunc 96 孔板盖膜</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-387-93</td><td>无菌96孔方形孔盖板</td></tr><tr><td>配备深孔板转子的离心机</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>3121</td><td>Centra-GP8（此型号已不再提供）</td></tr><tr><td>Tecan Infinite 200 系列多功能微孔板读板仪</td><td>Tecan</td><td>30016058</td><td>酶标仪（此型号已不再提供）</td></tr></tbody></table>

高通量荧光法测定潜在土壤胞外酶活性

High-throughput Fluorometric Measurement of Potential Soil Extracellular Enzyme Activities

土壤及其他环境中的微生物会产生胞外酶，以降解和水解有机大分子，从而将其同化为能量和营养物质。测定土壤微生物酶活性对于理解土壤生态系统功能动态至关重要。荧光酶法测定的基本原理是：向土壤样品中加入与荧光染料结合的合成富碳（C）、富氮（N）或富磷（P）底物。当底物完整时，标记的底物不产生荧光；当酶将荧光染料从底物上切割下来后，染料得以发出荧光，酶活性即通过荧光强度的增加来测定。酶活性的测量结果可用摩尔浓度单位或活性单位表示。进行该测定前，需将土壤与pH缓冲液混合制备成土壤悬液。所选用的缓冲液（通常为50 mM醋酸钠缓冲液或50 mM Tris缓冲液）应根据其特定的酸解离常数（pKa）来匹配土壤样品的pH值。随后向土壤悬液中加入足量的荧光标记（i.e. 富C、N或P）底物。在测定中使用土壤悬液有助于最大限度减少酶与底物扩散的限制。因此，该方法可控制底物限制、扩散速率及土壤pH条件的差异，从而检测出酶活性速率随酶浓度（每份样品）差异的变化情况。
荧光酶法测定通常比分光光度法（即 比色法检测&#160;但可能受到杂质干扰，以及许多荧光化合物在光照下不稳定的影响；因此在处理荧光底物时需格外谨慎。同样，该方法仅在实验室条件下评估酶的潜在活性，且以底物不受限为前提。在解释涉及不同温度或土壤类型样地之间的比较数据时应谨慎对待，因为 原位 土壤类型和温度会影响酶动力学。

酶活性测定可用于量化潜在的胞外酶活性（EEAs），并比较相似样品间的活性差异。本文展示了来自一项气候控制实验研究的代表性结果，该研究比较了经历环境气候条件（ACN）的土壤与暴露于升高CO₂浓度下的土壤之间的酶活性。2 以及加热处理（EHN）（图2-6）。所有样地的植物覆盖特征均表现为以C4禾草为主的北方混合草原 Bouteloua gracilis （H.B.K）Lag. 和两种C3禾草， Hesperostipa comata 特里恩和鲁普尔 Pascopyrum smithii （Rydb.）；约20%的植被由莎草科植物和杂类草组成。有关该地点描述和野外实验设计的更多详细信息可参见参考文献。28-30. 在每个处理样地内，使用直径为1.5 cm的土钻采集两个不同深度（0–5 cm和5–15 cm）的土壤样品，以评估土壤胞外酶活性（EEAs）对气候变化条件的响应。在我们的示例中（即 图2-6），样本量为（N = 3）。尽管样本量较小，但在大多数情况下变异程度相对较小（如误差线所示），并能稳健地反映不同处理样地间潜在胞外酶活性（EEAs）的变异性。采用方差分析（ANOVA）及Tukey事后多重比较检验，以识别不同处理样地及土壤深度间酶活性的显著差异。
