Name: 自由游泳弱电鱼的长期行为跟踪 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-06T13:15:00.000+00:00
Duration: 10 min 56 s
Description: 学习弱电鱼长期行为跟踪技术，通过同步记录电器官放电信号与红外视频，在感觉隔离室中实现自由游泳状态下的自发空间探索行为观测，揭示动物运动与主动电感采样之间的相互作用关系。

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本工作得到了加拿大自然科学与工程研究理事会（NSERC）和加拿大卫生研究院（CIHR）的大力支持。

本方案符合渥太华大学动物护理委员会的要求。作者声明无利益冲突。有关下述设备和材料的厂家及型号信息，请参见材料与试剂表。定制编写的 Spike2 和 MATLAB 脚本及示例数据见补充文件。
1. 水族箱和隔离室的设置
<ol>
	<li>抗- v校准平台搭建一个防震平台（2.1 m × 2.1 m），自下而上依次铺设橡胶垫、吸音泡沫板、船用胶合板和聚氨酯泡沫垫（图 1A在胶合板面板上放置四根木龙骨（5 cm × 10 cm），用于支撑水族箱的边缘。</li>
	<li>地暖加热器将电屏蔽加热元件铺设在具有热梯度的泡沫垫上（参见 图 1D 底部）。用电屏蔽金属网覆盖加热元件。</li>
	<li>空间坦克. 使用1.3 cm厚的钢化玻璃板、L形铝合金框架和水族专用硅胶构建一个宽而浅的水族箱（1.8 m × 1.8 m × 30 cm）（参见 图1A用一张大面积的白色背景板覆盖水箱底部，以提供高成像对比度（参见方案3）。</li>
	<li>将水族箱划分为一个中央区域（直径1.5 m）和四个角落隔间（见 图1B通过安装由亚克力板（哑光白色，0.64 cm厚）制成的壁障（22.5 cm高）来实现。
	<ol>
		<li>将四块丙烯酸板（22.5 cm × 102.7 cm）加热弯曲，制成四个弧形侧壁部分，使用硅胶密封剂将其固定在水箱底部，以分隔中央区域与四个角落隔间。弧形部分之间预留20 cm空间，用于安装闸门。</li>
		<li>通过安装四面带有15 cm间隙的双层隔板，将相邻的角落区域分隔开，以提供额外的电隔离以及用于水下传感器（如水听器）的安装空间。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>组装四个电动门，并将其安装在角落隔间与中央区域之间。
	<ol>
		<li>如图所示组装四个门框 图1C在每个门框上制作六个孔（深0.64 cm），嵌入尼龙六角螺母（螺纹直径0.64 cm），并用环氧树脂固定。</li>
		<li>从亚克力板和橡胶板上裁切出四个门板，并在亚克力板和橡胶板上各钻六个孔（直径0.64 cm），用于锁定装置。使用硅酮密封胶将亚克力板与橡胶板粘合。</li>
		<li>使用亚克力铰链将门板与门框连接。</li>
		<li>将摆动臂安装在伺服电机上，并将其固定在门框顶部（参见 图1C用扎带制作环，将摆动臂与门板连接起来。</li>
		<li>将门组件放置在弧形墙体部分之间形成的间隙处，并使用硅胶密封剂固定。</li>
		<li>将所有伺服电机连接至伺服控制器，并通过有源USB延长线将控制器连接至电源和计算机。使用伺服控制器配套的控制软件测试闸门。</li>
		<li>硅胶固化后，用尼龙螺丝锁紧所有闸门，逐个腔室注水，检查是否密封。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>隔离室. 构建一个隔离室以包围水族箱，并阻隔外部的光线、声音和电噪声（参见 图 1D).
	<ol>
		<li>制作三块墙板（2 m × 2 m × 5 cm）和四块门板（1.9 m × 0.95 m × 5 cm）。每块板均使用铝制型材（5 cm × 2.5 cm）拼接成矩形框架，并在铝框上铆接白色波纹塑料板。在板内填充吸音玻璃纤维棉，再以黑色波纹塑料板封底。</li>
		<li>在防振地板上安装三块墙板，并使用钢琴铰链将四块门板与墙板连接。</li>
		<li>用铝网包围隔离室，并将各个侧面的铝网接地，以构建法拉第笼。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>湿度控制安装低噪音排风扇（图 1F 顶部）以排出加热产生的多余湿气。将排风扇安装在距离记录位置至少 2 m 远处，并在隔离室与排风扇之间安装通风管。</li>
	<li>定期监测并维持水箱水质及动物的健康状况。
	<ol>
		<li>在10 cm水深条件下保持恒定的水质环境， 100 µS/cm 通过添加水或盐储备液调节至电导率和 pH 7.0（参见 Knudsen33 （具体配方见相关说明）。若 pH 值低于 6.5，则加入一袋碎珊瑚。</li>
		<li>安装可从浅水中运行的垂直式水族箱过滤器，用于清洁和充气图 1F 底部）。在记录期间断开滤器连接，并将其从中央区域取出。</li>
