潜在土壤胞外酶活性的高通量荧光测量

该程序的总体目标是量化土壤中细胞外酶降解其目标基质的最大潜在速率。这是通过首先在搅拌机中混合田间潮湿的土壤和缓冲液，然后将混合的样品移液到深孔样品板和深孔标准板中来实现的。将深孔板孵育和离心，然后将 250 μL 从深孔板的每个孔转移到相应的黑色平底孔中。

96 孔板。然后在荧光计上将三个板标记为红色，并分析所得数据。最终，潜在的土壤细胞外酶活性取决于酶催化反应从底物中释放荧光染料的速率，其中较高的荧光表示更多的底物降解。

与现有方法相比，该技术的主要优点是能够利用深 96 孔微孔板格式测量大量样品中的酶活性。当我们看到通过使其他方案适应深孔板形式来增加样品量的机会时，我们第一次想到了这种方法。这项技术的意义使我们能够更好地将微生物生理学与生态系统规模的过程联系起来。

目视演示对于这项技术至关重要，因为在书面程序中不容易遵循许多细微差别和样品处理。这种方法可以帮助回答微生物生态学和土壤生物地球化学领域的关键问题，例如土壤微生物如何响应环境的变化以及它们的生理响应如何影响关键的生态系统过程，例如分解和养分循环。虽然这种方法可以深入了解土壤有机质的分解和养分循环以及陆地生态系统，但它也可以应用于海洋和淡水系统。

通常，刚接触这种方法的人会遇到与该方案相关的移液技能和时间敏感性问题。此外，此过程生成的大量数据有时对于初次使用的用户来说是压倒性的。要开始分析设置，将三个深孔板标记为样品 MUB 标准品（4 个甲基和 beone）和 MUC 标准品（7 个氨基 4 甲基香豆素）。

将每种标准品和底物倒入单独的干净、预先标记的储液槽中，并按行定向。然后，按照文本方案中列出的方式将适当的 MUB 标准品移液到 MUB 标准板的相应孔中。对 MUC 标准品重复此过程，将其放入 MUC 标准板的相应孔中，以制备土壤浆液。

对于每个土壤样品，在加入搅拌机之前，称取 2.75 克田间潮湿土壤。加入 91 mL（50 mL）缓冲液，高速混合 1 分钟。将搅拌机内容物倒入干净的玻璃碗中，玻璃碗的宽度至少与带搅拌棒的八通道移液器一样宽。

在倒入碗中之前，土壤浆料可以通过大约 1 毫米的过滤器进行密封。将碗放在楼梯板上，混合土壤浆液。然后将 800 微升土壤浆液移液到样品板的第一列中。

对 MUB 标准板和 MUC 标准板的第一列执行相同作。在土壤样品之间用去离子水或缓冲液冲洗搅拌机、搅拌板和搅拌棒。对每个土壤样品重复此过程。

移动到每个后续样本的下一列。接下来，将适当的底物移液到样品板的相应孔中。如文本实验步骤中所列，为每个待测孵育温度准备一个样品板。

用板垫密封深孔板。用手倒置每个密封板，直到溶液完全混合。将板放入适当的培养箱中，按照文本方案中列出的所需孵育时间，将初始时间记录为零，以及每个孵育期结束时的适当孵育时间。

密封板以大约 2， 900 G 离心 3 分钟，离心转移后，从孵育的深孔板的每个孔中取 250 微升加入相应的黑色平孔中。底部 96 孔板。每个孵育的深孔板将使用一个黑色板。

将样品从孵育的深孔板转移到黑色平面中的相应孔中非常重要。底部 96 孔板，遵循制造商对所用 flora 公制读板器的说明。将激发波长设置为 365 纳米，将发射波长设置为 450 纳米。

装入其中一个标准板，将荧光计设置为自动增益并读取板。然后将增益设置为手动，并将值从最佳值减小到下一个最低数字，四舍五入到最接近的 5。对于每个标准板，对每个板重复测量两次。

接下来，加载样品板。将增益设置为自动并运行样品板。手动重新运行样品板以匹配每个标准板的最高增益。

通过将标准曲线荧光数据输入到 MUB 和 MUC 标准品的电子表格中来开始数据分析。将每个样品的微摩尔浓度转换为微摩尔浓度。标准曲线荧光数据，计算 MUB 和 MUC 标准品浓度的斜率 y 截距和 R 平方值。

