高通量荧光法测定潜在土壤胞外酶活性

本实验的总体目标是量化土壤中外源酶降解其靶标底物的最大潜在速率。首先将田间湿润土壤与缓冲液在搅拌器中混合，然后用移液器将混合样品加入深孔样品板和深孔标准品板中。深孔板经孵育和离心后，从深孔板的每个孔中转移 250 微升液体至黑色平底板的相应孔中。

96孔板。随后在荧光计上读取这三个板的数据，并分析所得结果。最终，通过荧光染料在酶催化反应中从底物释放的速率来确定潜在的土壤胞外酶活性，其中更高的荧光强度表明底物降解程度更高。

与现有方法相比，该技术的主要优势在于能够利用深孔96孔微孔板的格式，对大量样品中的酶活性进行测定。当我们发现通过将其他实验方案适配至深孔板格式，可增加样品体积时，便首次提出了该方法的构想。该技术的应用使我们能够更好地将微生物生理学与生态系统尺度的过程联系起来。

该技术的关键在于可视化演示，因为其中涉及许多细微操作和样品处理步骤，仅通过书面流程难以准确掌握。该方法有助于回答微生物生态学与土壤生物地球化学领域中的关键科学问题，例如土壤微生物如何响应其环境变化，以及它们的生理响应如何影响分解作用和养分循环等关键生态系统过程。尽管该方法可用于研究土壤有机质分解及陆地生态系统的养分循环，但也同样适用于海洋和淡水生态系统。

通常，初次接触该方法的实验人员在移液操作技能以及对本实验方案时间敏感性的把握上会遇到困难。此外，该实验流程产生的大量数据有时也会让初次使用者感到难以应对。开始检测准备时，标记三个深孔板，分别为样品、MUB标准品（含四种甲基）、七氨基-4-甲基香豆素的MUC标准品。

将每种标准品和底物分别倒入已预先标记且按行排列的干净储液槽中。然后根据文本方案中列出的对应关系，用移液器将相应的MUB标准品加入MUB标准品板的各孔中。对MUC标准品重复此操作，将其加入MUC标准品板的相应孔中，以制备土壤悬液。

对于每个土壤样品，在加入搅拌器前称取 2.75 克田间湿润土壤。加入 91 毫升 50 毫摩尔缓冲液，高速搅拌 1 分钟。将搅拌器内容物倒入一个洁净的玻璃容器中，容器直径至少与八通道移液器相当，并内置搅拌子。

将土壤悬液在倒入烧杯前通过约一毫米的筛网过滤。将烧杯置于加热板上并混合土壤悬液。然后用移液器吸取800 µL土壤悬液加入样品板的第一列中。

对 MUB 标准板和 MUC 标准板的第一列进行相同操作。在处理不同土壤样品之间，用去离子水或缓冲液冲洗均质器、搅拌板和搅拌子。对每个土壤样品重复此过程。

每个后续样本依次移至下一列。接下来，将适量的底物加入样本板的相应孔中。根据文本方案中的说明，为每个待测的孵育温度准备一块样本板。

使用板垫密封深孔板。用手轻轻倒置每块已密封的板，直至溶液充分混匀。将板放入相应的培养箱中，按照文本实验方案中列出的所需孵育时间进行孵育，并记录初始时间作为零时，同时在每次孵育结束时记录相应的孵育时间。

将密封的板在约 2,900 ×g 条件下离心 3 分钟。离心后，从孵育过的深孔板的每个孔中转移 250 µL 至黑色平底 96 孔板的对应孔中。每块孵育过的深孔板需使用一块黑色板。

根据所使用的Flora Metric酶标仪的说明书，将样品从孵育后的深孔板转移至黑色平底96孔板的相应孔中。将激发波长设置为365纳米，发射波长设置为450纳米。

加载一个标准板，将荧光计设置为自动增益并读取该板。然后将增益设为手动模式，并将数值从最优值降低至下一个最低的、四舍五入到最接近5的数值。对于每个标准板，对每块板重复测量两次。

接下来，加载样品板。将增益设为自动，运行样品板。手动重新运行样品板，以使每个标准板的增益与最高增益相匹配。

开始数据分析，将MUB和MUC标准品的标准曲线荧光数据输入电子表格。将各样本的微摩尔浓度转换为微摩尔量。根据标准曲线荧光数据，计算MUB和MUC标准品浓度的斜率、y轴截距及R²值。

每个样本的可接受 r 平方值应超过 0.98。标准曲线可通过散点图进行可视化，其中将荧光读数作为因变量，标准品浓度作为自变量进行绘制。将样本加底物的原始荧光数据输入一个新的电子表格中。