		<li>通过将活体黄粉虫用橡皮筋固定在吸盘上，放置于缸底。避免使用自由漂浮的猎物（如黑虫），以防止在记录过程中出现不受控的零星摄食行为。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. EOD 跟踪
<ol>
	<li>电极安装组装八个石墨电极，并将其等间距地布置在中央区域曲面壁上。
	<ol>
		<li>获取绘图铅芯（长度15 cm；Mars Carbon 2 mm HB型），并削去铅芯外层涂层。</li>
		<li>剪取八段长度为10 cm的同轴电缆（RG-174），将电缆芯线缠绕在石墨棒的一端，并套上热缩管以形成牢固且稳定的电连接。在另一端安装BNC插座连接器图 2A 左侧。</li>
		<li>将电极用胶带固定在墙面上，并在电极表面贴上细条状美纹纸以保护其免受硅胶污染。涂抹硅胶密封胶以永久固定电极，在硅胶固化前移除所有胶带。图 2A 右侧</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过测量每个电极到放大器单元的距离，截取相应长度的同轴电缆（RG-54），制作八根电缆组件，并在每根电缆两端安装BNC插头连接器。</li>
	<li>使用电缆组件将所有电极连接至放大器单元。通过配对两个电极进行差分放大 90° 定向电极（参见 图 2B，并通过将同轴屏蔽线连接到法拉第笼来接地。</li>
	<li>将放大器增益设置在信号饱和限值以下，并应用带通滤波器（200 Hz–5 kHz）以去除噪声。以40 kS/sec的采样率对四个记录电极对进行数字化。</li>
	<li>在线信号处理。说明文档以Spike2软件为基础编写，参数设置亦针对该软件进行了优化 Gymnotus sp.（参见 图 2C （用于总结）。
	<ol>
		<li>添加一个 DC 去除 过程（τ = 0.1 秒）应用于所有记录通道。</li>
		<li>添加一个 纠正 对所有记录通道执行该步骤。</li>
		<li>创建一个 虚拟 通过将全部四个记录通道相加来生成通道。</li>
		<li>通过叠加提取每个EOD脉冲的单峰包络 RMS 均方根， <img alt="Power equation for binomial expansion; mathematical symbol; educational content." fo:content-width="40px" src="/files/ftp_upload/50962/50962_clip_image002.gif" width="70px" data-altupdatedat="1787630408000"> ）过程（τ = 0.25 msec）到 虚拟 通道，用于在每个EOD周期生成一个单一峰，以明确确定脉冲时序。</li>
		<li>创建一个 realmark 通道来自 虚拟 设定适当的阈值以捕获所有EOD脉冲，避免遗漏脉冲的同时防止假阳性，然后记录通道中峰幅值的时间和数值。</li>
		<li>通过设置通道显示选项，实时监测瞬时EOD频率 realmark 通道至一个 瞬时频率 模式。</li>
		<li>实时监测鱼类运动，方法是复制 realmark 通道，并将显示选项设置为 波形 模式。</li>
		<li>通过创建EOD幅度斜率的均方根（RMS）来量化活动水平 虚拟 通道来自 realmark 通道（采样周期 0.01 秒），并添加斜率（τ = 0.25 毫秒）和均方根（τ = 0.5 毫秒）处理。</li>
		<li>导出 realmark 将Spike2软件中的通道数据转换为MATLAB格式。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 同步视频追踪
<ol>
	<li>创建背景场景。
	<ol>
		<li>使用哑光白色台面膜覆盖任何会在水面产生反射的物体，以将其隐藏。</li>
		<li>在天花板下方15 cm处安装一块哑光白色波纹塑料板，以遮挡摄像机和通风口。</li>
		<li>在一张大幅白纸上打印网格图案，用于相机校准，并将其放置在水箱下方，以提供高对比度的背景。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>安装光源。
	<ol>
		<li>获取红外LED灯，并拆除内置风扇以降低噪音。使用放置在法拉第笼外的恒流直流电源驱动LED。</li>
		<li>安装红外LED灯用于黑暗环境下的成像，安装白色LED灯用于为测试鱼类提供昼夜光周期。将所有光源朝向天花板照射，以实现间接且均匀的照明（图 3A）。</li>
		<li>通过定时开关控制白色LED灯，以调节昼夜光周期（例如 12小时开/12小时关）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在水族箱正上方安装摄像机。
	<ol>
