Name: 使用大蜡螟作为模式生物来研究嗜肺军团菌感染 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 30 s
Description: 了解如何使用大蜡螟幼虫作为模式生物来研究嗜肺军团菌的感染机制。该方法通过注射接种、监测存活率及血细胞分析，为细菌毒力因子研究提供快速且符合伦理的体内实验平台。

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C.R. Harding 获得了惠康信托基金学生奖学金 WT086724 的资助。

1. 感染用L. pneumophila的制备
<ol>
	<li>制备活性炭酵母提取物（CYE）平板（每升含2 g活性炭、10 g酵母提取物、13 g琼脂、10 g N-(2-乙酰氨基)-2-氨基乙烷磺酸（ACES）、1 g α-酮戊二酸、0.4 g盐酸L-半胱氨酸和0.25 g焦磷酸铁，pH值为6.9）。 
	注意：如有需要，可在CYE平板中添加卡那霉素（25 μg/ml）和/或氯霉素（6 μg/ml）。
	<ol>
		<li>所有L. pneumophila操作均须在符合当地规定的微生物安全柜（MSC）中于生物安全二级（BSL-2）条件下进行。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从-80 °C甘油保存菌种中划线接种L. pneumophila至CYE平板</li>
	<li>在37 °C下培养平板4天。 
	注意：与培养3天相比，培养4天可显著增强L. pneumophila在G. mellonella中的毒力。</li>
	<li>感染前一天，将一环细菌（包含数个菌落）重悬于1 ml预热（37 °C）的ACES酵母提取物（AYE）肉汤中，并使用分光光度计测定600 nm处的吸光度（OD600）。</li>
	<li>接种新鲜的3 ml AYE培养基（如需要可加入抗生素），调整终浓度OD600为0.1。
	<ol>
		<li>设置仅含培养基的对照组，以确保培养基无菌。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在37 °C、200 rpm振荡培养箱中培养21小时。 
	注意：用于感染的细菌应生长至衰亡期38。培养21小时有助于实验标准化。 
	注意：如需诱导蛋白表达，可于过夜培养时加入0.5 mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）。</li>
	<li>测定OD600（细菌应处于衰亡期生长阶段，OD600为2.5–3）。</li>
	<li>用无菌的Dulbecco磷酸盐缓冲液（D-PBS）将细菌培养物稀释至1 × 109 CFU/ml。 
	注意：根据先前结果，OD600为1时相当于1 × 109 CFU/ml，但不同L. pneumophila菌株应另行验证。 
	注意：如需从质粒诱导蛋白表达，应在接种物中加入1 mM IPTG。</li>
	<li>按照第9节所述方法对接种物进行涂板，作为对照以确认接种物中含有预期的CFU数量。</li>
</ol>
2. 幼虫的制备
<ol>
	<li>购买足够的 G. mellonella 来自商业供应商的幼虫。幼虫在5时发货th 或 6th 龄期阶段（长度约为2-3厘米），可立即使用。 
	注意：此前已有文献描述过一种幼虫饲养方法39 . 
	注意：幼虫可在室温下保存长达两周，无需喂食。一旦发现幼虫出现化蛹迹象，应立即丢弃。</li>
	<li>在10 cm的培养皿底部放置一张直径为10 cm的滤纸，用于幼虫的容器准备。</li>
	<li>使用钝头镊子将十只大小相近的健康幼虫放入培养皿中。 
	注意：丢弃呈褐色或带有斑驳外观的不健康昆虫。健康的幼虫体色均匀，呈乳白色，无深色变色区域，且在翻转后能够迅速自行恢复体位。</li>
</ol>
3. 感染G. mellonella 幼虫
<ol>
	<li>通过将一张圆形滤纸用胶带固定在表面，制备注射平台。</li>
	<li>将一个P1000枪头水平牢固地用胶带固定在滤纸上，以形成注射平台。此步骤无需无菌操作。</li>
	<li>通过吸取70%乙醇并孵育至少10分钟，对20 μl微量注射器进行灭菌。
	<ol>
		<li>注射时需佩戴防穿刺手套，</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过多次吸取并排出无菌水，去除残留的乙醇。</li>