以下代表性结果展示了这种高通量荧光测定法如何用于检测：（1）土壤中总体的胞外酶活性（EEA）；（2）EEA化学计量比如何反映生态系统层面的过程；以及（3）培养温度与EEA之间的关系。土壤EEA常被用于关联微生物功能变化与土壤养分循环过程，是评估微生物养分需求响应气候变化、植物群落更替以及更广泛生态系统功能的有用指标31-33。近年来，EEA化学计量比被作为一种指数，结合生态化学计量理论与生态代谢理论，用于评估在不同环境条件下微生物潜在的养分失衡状况5。大量研究表明，较高的化学计量比值可指示养分对生长的限制作用34-36；当土壤养分受限时，微生物会通过分配代谢资源来产生特定酶类以获取缺乏的养分37。因此，胞外酶C:N:P化学计量比有助于识别在不同环境扰动下微生物群落潜在养分需求的相对变化5。最后，EEA对温度的敏感性可用于评估土壤微生物群落功能多样性如何受温度变化的影响7,38。同一类酶在不同土壤中的温度敏感性可能存在显著差异，且产生酶的微生物群落在气候条件发生历史性变化时，其酶活性也表现出相应改变7。因此，围绕胞外酶热生态学相关的酶活性问题，是评估微生物功能动态及地下生态系统过程对气候变化响应的有效途径39,40。
在此示例中，在0–5 cm土层深度测定的潜在C、N和P酶获取活性在不同实验处理间无显著差异（图2a）。然而，在5–15 cm土层深度，多种潜在的胞外酶活性（EEA）存在显著差异（图2b）。例如，降解C的酶类——β-1,4-葡萄糖苷酶和β-D-纤维二糖水解酶——在EHN样地中的活性显著低于ACN样地（p ≤ 0.038；图2b）。在5–15 cm土层深度，参与N和P矿化的酶类（分别为β-1,4-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶和磷酸酶）在EHN样地中的活性也显著低于ACN样地（p ≤ 0.012；图2b）。
计算并绘制所有碳（C）、氮（N）或磷（P）循环相关的潜在胞外酶活性（EEA）之和，是观察土壤中潜在C、N和/或P循环整体模式的有效方法（图3）。在本示例中，通过计算β-1,4-葡萄糖苷酶、β-D-纤维二糖水解酶、β-木糖苷酶和α-1,4-葡萄糖苷酶的潜在EEA之和，来代表潜在的碳循环活性；通过计算β-1,4-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶和L-亮氨酸氨肽酶的潜在EEA之和，来代表潜在的氮循环活性；磷酸酶则用于代表潜在的磷循环活性。在此示例中，在5–15 cm土层深度，EHN处理样地的总C、N和P循环潜在EEA均低于ACN处理样地（图3），但该差异仅在总氮和总磷循环活性上达到显著水平（p ≤ 0.046；图3）。在0–5 cm土层深度，不同处理样地之间的土壤EEA无显著差异（图3）。本示例的结果表明，在不同处理样地（ACN vs. EHN）中，酶活性功能类群（即降解C、N或P的酶）随土壤深度变化呈现出相反的趋势。例如，在对照条件样地（ACN）中，C、N和P降解相关的土壤EEA在较深土层中呈升高趋势，而在高CO2浓度和增温处理（EHN）的土壤中则表现出相反的模式（图3a–c）。
酶的化学计量比是评估环境中潜在酶活性的另一种有用方法（图4微生物对养分的需求由微生物生物量的元素化学计量关系与环境养分可利用性共同决定。32同样，微生物会产生特定的酶（即 C-、N-或P-降解酶）以满足其土壤环境中对养分的需求，这一现象也被称为生态化学计量学41潜在胞外酶活性（EEAs）的比值是评估微生物营养需求的一种方法。例如，当两种酶功能基团之间的比值为1:1时（如在碳氮营养获取方面），结合群落水平上微生物生物量的碳氮比通常为8:1，这表明微生物对氮的需求相对于碳的需求较高。42在此示例中，0–5 cm土层深度的处理样地之间，土壤酶化学计量比C:N、C:P或N:P活性存在显著差异图4a-c）。然而，在5-15 cm土层深度，EHN样地的潜在酶C:P和N:P比率高于ACN样地（p = 0.05； 图4b 和 4c）。这一观察结果表明，在5–15 cm土层深度，ACN样地的P矿化相关胞外酶活性（EEA）相对高于C和N的EEA（相较于EHN样地）。酶的C:N获取活性比值表现出与总C EEAs相似的趋势，在较低土层深度，ACN样地的C:N比值较高，原因是其潜在的C EEAs高于EHN样地。图4a).