		<li>获取一台近红外敏感摄像机，或通过击碎镜头组件后部的一层薄有色玻璃来移除红外阻挡滤光片。确保视场角足够宽，能够完整拍摄中央区域。</li>
		<li>在天花板面板中央开一个小型观察孔，并将摄像机直接置于孔的正上方。</li>
		<li>如果光源产生眩光，可在镜头周围安装白色环形遮光罩。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行时间同步的视频录制。
	<ol>
		<li>在水箱四个角落之一放置一个红外LED，以生成时间同步脉冲（脉冲持续时间为1毫秒，周期为10秒）。串联一个限流电阻（1 kΩ），并通过数据采集硬件的数字输出端口驱动该红外LED。</li>
		<li>如有可用，使用随摄像机附带的视频录制软件。选择最高录制质量（例如 无损压缩）和所支持的最高分辨率。</li>
		<li>在开始EOD记录之前立即启动视频录制，并在EOD记录结束后立即停止视频录制。</li>
		<li>录制完成后，通过信号数字化器和视频记录所捕获的首个与最后一个光脉冲之间进行线性插值，将图像帧编号转换为数字化器的时间单位。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>自动图像追踪 
	本说明针对MATLAB 图像处理工具箱编写，并使用其相关函数。本次提交附带一个自定义MATLAB脚本，用于实现自动图像追踪。
	<ol>
		<li>导入视频。使用"Videoreader.read"函数将视频文件直接导入MATLAB工作区。</li>
		<li>通过组合两个图像帧创建合成背景图像。将动物占据的图像区域替换为另一帧中相同区域的无动物图像（见 图 3B）。</li>
		<li>通过在中央区域周围绘制圆形掩膜来指定追踪的图像区域，以排除外部区域（图 3B 底部），并乘以一个常数（rint）以设定强度差异的最小阈值。例如，设定 rint = 0.85 可抑制低于背景15% = (1 - rint) 的强度波动。</li>
		<li>图像相减。将某一图像帧（=IMk）减去背景图像（=IM­0），得到差分图像（=ΔIMk）。使用无符号整数数值精度存储图像强度值，使其为非负整数。</li>
		<li>应用由graythresh函数确定的强度阈值对差分图像进行分割。使用bwmorph函数清理二值图像，并在利用regionprops函数计算所有斑块面积后，选择对应于动物的最大斑块。</li>
		<li>应用regionprops函数确定最大斑块的质心和主方向轴，并旋转图像使主轴与x轴对齐。在质心处分割图像为头部和尾部两部分（图 3D 顶部）。</li>
		<li>确定头部部分的主轴，并旋转整个图像使其与x轴对齐（图 3D 左下）。使用regionprops函数沿各自主轴为头部和尾部部分拟合边界框。</li>
		<li>确定边界框左侧、中心和右侧垂直边缘处斑块的中位y坐标（图 3D 右下绿色点）；并将它们分配给五个特征点（头尖、头中、体中、尾中、尾尖）。</li>
		<li>对以动物前一帧确定的质心为中心裁剪后的图像帧进行连续处理。</li>
		<li>手动指定第一帧的头部朝向，并利用连续两帧间朝向向量的点积自动判断后续帧的头部朝向。检查结果，若朝向判断错误则手动翻转。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过连接头尖点绘制动物轨迹，并在轨迹出现抖动时使用中值和均值滤波器（n=3）进行平滑处理。将轨迹叠加到背景图像上，并利用五个特征点插值拟合鱼体中线（见 图 2E）。</li>
	<li>通过重采样瞬时EOD频率（采样率为100 Hz）并取平均（时间窗口为0.0625秒），计算每次图像采集时刻的平均EOD频率。根据对应时间的EOD频率以伪彩色绘制轨迹，并叠加背景图像（见 图 2F）。</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本技术的意义。 综上所述，我们首先描述了用于观察弱电鱼（WEF）自发探索行为的大型水族箱和隔离室的构建方法。接着，我们展示了利用多对电极实时记录并追踪自由活动鱼类的放电频率（EOD率）和运动状态的技术。最后，我们介绍了通过水体进行红外视频录制的时间同步技术，以及用于测量鱼体位置和姿态的图像追踪算法。作为一种实验准备模型，弱电鱼（WEF）在研究主动感知引导行为方面具有重要优势，因其放电频率（EOD率）易于量化，且等同于主动电感觉采样频率。结合这些技术，可实现对自由活动的弱电鱼（WEF）自发行为进行精确且可靠的长期观察8。此外，本实验装置的大部分组件均可采用广泛可得的建筑材料和易于获取的电子元件构建。本文所述技术系近年来为满足本实验室实验需求而开发并经过验证。因此，我们推荐将这些技术应用于未来对自由游动弱电鱼（WEF）自发探索行为的研究中。
隔离室。隔离室通过不同程度地屏蔽外部光源、振动、声音和电噪声，提供高度可控的实验环境。为测试其遮光性能，将一台电动摄像机置于黑暗的隔离室内，并通过远程云台控制扫描所有位置，未观察到任何外部光...