	<li>使用注射器吸取10 μl浓度为1 × 109 CFU/ml的L. pneumophila菌悬液。</li>
	<li>取一只幼虫，轻轻但稳固地将其翻转至背部，并弯曲覆盖在P1000枪头上。</li>
	<li>将注射器针头置于幼虫前部右侧的腹足上方。</li>
	<li>轻柔地将针头插入腹足，确保针头进入幼虫体内，并平稳地将注射器内全部内容物注入。 
	注意：若注射器插入正确，应可仅用注射器挑起幼虫，并将其放入培养装置中。
	<ol>
		<li>注射后观察幼虫数秒。幼虫在数秒后会开始爬行，但不应有液体渗出。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>感染后数小时内短暂观察幼虫；以107 CFU L. pneumophila 130b感染幼虫在感染后前5–8小时不会引起任何症状。因此，若幼虫在此时间之前出现变灰或变黑现象，应终止实验。 
	注意：在整个实验过程中，使用1 mM IPTG接种幼虫不会影响幼虫的存活率。</li>
	<li>以相同方法，每种条件共注射10只幼虫，包括10只注射D-PBS的幼虫作为对照，用于分析幼虫死亡率。</li>
	<li>用胶带将培养皿封闭，并置于二级生物安全容器中。</li>
	<li>在标准细菌培养箱中于37 °C孵育，持续整个实验过程。</li>
</ol>
4. 使用化学抑制剂对幼虫进行预处理
<ol>
	<li>感染前，按照第3.1-3.6节所述方法准备用于注射的幼虫。</li>
	<li>向10只幼虫的前部左侧伪足注射10 μl浓度为100 μM的细胞松弛素D溶液。 
	注意：为减少对幼虫的损伤，抑制剂应注射于与细菌悬液不同的伪足。</li>
	<li>向10只幼虫的伪足注射10 μl DMSO作为对照。</li>
	<li>将幼虫在37 °C下孵育4小时。</li>
	<li>按照第3节所述方法，将经预处理的幼虫在其前部右侧伪足注射1 × 107 CFU的野生型 L. pneumophila 或PBS对照。</li>
</ol>
5. 幼虫死亡率分析
<ol>
	<li>感染后18小时（p.i.），检查所有感染幼虫的死亡情况。</li>
	<li>检测死亡率时，使用尖端钝化的镊子将幼虫翻转，观察其腿部是否活动；健康的幼虫应能迅速恢复正常体位。体色变深提示对感染产生了较强的免疫反应。若有任何活动，均记为存活。</li>
	<li>记录死亡与存活幼虫的数量。</li>
	<li>在所有其他选定的时间点重复此过程。 
	注意：若培养时间超过三天，可能会出现蛹。需在变态发生前及时移除蛹，并置于-20°C冷冻处死。</li>
</ol>
6. 血淋巴的提取
<ol>
	<li>在选定的时间点（如感染后 5 小时和 18 小时），随机选取三条幼虫，放入一个 14 ml 的离心管中，</li>
	<li>将该离心管置于冰上 5–10 分钟，直至观察不到幼虫腿部的任何运动。</li>
	<li>将麻醉后的幼虫放置于培养皿中，使用解剖刀在靠近幼虫尾部的两个体节之间做一切口。</li>
	<li>挤压幼虫，使其血淋巴流入无菌的 1.5 ml 离心管中以收集血淋巴。
	<ol>
		<li>至少合并三条个体的血淋巴。每条幼虫可提供 15–50 μl 血淋巴，具体体积取决于幼虫大小。 
		注意：在提取血淋巴过程中，极易破坏肠道，导致样本潜在污染。为减少污染，应在靠近尾部（远离肠道）处切开幼虫，但接种细菌时仍必须进行抗生素筛选。 
		注意：为防止血淋巴变褐并凝固，应在采集后 10 分钟内完成血淋巴的处理。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将幼虫残体弃入新的 14 ml Falcon 管中，密封后于 -20 °C 过夜，以确保幼虫完全死亡。</li>
	<li>对死亡幼虫进行高压灭菌，并根据当地规定进行处置。</li>
</ol>
7. 血细胞活力的测定
<ol>
	<li>按照上述方法提取血淋巴。</li>
	<li>在96孔板的一个孔中，将20 μl提取的血淋巴与20 μl PBS中含0.02% (v/v) 台盼蓝的溶液混合。</li>
	<li>室温孵育5分钟。</li>
	<li>取10 μl血淋巴样品加入血细胞计数板，计数有活性（未染成蓝色）的细胞。</li>
	<li>每个样本重复计数三次，以减少误差。</li>
</ol>
8. 用于免疫荧光显微镜检测的提取血细胞处理
<ol>
	<li>取至少三只幼虫的混合血淋巴，用移液器将其滴加到24孔板中的10–15 mm玻璃盖玻片上。 
	注意：盖玻片无需特殊处理，因为血细胞可自然黏附于玻璃表面。</li>