温度可显著影响土壤胞外酶活性（EEAs）。然而，在典型的实验室测定中，土壤酶活性通常在单一温度下测量，该温度可能与实际环境条件不符。 原位 温度条件。我们的荧光酶活性测定方法使我们能够考虑 原位 通过设置多个实验室培养温度进行比较，以研究温度效应。在多个温度下进行实验室培养，可利用阿伦尼乌斯图和Q值分析温度依赖性酶动力学数据10 计算。阿伦尼乌斯图用于可视化表观活化能，以酶活性的对数（y轴，因变量）对温度的倒数（以开尔文度表示，1/K）作图（x轴）即 自变量 图5a-c)。活化能通常被定义为催化化学反应所需的最低能量（即 将特定底物降解为较小产物）。就我们的目的而言，活化能可作为酶催化反应温度敏感性的替代指标。较高的活化能表明酶对温度更敏感。同样，活化能（即 图5d-f) 直接对应于 Q10 值（即 图6a-c）。有关计算活化能所用公式的进一步解释及其实际应用，可在以往众多研究中找到40,43-45阿伦尼乌斯图、活化能和Q10 图表提供了冗余信息，不应在同一篇用于发表的稿件中全部使用来呈现数据图5 和 6）。因此，在使用这些技术时，有必要为您的酶温度-动力学数据选择最合适的图表类型10所有图类型（阿伦尼乌斯图和Q10) 此处展示仅用于演示目的，以提供酶学结果呈现方式的可视化示例。
在本研究中，我们评估了两种处理样地在两个土壤深度下潜在的C、N和P胞外酶活性（EEAs）的动力学特征（图5；图6）。结果表明，在两个土壤深度下，不同处理样地之间的酶活性温度敏感性均无显著差异，这体现在阿伦尼乌斯图（图5a-c）及其对应的活化能（图5d-f）上；同时，在Q10值分析中也观察到类似结果（本示例中基于15 °C与25 °C实验室培养条件之间的比较；图6a-c），该结果并不意外。这表明，在本项研究中，田间实验处理并未对酶动力学产生显著影响。
<img alt="酶活性测定的微孔板布局图；第1-12列，A-H行；不同底物浓度。" src="/files/ftp_upload/50961/50961table1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="表1"> 
表1. 土壤样品中荧光标准品浓度的深孔板设计。 在孵育前，用于组织和加载含土壤样品的荧光标准品（MUB 或 MUC）至深孔板中的模板。注意：各列代表相同的土壤样品（加入800 μl土壤悬液）。每行加载一系列浓度梯度的荧光标准品（加入200 μl）。每个孔代表荧光标准品浓度与土壤悬液的混合。例如，S1 - S12代表土壤样品（800 μl土壤悬液）；MUB 0-100 μM = 4-甲基伞形酮浓度（200 μl加入量）。在此示例中，H行为空，因此如有需要，可用于加入更高浓度的荧光标准品。是否提高标准曲线浓度，取决于您特定土壤样品的潜在酶活性（和/或所用底物浓度）的高低。您样品的潜在酶活性应落在标准曲线浓度范围之内。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50961/50961table1large.jpg" target="_blank"> 点击此处查看大图</a>。
<img alt="酶反应网格图，含底物代码；用于生化分析或实验设计的示意图。" src="/files/ftp_upload/50961/50961table2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="表 2"> 
表 2. 含底物的土壤样品深孔板设计。 在孵育前，用于组织和加载土壤样品及底物至深孔板的模板。注意：各列为相同的土壤样品（加入 800 μl 土壤悬液）。不同底物沿各行加入（加入量为 200 μl）。每个孔代表土壤样品与底物的混合。例如，S1 - S12 代表不同的土壤样品（800 μl 土壤悬液）。所加入的底物（200 μl）包括：BG = 4-甲基伞形基-β-D-吡喃葡萄糖苷；CB = 4-甲基伞形基-β-D-纤维二糖苷；NAG = 4-甲基伞形基-N-乙酰-β-D-葡糖胺苷；PHOS = 4-甲基伞形基磷酸酯；XYL = 4-甲基伞形基-β-D-吡喃木糖苷；AG = 4-甲基伞形基-α-D-吡喃葡萄糖苷；以及 LAP = L-亮氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素盐酸盐。在此示例中，H 行为空，因此可根据需要用于加入另一种底物，以评估其他潜在的酶活性。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50961/50961table2large.jpg" target="_blank"> 点击此处查看大图</a>。