同时记录每个样品的孵育时间及土壤干重，从相应样品的荧光值中减去标准曲线的截距值，然后除以对应标准曲线的斜率。根据标准曲线方程，将样品的微摩尔数乘以91毫升（即土壤悬液中所用缓冲液体积），再将所得数值除以样品的特定孵育时间及干土质量。

最后将所得数值乘以1000，以获得所需的单位。结果来自一项实验性气候研究，该研究比较了经历环境气候条件的土壤与暴露于升高二氧化碳浓度和增温处理的土壤。此处展示的是在草原增温与二氧化碳富集试验点的对照样地和处理样地中的潜在胞外酶活性（EEAs）。在此示例中，在0至5厘米土层深度测得的潜在碳、氮和磷相关酶获取活性在不同实验处理间无显著差异。

然而，在5至15厘米的土壤深度，几种潜在的胞外酶活性（EEAs）存在显著差异。例如，与环境气候条件下的样地相比，高浓度二氧化碳和增温处理样地中的碳降解酶——β-1,4-葡糖苷酶和β-D-纤维二糖酶——活性较低；氮和磷矿化相关的酶活性在处理样地也低于环境气候条件下的样地，该现象出现在5至15厘米的土壤深度。

计算并绘制所有碳、氮或磷循环潜力胞外酶活性（EEAs）的总和，是观察土壤碳、氮和/或磷循环潜力的更广泛规律的有效方法。在本示例中，通过计算 β-1,4-葡萄糖苷酶、β-D-纤维素酶、β-木糖苷酶和 α-1,4-葡萄糖苷酶的潜在 EEAs 总和，来代表潜在的碳循环活性；通过计算 β-1,4-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶和 L-亮氨酸氨基肽酶的潜在 EEAs 总和，来代表潜在的氮循环活性。

磷酸酶用于表征潜在的磷循环活性。在5至15厘米的土壤深度，与环境气候条件下的样地相比，升高二氧化碳浓度并增温处理样地中的总碳、氮和磷循环相关的潜在胞外酶活性呈降低趋势。然而，该趋势仅在总氮和磷循环活性方面达到显著水平，土壤胞外酶活性在不同处理样地之间未表现出显著差异。

在0至5厘米土层深度。结果表明，不同处理样地中的酶活性和功能基团随土层深度呈现出相反的趋势，潜在的外酶活性（EEAs）比率是评估微生物养分需求的一种方法。在此，土壤酶、土体构型、碳氮比、碳磷比或氮磷比的活性在0至5厘米土层深度的不同处理样地之间存在显著差异。

然而，在高浓度二氧化碳和增温处理的样地，潜在的酶碳磷比和氮磷比更高。与环境气候条件相比，在5至15厘米的土壤深度，温度对土壤胞外酶活性（EEAs）具有显著影响。然而，在典型的实验室测定中，土壤酶活性通常在单一温度下测量，该温度可能与大气二氧化碳浓度升高条件下的实际温度不一致。

阿伦尼乌斯图（Aran plots）用于可视化活化能，其绘制方法为：以酶活性的对数为纵坐标，以温度倒数（换算为开尔文温度）为横坐标。活化能通常被定义为催化化学反应所需的最低能量，在此可作为酶催化反应温度敏感性的替代指标。较高的活化能表明酶对温度更敏感。

同样，活化能与Q10温度系数值直接对应。在两个土壤深度的各处理样地之间，对碳、氮和磷的胞外酶活性（EEA）潜在酶动力学的温度系数进行了评估，结果表明，在任一土壤深度，不同处理样地之间的EEA温度敏感性无显著差异。熟练掌握后，可在30分钟或更短时间内将12个样品接种至96孔微孔板中。

此外，在规定的孵育时间结束后，通常可在半小时内再次将酶标板进行离心、转移并使用酶标仪读数。在进行该实验操作时，务必保持移液的一致性，移液过程中任何气泡均会对实验结果产生不利影响。

为了进一步探究土壤微生物群落结构在其形成后对土壤功能的影响，还可以开展DNA提取和测序等其他方法。该技术为微生物生态学领域的研究人员探索陆地生态系统中的养分循环和生物地球化学过程奠定了基础。观看本视频后，您应能充分掌握如何定量测定潜在的酶活性。

此外，您应能够解读数据，以反映不同生态系统中微生物对气候和土壤类型等因素的潜在响应。使用荧光材料时，切勿忘记由于荧光基团对光敏感，应始终采取预防措施以尽量减少光照暴露。