背景动物行为的定量实验例如 强迫选择，电击回避，T型迷宫 等等通常用于研究有关感觉运动技能、学习和记忆形成的特定假设。然而，这些受限的实验忽略了自然动物行为的许多丰富性。&#160;并且可能导致对行为潜在神经机制的模型过于简化。因此，在更接近自然条件下的实验是我们充分探索物种行为谱系的重要补充。然而，涉及自由活动动物的实验必须应对一些独特的技术挑战，例如由运动引起的记录伪迹。与刺激诱发的反应不同，自发产生的探索性行为无法预测，因此需要对实验对象进行长时间的持续监测与追踪。特定的研究问题应通过精心选择的实验生物和现有的技术工具来最佳地解决。例如，光学记录与刺激技术，如基因编码的钙传感器1 光遗传学2 已成功应用于自由活动的遗传学模式生物3-5或者，微型化神经遥测系统可记录并刺激自由活动的小型动物6,7.
电鱼。弱电鱼物种会产生电&#160;器官放电（EOD），使其能够感知周围环境，或在较远距离进行交流。EOD 的时间模式在不同条件下会发生变化，例如自身运动8,9、感觉刺激10,11以及社会互动12,13。脉冲型弱电鱼物种产生一系列离散的脉冲，而波动型物种则产生连续的准正弦波形。通常情况下，与波动型物种相比，脉冲型物种的 EOD 频率更具可变性；且动物的 EOD 频率能紧密反映其感觉环境中新异刺激的含量10,14。脉冲型物种在面对新异感觉干扰时（即新异性反应10,11,14），可在单个脉冲周期内立即缩短脉冲间间隔（IPI）。这些鱼类持续的电行为可能受到外部来源的非受控感觉刺激的干扰；已知振动、声音、电和光等各种刺激均可诱发新异性反应。因此，在对自由游动的弱电鱼进行长期观察时，必须采取特殊预防措施，以屏蔽或减弱外部感觉刺激。如此，EOD 频率的变化和运动轨迹的改变才能明确归因于实验者所施加的刺激。
水族箱和隔离室。 因此，我们在一个大型水族箱（2.1 m × 2.1 m × 0.3 m）下方放置了多层减振材料，并用隔热外壳包围水族箱，以屏蔽外界的光照、电噪声、声音和热流。放电频率（EOD）依赖于周围温度15,16，因此将水温严格控制在适合南美洲弱电鱼物种的热带范围（25±1 °C）。我们构建了一个大而浅的水箱（水深10 cm），以观察主要限制在二维空间内的弱电鱼的空间探索行为（图&#160;1A）。水箱被划分为中央实验区用于观察空间行为，以及四个角落的独立隔间，分别饲养个体鱼（图&#160;1B）。每个隔间均密封防水，以防止个体之间通过电信号相互交流。通过外部控制四个电动闸门，调节动物进入中央区域的通路。闸门设置在隔间之间，当用尼龙翼形螺母锁紧时可实现防水密封。水下未使用任何金属部件，因为弱电鱼对金属极为敏感。
放电记录。放电（EOD）以刻板的方式产生：在裸臀鱼科（Mormyrids）中由单一电器官激活产生，而在 Gymnotiforms 中则由多个空间分布的电器官共同激活产生17,18。EOD 频率的时间调制可反映高级神经活动，因为延髓起搏核接收来自更高级脑区（如间脑预起搏核）的直接神经输入，而后者又接收来自前脑的轴突投射19。然而，EOD 时间点必须从原始波形记录中仔细提取，避免受到动物运动所引起的信号失真干扰。弱电鱼（WEF）产生的电场可近似为一个电偶极子，因此记录电极处的 EOD 脉冲幅度取决于动物与电极之间的相对距离和空间取向8,20。动物的自主运动改变了其与电极之间的相对几何关系，导致不同电极上的 EOD 幅度随时间发生剧烈波动（见 Jun 等8 的图&#160;2B）。此外，自主运动还会改变记录到的 EOD 波形形状，因为不同部位电器官的相对贡献取决于它们沿体长的分布位置以及尾部弯曲所引入的局部曲率变化。运动引起的 EOD 幅度和波形形状的失真会导致 EOD 时间点测量不准确且不可靠。我们通过空间平均多个不同位置记录的 EOD 波形，并结合包络提取滤波器，精确确定自由游动 WEF 的 EOD 时间点，从而克服了这些问题。此外，我们的技术还可测量 EOD 幅度，根据 EOD 幅度随时间的变化判断动物处于静息状态还是活跃运动状态（见图&#160;2E 和2F）。我们记录了电极对之间的差分放大信号，以降低共模噪声。由于 EOD 脉冲在不规则的时间间隔产生，EOD 事件时间序列具有可变的采样率。如有分析工具需要，可通过插值将 EOD 时间序列转换为恒定采样率。