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>温度</td>
			<td>时间</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 °C</td>
			<td>~23 小时</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 °C</td>
			<td>6 小时</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 °C</td>
			<td>3 小时</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 °C</td>
			<td>1.5 小时</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表3. 酶活性测定实验所需的培养温度与对应孵育时间。 酶活性测定实验中所需的孵育温度及其对应的时间段。
<img alt="荧光测定结果表格，MUB 和 MUC 浓度分析，斜率、截距、R² 数据。" src="/files/ftp_upload/50961/50961table4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="表 4"> 
表 4. MUB 和 MUC 标准曲线计算。 展示如何整理 a) MUB 和 b) MUC 的原始荧光数据（μmol），以进一步计算斜率、y 轴截距和 R² 值。要从标准浓度曲线中计算斜率、y 轴截距和 R² 值，请选择（或绘制）MUB 和/或 MUC 的原始荧光数据作为因变量（y 轴），标准浓度（μmol）作为自变量（x 轴）。注：MUB = 4-Methylumbelliferone；MUC = 7-Amino-4-methylcoumarin。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50961/50961table4large.jpg" target="_blank"> 点击此处查看大图</a>。
<img alt="荧光数据表；样品原始荧光强度值、吸光度校正值及分析结果。" src="/files/ftp_upload/50961/50961table5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="表 5"> 
表 5. 酶活性计算。 演示如何 a) 整理样品原始荧光数据，并依次执行后续步骤（b-f），以计算出酶活性单位：μmol 活性/g 干土/hr。注：S1 - S12 代表不同的土壤样品。底物包括：BG = 4-Methylumbelliferyl β-D-glucopyranoside；CB = 4-Methylumbelliferyl β-D-cellobioside；NAG = 4-Methylumbelliferyl N-acetyl-β-D-glucosaminide；PHOS = 4-Methylumbelliferyl phosphate；XYL = 4-Methylumbelliferyl-β-D-xylopyranoside；AG = 4-Methylumbelliferyl α-D-glucopyranoside；以及 LAP = L-Leucine-7-amido-4-methylcoumarin hydrochloride。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50961/50961table5large.jpg" target="_blank"> 点击此处查看大图表格</a>。
<img alt="荧光图，MUB浓度与荧光强度关系，R²=0.988，数据分析结果。" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50961/50961fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 1"> 
图1. MUB标准曲线图。 以原始荧光数据为因变量（y轴），标准品浓度（μmol）为自变量（x轴）绘制的标准曲线散点图。