每个样本的可接受 r 平方值应超过 0.98。标准曲线可以在散点图中可视化，其中荧光读数绘制为因变量，标准浓度绘制为自变量。将样品和底物原始荧光数据输入到新的电子表格中。

还包括每个样品的孵育时间和土壤干重，从相应的样品荧光值中减去标准曲线截距值，然后除以相应标准曲线的斜率。使用标准线方程，将样品微摩尔乘以 91 毫升，这是土壤浆液中使用的缓冲体积。将得到的值除以样品特定的孵育时间和干土质量。

最后将获得的值乘以 1000 以获得所需的单位。结果来自一项实验气候研究，将经历过环境气候条件的土壤与暴露于高二氧化碳的土壤进行了比较，并且加热处理表明，在对照地块和处理地块中，草原加热和二氧化碳富集位点的潜在细胞外酶活性或 EEA 升高。在这个例子中，在 0 到 5 厘米土壤深度下的潜在碳氮和磷酶采集活性测定与实验处理没有差异。

然而，在 5 到 15 厘米的土壤深度，几个潜在的 EEA 确实存在显着差异。例如，与环境气候条件图相比，碳降解酶 β 1 四葡萄糖杀虫剂和 β D cello 生物色浆在二氧化碳升高和加热处理地块中较低，与环境气候条件相比，处理地块中的氮和磷矿化酶也较低。土壤深度为 5 至 15 厘米。

计算和绘制所有碳氮或磷循环潜在 EEA 的总和可能是观察有关潜在土壤碳、氮和/或磷循环的更广泛模式的有用方法。在这个例子中，计算了 beta 1 4 glucco、beta D cello、生物水解酶、beta xlo 和 alpha one 4 glucco 电位 EEA 的总和，以表示潜在的碳循环活动。计算 dase 和 L 亮氨酸氨基肽酶中 β 1 4 N 乙酰葡萄糖的总和代表潜在的氮循环活性。

磷酸酶用于表示潜在的磷循环活性。与 5 至 15 厘米土壤深度的环境气候条件样地相比，二氧化碳和加热处理样地中总碳、氮和磷循环的潜在 EEA 呈较低趋势。然而，这一趋势仅对总氮和磷循环活动显著，土壤 EEA 在处理样地之间没有显著差异。

土壤深度为 0 至 5 厘米。结果表明，酶活性、处理区间响应土壤深度的功能群、潜在 EEA 的比例是评估微生物养分需求的一种方式。在这里，土壤酶、栉几何形状、碳与氮、碳与磷或氮与磷活性在土壤深度 0 至 5 厘米处的处理地间显著不同。

然而，在二氧化碳升高和加热处理地块中，潜在的酶碳磷和氮磷比更高。与土壤深度为 5 至 15 厘米的环境气候条件相比，温度会强烈影响土壤 EEA。然而，在典型的实验室分析中，土壤酶是在单一温度下测量的，这可能对应于 C 两种温度条件。

Aran 图用于可视化活化能，并使用酶活性的对数作为 x 轴上转换为开尔文度的逆温度的函数来绘制。活化能通常定义为催化化学反应所需的最小能量，这里用作酶催化反应的温度敏感性的代表。较高的活化能表示酶对温度敏感。

同样，活化能直接对应于 Q 10。温度系数值在两个土壤深度的两个处理样地中评估了碳、氮和磷 EEA 的潜在酶动力学，结果表明，在两个土壤深度的处理样地之间，EEA 的温度敏感性没有显著差异。掌握后，可在 30 分钟或更短的时间内将 12 个样品接种到 96 轮微量滴定板中。

此外，在规定的孵育时间后，您通常可以在尝试此过程时半小时内在尿路计上再次旋转、转移和读取板。始终如一地移液很重要。移液中的任何空气都会对您的结果产生不利影响。遵循此程序。

可以进行其他方法，如 DNA 提取和测序，以回答与土壤微生物群落组成在其发育后在土壤功能中的作用相关的其他问题。这项技术为微生物生态学领域的研究人员探索陆地生态系统中的营养循环和生物地球化学过程铺平了道路。看完这个视频后，您应该对如何量化潜在的酶活性有一个很好的了解。

此外，您应该能够解释数据以反映微生物对不同生态系统中气候和不同土壤类型等因素的潜在反应。不要忘记在使用荧光材料时，由于荧光部分的光敏性，应始终采取预防措施以尽量减少光照。