视频记录。尽管EOD记录可监测动物的大体运动活动，但视频记录能够直接测量动物的身体位置和姿势。使用近红外（NIR）照明（λ = 800~900 nm）可在不受干扰的情况下对自由游动的鱼类进行视觉观察21,22，因为弱电鱼在黑暗环境中最为活跃，且其眼睛对NIR光谱不敏感23,24。大多数数字成像传感器（例如 CMOS或CCD）在移除红外（IR）阻挡滤光片后，能够捕捉波长范围在800-900 nm之间的NIR光谱25。某些高端消费级网络摄像头具备高清分辨率、广视角和良好的低光灵敏度，其成像质量可媲美甚至优于价格昂贵得多的专业级红外摄像头。此外，部分消费级网络摄像头附带的录制软件可通过无损压缩实现长时间视频录制。大多数专业级摄像头提供时间同步TTL脉冲输出或触发TTL脉冲输入26，以实现视频与数字化信号之间的时间对齐，但该功能在消费级网络摄像头中通常不具备。然而，可通过摄像头和信号数字化器同步采集一个周期性闪烁的红外LED信号，从而精确匹配视频记录与信号数字化器之间的时间关系。初始和最终的红外脉冲时间可作为两个时间校准标记，用于将视频帧编号转换为信号数字化器的时间单位&#160;，反之亦然。
照明 &amp;#38; 背景通过水体进行成像在技术上具有挑战性，因为水面会产生光线反射。水面可起到镜面作用，反射水面上方的视觉场景，从而遮蔽水下视觉特征；因此必须使水面上方场景无显著特征，以防止视觉干扰。为了对整个水族箱进行成像，相机需置于水面正上方，并隐藏在天花板后方的一个小型观察孔内，以避免其在水面产生反射。此外，若光源投射方式不当，水面可能产生眩光和照明不均。通过将光源朝向天花板投射，利用天花板及周围墙壁反射并散射光线，再照射到水面，可实现间接照明，从而在整个水族箱范围内获得均匀亮度。选择与相机光谱响应相匹配的红外照明器例如 峰值波长为850 nm）。通过使用LED光源并将直流电源置于法拉第笼外，可最大限度减少光源产生的电噪声。在鱼缸下方放置白色背景，因为在近红外波长下，鱼类在白色背景上具有良好的对比度。同样，在隔离室内部表面使用哑光白色材料，可提供均匀且明亮的背景照明。
视频追踪。视频录制完成后，可利用自动化的图像追踪算法来测量动物随时间变化的身体位置和姿态。视频追踪可通过现成软件（如 Viewpoint 或 Ethovision）或用户可编程软件（如 OpenCV 或 MATLAB&#160;图像处理工具箱）自动完成。图像追踪的第一步是通过绘制几何形状定义有效的追踪区域，以排除外部区域（即掩膜操作）。接下来，需通过从包含动物的图像中减去背景图像，将动物图像从背景中分离出来。将相减后的图像通过设定强度阈值转换为二值格式，从而可通过二值形态学运算计算出质心和方向轴。在裸背电鳗目27-29和长颌鱼目30-32中，电感受器密度在头部区域最高；因此，任意时刻的头部位置即代表感觉敏锐度最高的位置。通过图像旋转和边界框操作可自动确定头部和尾部的位置。头部与尾部的区分可通过在第一帧中手动定义，并通过比较连续两帧间的位置变化持续追踪其位置来实现。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;水族箱构建&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>电屏蔽地板加热器</td><td>ThermoSoft Corp., IL, USA</td><td>ThermoTile</td><td>www.thermosoft.com</td></tr><tr><td>钢化玻璃板</td><td>通用</td><td></td><td>厚度0.5英寸，用于水族箱构建</td></tr><tr><td>水族箱级硅胶</td><td>通用</td><td></td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>亚克力板</td><td>通用</td><td></td><td>厚度0.25英寸，哑光白色</td></tr><tr><td>天然橡胶板</td><td>通用</td><td></td><td>厚度0.25英寸</td></tr><tr><td>伺服电机</td><td>HTECHRCD Inc., Korea</td><td>HS-325HB，180度旋转</td><td>www.servocity.com</td></tr><tr><td>伺服电机臂安装件</td><td>HITECHRCD Inc., Korea</td><td>56362 大花键</td><td>www.servocity.com</td></tr><tr><td>伺服电机控制器（6通道）</td><td>Sparkfun</td><td>ROB-09664</td><td>Micro