<img alt="0-5 cm 和 5-15 cm 土壤深度下的酶活性柱状图；处理样地 ACN、EHN。" fo:content-width="2.8in" src="/files/ftp_upload/50961/50961fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. 碳、氮和磷循环相关酶活性。在草原增温与大气 CO2 浓度升高（PHACE）试验样地的对照样地（ACN：暴露于自然气候条件）和处理样地（EHN：暴露于增温和高浓度 CO2 条件）中测定的潜在胞外酶活性（EEAs）。土壤酶活性分别在 a) 0–5 cm 和 b) 5–15 cm 土壤深度测定。垂直误差棒表示平均值 ± 标准误（S.E.）。注：ACN = 自然气候条件样地；EHN = 高浓度 CO2 与增温处理样地。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50961/50961fig2large.jpg" target="_blank"> 点击此处查看高清大图</a>。
<img alt="比较处理样地两个土壤深度下C、N、P酶活性的柱状图；包含p值。" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/50961/50961fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图3"> 
图3. 总碳、氮和磷循环酶的化学计量比。 PHACE实验中，在0–5 cm和5–15 cm土壤深度下，两个处理组参与获取a) 碳、b) 氮和c) 磷的潜在胞外酶活性（EEA）总和。垂直误差线表示平均值±标准误（S.E.）。注：ACN = 环境气候样地；EHN = 增加CO2浓度并加热样地。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50961/50961fig3large.jpg" target="_blank"> 点击此处查看高清大图</a>。
<img alt="土壤酶获取比率柱状图；不同土壤深度下的 C:N、C:P、N:P 比率；包含 p 值。" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/50961/50961fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 4"> 
图 4. 总碳、氮、磷循环相关酶活性的酶化学计量关系。 在草原增温与大气 CO2 浓度升高（PHACE）试验样地的对照样方（ACN：暴露于自然气候条件）和处理样方（EHN：暴露于升温与高浓度 CO2 条件）中，测定的酶获取活性化学计量比率。总土壤 a) C:N、b) C:P 和 c) N:P 比率分别在 0–5 cm 和 5–15 cm 土层深度的两个处理组中进行绘制。垂直误差线表示均值 ± 标准误（S.E.）。注：ACN = 自然气候样方；EHN = 高浓度 CO2 与增温处理样方。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50961/50961fig4large.jpg" target="_blank"> 点击此处查看高清大图</a>。
<img alt="酶活化能分析；图 (a-f)、土壤深度影响、温度变化、研究结果。" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50961/50961fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 5"> 
图 5. 总碳、氮和磷循环酶的活化能。 使用阿伦尼乌斯图展示潜在胞外酶活性（EEA）的温度敏感性，分别为总 a) 碳、b) 氮和 c) 磷降解酶；以及在草原增温与高浓度 CO2 环境控制实验（PHACE）样地的不同处理小区和土壤深度下，总 d) 碳、e) 氮和 f) 磷降解酶相应的活化能值。活化能的垂直误差条（即 d-f）表示平均值 ± 标准误（S.E.）。注：ACN = 常温气候对照小区；EHN = 高浓度 CO2 与增温处理小区。在发表时需注意，作者通常会选择仅展示阿伦尼乌斯图（即 a-c）或活化能数值图（即 d-f）中的一种，而非同时呈现两种图形。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50961/50961fig5large.jpg" target="_blank"> 点击此处查看高清大图</a>。
<img alt="土壤酶活性Q10（15-25°C）柱状图；按土壤深度和处理样地划分的总碳、氮、磷循环酶。" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/50961/50961fig6.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 6"> 
图6. 总碳、氮和磷循环酶的Q10值（15–25 °C）。基于在15 °C和25 °C条件下实验室培养所测定的潜在胞外酶活性（EEA），以Q10表示其温度敏感性，分别针对Prairie Heating and Elevated CO2 Enrichment（PHACE）试验点的不同处理样地和土壤深度的总a）碳降解酶、b）氮降解酶和c）磷降解酶。Q10的垂直条形表示平均值±标准误（S.E.）。注：ACN = 环境气候对照样地；EHN = 增加CO2浓度并升温处理样地。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50961/50961fig6large.jpg" target="_blank"> 点击此处查看高清大图</a>。

为了测定土壤胞外酶活性的潜在速率，将与荧光染料结合的合成底物添加到土壤样品中。当酶催化反应使荧光染料从底物上释放出来时，通过检测荧光强度来测定酶活性，荧光强度越高，表明底物降解越多。

土壤及其他环境中的微生物会产生胞外酶，以解聚和水解有机大分子，从而使其能够被吸收利用。

本实验的总体目标是量化土壤中外源酶降解其靶标底物的最大潜在速率。首先将田间湿润土壤与缓冲液在搅拌器中混合，然后用移液器将混合样品加入深孔样品板和深孔标准品板中。深孔板经孵育和离心后，从深孔板的每个孔中转移 250 微升液体至黑色平底板的相应孔中。96孔板。随后在荧光计上读取这三个板的数据，并分析所得结果。最终，通过荧光染料在酶催化反应中从底物释放的速率来确定潜在的土壤胞外酶活性，其中更高的荧光强度表明底物降解程度更高。与现有方法相比，该技术的主要优势在于能够利用深孔96孔微孔板的格式，对大量样品中的酶活性进行测定。当我们发现通过将其他实验方案适配至深孔板格式，可增加样品体积时，便首次提出了该方法的构想。该技术的应用使我们能够更好地将微生物生理学与生态系统尺度的过程联系起来。该技术的关键在于可视化演示，因为其中涉及许多细微操作和样品处理步骤，仅通过书面流程难以准确掌握。该方法有助于回答微生物生态学与土壤生物地球化学领域中的关键科学问题，例如土壤微生物如何响应其环境变化，以及它们的生理响应如何影响分解作用和养分循环等关键生态系统过程。尽管该方法可用于研究土壤有机质分解及陆地生态系统的养分循环，但也同样适用于海洋和淡水生态系统。通常，初次接触该方法的实验人员在移液操作技能以及对本实验方案时间敏感性的把握上会遇到困难。此外，该实验流程产生的大量数据有时也会让初次使用者感到难以应对。开始检测准备时，标记三个深孔板，分别为样品、MUB标准品（含四种甲基）、七氨基-4-甲基香豆素的MUC标准品。将每种标准品和底物分别倒入已预先标记且按行排列的干净储液槽中。然后根据文本方案中列出的对应关系，用移液器将相应的MUB标准品加入MUB标准品板的各孔中。对MUC标准品重复此操作，将其加入MUC标准品板的相应孔中，以制备土壤悬液。对于每个土壤样品，在加入搅拌器前称取 2.75 克田间湿润土壤。加入 91 毫升 50 毫摩尔缓冲液，高速搅拌 1 分钟。将搅拌器内容物倒入一个洁净的玻璃容器中，容器直径至少与八通道移液器相当，并内置搅拌子。将土壤悬液在倒入烧杯前通过约一毫米的筛网过滤。将烧杯置于加热板上并混合土壤悬液。然后用移液器吸取800 µL土壤悬液加入样品板的第一列中。对 MUB 标准板和 MUC 标准板的第一列进行相同操作。在处理不同土壤样品之间，用去离子水或缓冲液冲洗均质器、搅拌板和搅拌子。对每个土壤样品重复此过程。每个后续样本依次移至下一列。接下来，将适量的底物加入样本板的相应孔中。根据文本方案中的说明，为每个待测的孵育温度准备一块样本板。使用板垫密封深孔板。用手轻轻倒置每块已密封的板，直至溶液充分混匀。将板放入相应的培养箱中，按照文本实验方案中列出的所需孵育时间进行孵育，并记录初始时间作为零时，同时在每次孵育结束时记录相应的孵育时间。将密封的板在约 2,900 ×g 条件下离心 3 分钟。离心后，从孵育过的深孔板的每个孔中转移 250 µL 至黑色平底 96 孔板的对应孔中。每块孵育过的深孔板需使用一块黑色板。根据所使用的Flora Metric酶标仪的说明书，将样品从孵育后的深孔板转移至黑色平底96孔板的相应孔中。将激发波长设置为365纳米，发射波长设置为450纳米。加载一个标准板，将荧光计设置为自动增益并读取该板。然后将增益设为手动模式，并将数值从最优值降低至下一个最低的、四舍五入到最接近5的数值。