Maestro 6通道USB伺服控制器</td></tr><tr><td>主动式USB延长线缆</td><td>C2G</td><td>38990</td><td>12米USB 2.0 A公对A母4端口主动式延长线缆</td></tr><tr><td>排风扇</td><td>Nutone</td><td>ILFK120</td><td>www.homedepot.com</td></tr><tr><td>垂直水族箱过滤器</td><td>Tetra, Germany</td><td>Whisper内部动力过滤器 - 40i</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>碎珊瑚</td><td></td><td></td><td>用于提高水箱水体的pH值</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;EOD记录装置&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>石墨电极</td><td>Staedtler, Germany</td><td>Mars Carbon 2毫米HB型</td><td>削去外层涂层</td></tr><tr><td>生理放大器/滤波器</td><td>Intronix, Canada</td><td>2015F</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>同轴电缆</td><td>通用</td><td>RG174</td><td>用于电极组装</td></tr><tr><td>同轴电缆</td><td>通用</td><td>RG54</td><td>用于布线</td></tr><tr><td>RG-174用BNC插座连接器</td><td>Amphenol Connex</td><td>112160</td><td>用于电极组装</td></tr><tr><td>RG-54用BNC插头连接器</td><td>Amphenol Connex</td><td>112116</td><td>用于布线</td></tr><tr><td>信号数字化硬件</td><td>Cambridge Electronic Design, UK</td><td>Power MKII 1401</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>信号数字化软件</td><td>Cambridge Electronic Design, UK</td><td>Spike 2. 版本 7</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;视觉追踪装置&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>白色LED灯</td><td>IKEA, Sweden</td><td>DIODER 201.194.18</td><td>www.ikea.com</td></tr><tr><td>红外LED灯（850 nm）</td><td>Scene Electronics, China</td><td>S8100-60-B/C-IR</td><td>拆除内置风扇</td></tr><tr><td>USB网络摄像头</td><td>Logitech Inc., CA, USA</td><td>C910</td><td>拆除红外阻挡滤光片</td></tr><tr><td>电动摄像头</td><td>Logitech Inc., CA, USA</td><td>Quickcam Orbit</td><td>拆除红外阻挡滤光片</td></tr><tr><td>视频录制软件</td><td>Logitech Inc., CA, USA</td><td>Logitech Quickcam 软件</td><td>从www.logitech.com下载</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>Mathworks, MA, USA</td><td>2012a</td><td>图像处理工具箱</td></tr></tbody></table>

长期行为追踪自由游动的弱电鱼

Long-term Behavioral Tracking of Freely Swimming Weakly Electric Fish

长期行为追踪能够捕捉并量化动物的自然行为，包括那些罕见发生的行为。探索行为和社会互动等行为最适合通过观察无束缚、自由活动的动物来进行研究。弱电鱼（WEF）通过发出电器官放电（EOD）表现出易于观察的探索性和社会性行为。本文中，我们描述了三种有效技术，可长时间同步测量自由游动弱电鱼的EOD、身体位置和姿态。首先，我们介绍了在隔离室内部构建实验水箱的方法，该隔离室可屏蔽光、声音和振动等外界感觉刺激源。水族箱被分隔为四个区域，以容纳四个测试样本，并通过远程控制的自动门控制动物进入中央实验区域的通道。其次，我们描述了一种从自由游动弱电鱼中精确且可靠地实时测量EOD时序的方法。通过空间平均和时间处理步骤校正由动物身体运动引起的信号失真。第三，我们介绍了一种水下近红外成像系统，用于观察不受干扰的夜间动物行为。利用红外光脉冲实现视频与生理信号在长时间记录过程中的时间同步。我们开发的自动化追踪软件可在水生环境中可靠地测量动物的身体位置和姿态。综合而言，这些技术使得对自由游动弱电鱼的自发行为进行长期、可靠且精确的观察成为可能。我们认为，该方法也可类似地应用于其他水生动物的研究，将其生理信号与探索性或社会性行为相关联。

EOD 跟踪结果
来自不同电极对的记录EOD波形，由于其独特的位置和方向，其幅度和形状如预期般存在差异（图2C 顶部）。使用多个电极对可确保在弱电鱼位于水箱内任意位置和方向时均能获得强信号接收。包络波形（图2C 底部，绿色迹线）每个EOD周期始终仅包含一个峰值，可作为可靠的时间标记，用于精确确定脉冲间间隔和瞬时EOD频率（=IPI-1）。连续的EOD峰值被连接并以恒定时间间隔进行线性插值（图2D 顶部，黑色迹线），瞬时EOD频率同样以恒定时间间隔进行插值（图2D 底部，粉色迹线）。恒定时间重采样程序有助于运动轨迹与EOD信号之间的时间同步，并可利用更多适用于恒定采样时间序列数据的分析工具。动物静止时，外部电极记录的EOD幅度保持恒定（图2E 顶部），但当动物运动时，由于偶极子位置和方向的变化，EOD幅度随时间发生变化（图2F 顶部）。因此，可通过观察EOD幅度随时间...