对于每个标准板，对每块板重复测量两次。接下来，加载样品板。将增益设为自动，运行样品板。手动重新运行样品板，以使每个标准板的增益与最高增益相匹配。开始数据分析，将MUB和MUC标准品的标准曲线荧光数据输入电子表格。将各样本的微摩尔浓度转换为微摩尔量。根据标准曲线荧光数据，计算MUB和MUC标准品浓度的斜率、y轴截距及R²值。每个样本的可接受 r 平方值应超过 0.98。标准曲线可通过散点图进行可视化，其中将荧光读数作为因变量，标准品浓度作为自变量进行绘制。将样本加底物的原始荧光数据输入一个新的电子表格中。同时记录每个样品的孵育时间及土壤干重，从相应样品的荧光值中减去标准曲线的截距值，然后除以对应标准曲线的斜率。根据标准曲线方程，将样品的微摩尔数乘以91毫升（即土壤悬液中所用缓冲液体积），再将所得数值除以样品的特定孵育时间及干土质量。最后将所得数值乘以1000，以获得所需的单位。结果来自一项实验性气候研究，该研究比较了经历环境气候条件的土壤与暴露于升高二氧化碳浓度和增温处理的土壤。此处展示的是在草原增温与二氧化碳富集试验点的对照样地和处理样地中的潜在胞外酶活性（EEAs）。在此示例中，在0至5厘米土层深度测得的潜在碳、氮和磷相关酶获取活性在不同实验处理间无显著差异。然而，在5至15厘米的土壤深度，几种潜在的胞外酶活性（EEAs）存在显著差异。例如，与环境气候条件下的样地相比，高浓度二氧化碳和增温处理样地中的碳降解酶——β-1,4-葡糖苷酶和β-D-纤维二糖酶——活性较低；氮和磷矿化相关的酶活性在处理样地也低于环境气候条件下的样地，该现象出现在5至15厘米的土壤深度。计算并绘制所有碳、氮或磷循环潜力胞外酶活性（EEAs）的总和，是观察土壤碳、氮和/或磷循环潜力的更广泛规律的有效方法。在本示例中，通过计算 β-1,4-葡萄糖苷酶、β-D-纤维素酶、β-木糖苷酶和 α-1,4-葡萄糖苷酶的潜在 EEAs 总和，来代表潜在的碳循环活性；通过计算 β-1,4-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶和 L-亮氨酸氨基肽酶的潜在 EEAs 总和，来代表潜在的氮循环活性。磷酸酶用于表征潜在的磷循环活性。在5至15厘米的土壤深度，与环境气候条件下的样地相比，升高二氧化碳浓度并增温处理样地中的总碳、氮和磷循环相关的潜在胞外酶活性呈降低趋势。然而，该趋势仅在总氮和磷循环活性方面达到显著水平，土壤胞外酶活性在不同处理样地之间未表现出显著差异。在0至5厘米土层深度。结果表明，不同处理样地中的酶活性和功能基团随土层深度呈现出相反的趋势，潜在的外酶活性（EEAs）比率是评估微生物养分需求的一种方法。在此，土壤酶、土体构型、碳氮比、碳磷比或氮磷比的活性在0至5厘米土层深度的不同处理样地之间存在显著差异。然而，在高浓度二氧化碳和增温处理的样地，潜在的酶碳磷比和氮磷比更高。与环境气候条件相比，在5至15厘米的土壤深度，温度对土壤胞外酶活性（EEAs）具有显著影响。然而，在典型的实验室测定中，土壤酶活性通常在单一温度下测量，该温度可能与大气二氧化碳浓度升高条件下的实际温度不一致。阿伦尼乌斯图（Aran plots）用于可视化活化能，其绘制方法为：以酶活性的对数为纵坐标，以温度倒数（换算为开尔文温度）为横坐标。活化能通常被定义为催化化学反应所需的最低能量，在此可作为酶催化反应温度敏感性的替代指标。较高的活化能表明酶对温度更敏感。同样，活化能与Q10温度系数值直接对应。在两个土壤深度的各处理样地之间，对碳、氮和磷的胞外酶活性（EEA）潜在酶动力学的温度系数进行了评估，结果表明，在任一土壤深度，不同处理样地之间的EEA温度敏感性无显著差异。熟练掌握后，可在30分钟或更短时间内将12个样品接种至96孔微孔板中。此外，在规定的孵育时间结束后，通常可在半小时内再次将酶标板进行离心、转移并使用酶标仪读数。在进行该实验操作时，务必保持移液的一致性，移液过程中任何气泡均会对实验结果产生不利影响。为了进一步探究土壤微生物群落结构在其形成后对土壤功能的影响，还可以开展DNA提取和测序等其他方法。该技术为微生物生态学领域的研究人员探索陆地生态系统中的养分循环和生物地球化学过程奠定了基础。观看本视频后，您应能充分掌握如何定量测定潜在的酶活性。此外，您应能够解读数据，以反映不同生态系统中微生物对气候和土壤类型等因素的潜在响应。使用荧光材料时，切勿忘记由于荧光基团对光敏感，应始终采取预防措施以尽量减少光照暴露。

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环境

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