我们介绍了一组技术，用于长时间研究自由游动的弱电鱼的自发行为，通过在特制的感官隔离室内的专用鱼缸中，同步且准确可靠地测量动物的电器官放电时间、身体位置和姿态。

长期行为追踪能够捕捉并量化动物的自然行为，包括那些罕见发生的行为。例如探索行为和……

本实验的总体目标是通过同步记录自由游动鱼类的生理信号和视频，来观察其自发的空间探索行为。为此，需构建一个被感官隔离室包围的大型实验水箱。随后，构建一个多通道电生理记录装置，以精确且可靠地测量发电器官放电。使用红外视频相机同步追踪动物的身体姿势和运动轨迹。获得的结果展示了动物身体运动与其主动电感觉采样频率之间的相互作用。该技术相较于现有方法（例如通过施加外部刺激以限制动物活动来诱发诱发电位）的主要优势在于，能够以非侵入方式观察自由活动动物的自发性和自然行为。该方法有助于解答神经病理学领域中的一些关键问题，例如在自主引导的探索行为过程中主动感知所起的作用。当我们开始研究脉冲型弱电鱼在自主探索和空间学习过程中主动电感觉采样的作用时，首次提出了这一方法。由于运动引起的记录伪影，以及通过水体进行照明和成像所伴随的技术难题，对该方法进行视觉化演示至关重要。该实验腔室置于抗振动表面上，表面内含电屏蔽加热元件，并覆盖有热梯度泡沫垫。水族箱由中央区域和四个角落隔间组成，隔间之间由电动门分隔，用于记录电器官放电。在中央区域的弧形壁上等间距安装八个石墨电极。使用电缆组件将所有电极连接至放大器单元。通过将两个相互呈90度方向的电极配对，进行差分放大。务必通过将所有同轴屏蔽线连接到法拉第笼来接地。使用 Spike2 软件调节信号处理，并为所有记录通道添加直流去除（DC remove）处理步骤。接下来，为所有记录通道添加整流（rectify）处理步骤。通过将全部四个记录通道求和来创建一个虚拟通道。通过对虚拟通道应用均方根处理，提取每次EOD脉冲的单峰包络。接着，从虚拟通道生成一个真实的标记通道。将阈值设定为能够捕捉所有EOD脉冲并避免假阳性的水平。为实时监测EOD频率，请将实标记通道的通道显示选项设置为瞬时频率模式。通过复制实标记通道并将其显示选项设为波形四模式，可实时监测鱼类运动。为了从EOD幅度斜率的均方根计算活动水平，需从真实的标记通道创建一个虚拟通道，然后添加斜率和均方根处理步骤。在Spike2软件中将真实标记通道导出为Matlab格式。为创建背景场景，使用哑光白色台面膜覆盖任何会在水面产生反射的物体。在天花板下方安装一块哑光白色面板，以隐藏摄像机和通风口。接着，安装白色LED灯以维持昼夜光照周期，同时安装红外LED灯用于在黑暗环境中的成像。将所有光源朝向天花板照射，以实现间接且均匀的照明。通过天花板面板上的一个小观察孔指向一台近红外相机，并确保视场角足够宽，能够拍摄到整个中央区域。为了进行时间同步的视频录制，在四个水箱角落之一放置一个红外LED，以产生时间同步脉冲。串联一个限流电阻，并通过数据采集硬件的数字输出端口驱动LED。使用专用软件，选择支持的最高录制质量和最高分辨率。在开始EOD记录之前立即启动视频录制。将鱼放入实验腔室后，记录其自发行为一段预设的时间。记录结束后，通

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自由游泳弱电鱼的长期行为跟踪

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长期共养水生动物的视频追踪：以挪威龙虾（Nephrops norvegicus）每日运动活动为例

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癫痫斑马鱼模型中的行为与生理学分析

本文介绍了对一系列墨西哥洞穴鱼行为进行高通量研究以及对机械感觉系统进行活体染色的方法。这些方法采用免费软件和自制脚本，为行为学研究提供了实用且经济高效的技术方案。...

墨西哥洞穴鱼的行为追踪与神经丘成像

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墨西哥洞穴鱼睡眠与运动活动的自动化测量

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斑马鱼游泳过程中后侧线传入神经元的活动

成年斑马鱼在脊髓损伤后具有功能恢复能力，是阐明神经再生内在机制的首选模型系统。本文中，我们描述了游泳耐力和游泳行为检测方法，作为脊髓再生功能的评估指标。...

成年斑马鱼游泳耐力与游泳行为的评估

斑马鱼在细胞生物学和生理学研究中具有显著的光学透明优势。本文描述了在个体动物中测量细胞生长的可靠方法，这些方法能够提供新的见解，揭示骨骼肌及邻近组织的生长如何与整体身体生长相协调。...

对经历电活动改变的单条活体斑马鱼骨骼肌生长进行实时和重复测量

多室社交偏好实验已从啮齿类动物改良应用于斑马鱼，有助于在模式生物中研究社交行为。本方案验证了一种低成本的三室开放式水箱实验方法，利用网络摄像头和开源软件测量斑马鱼的社交偏好，使其更适用于本科生科研与教学。...

使用三室开放式自由游动实验检测斑马鱼（Danio rerio）社会偏好行为的低成本替代方法

学习弱电鱼长期行为跟踪技术，通过同步记录电器官放电信号与红外视频，在感觉隔离室中实现自由游泳状态下的自发空间探索行为观测，揭示动物运动与主动电感采样之间的相互作用关系。

长期行为追踪自由游动的弱电鱼

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