	<li>加入0.5 ml D-PBS，通过上下吹打充分混匀。</li>
	<li>使用防气溶胶的离心板架，在室温（RT）下以500 ×&#160;g离心10分钟。</li>
	<li>使用倒置显微镜观察每个孔，确认血细胞已黏附。</li>
	<li>吸除上清液，并通过向孔壁加入0.5 ml D-PBS，轻轻摇动2–3次，再用移液器吸出D-PBS的方式小心清洗细胞三次。</li>
	<li>加入0.5 ml含4%（v/v）多聚甲醛（PFA）的PBS溶液固定细胞。</li>
	<li>在室温下孵育20–30分钟。</li>
	<li>用D-PBS清洗细胞三次，方法同前。</li>
	<li>加入0.5 ml含15 mM NH4Cl的PBS溶液，以淬灭残留的PFA，并在室温下孵育15分钟。</li>
	<li>用D-PBS清洗细胞三次。 
	注意：此时盖玻片可在4 °C下保存过夜。</li>
	<li>加入0.5 ml含0.1% Triton X-100的PBS溶液，在室温下孵育5分钟，以通透细胞膜。</li>
	<li>用封闭液（含2%（w/v）BSA的PBS）在室温下封闭1小时。</li>
	<li>在室温下避光孵育1小时，加入按厂家推荐稀释比例用封闭液稀释的一抗。</li>
	<li>用PBS清洗三次。</li>
	<li>加入二抗和DAPI，在室温下避光孵育1小时，用于细菌的可视化检测（方法同上）。</li>
	<li>用PBS清洗三次。</li>
	<li>在载玻片上滴加一滴封片试剂，将盖玻片封片。</li>
	<li>在室温下避光孵育过夜，使封片液完全干燥。</li>
	<li>在荧光显微镜下观察载玻片样本。</li>
</ol>
9. 细菌菌落形成单位（CFU）的定量
<ol>
	<li>在 CYE 平板中加入 100 μg/ml 萘啶酸，以避免肠道菌群污染。L. pneumophila 菌株 130b 对萘啶酸天然耐药40。</li>
	<li>在提取血淋巴之前，称量 1.5 ml 离心管的重量。</li>
	<li>按照第 6 节所述方法提取血淋巴，并置于已称重的离心管中，加入 1 μl 的 5 mg/ml 皂苷，充分混匀后在室温下孵育 5 分钟以裂解血细胞。</li>
	<li>再次称量含有血淋巴的离心管，确定所提取血淋巴的重量。</li>
	<li>用无菌 AYE 培养基对血淋巴进行十倍系列稀释。</li>
	<li>使用记号笔将 CYE 平板底部均分为六个区域并标记。</li>
	<li>在每个区域中，分别点加 25 μl 每个稀释度的样品三滴（从最高稀释度开始）。</li>
	<li>将平板倒置，在 37 °C 下孵育过夜。</li>
	<li>待液滴完全干燥后，将平板翻转，在 37 °C 下继续孵育至少两天。</li>
	<li>通过计数各稀释度下的菌落数量来定量提取的细菌，并根据所提取血淋巴的重量进行归一化处理。</li>
</ol>
10. 竞争指数（CI）的测定
<ol>
	<li>在进行竞争指数实验前，确认两种菌株在肉汤培养基和 CYE 琼脂平板上生长状况一致。</li>
	<li>按照第 1 节所述方法制备野生型（WT）或卡那霉素抗性突变菌的菌液，并按 1:1 比例混合。
	<ol>
		<li>将接种物进行系列稀释后，分别涂布于含壮观霉素（100 μg/ml）的 CYE 琼脂平板和含壮观霉素/卡那霉素的 CYE 琼脂平板上</li>
	</ol>
	</li>
	<li>感染昆虫幼虫，并在合适的时间点按上述方法收集血淋巴。</li>
	<li>通过收集血淋巴并进行系列稀释后涂布于含壮观霉素的 CYE 平板和含壮观霉素/卡那霉素的 CYE 平板，测定活菌数量。</li>
	<li>按以下公式计算竞争指数（CI）：CI = （突变株输出量 / 野生型输出量）/（突变株接种量 / 野生型接种量）。</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

Galleria mellonella 幼虫模型是研究嗜肺军团菌（Legionella pneumophila）感染致病机制的一种有效的体内研究工具。本文表明，G. mellonella 模型能够重现巨噬细胞感染的多个特征，包括 Dot/Icm IVB 型分泌系统（T4BSS）在毒力、细菌复制以及效应蛋白 SidC 定位中的作用。此外，我们还证明，一种肌动蛋白聚合的化学抑制剂可显著降低幼虫死亡率，该结果与在巨噬细胞中观察到的现象一致47，并进一步支持了细菌内化是导致幼虫死亡所必需的观点。此前已有研究证实，其他感染模型中观察到的不同L. pneumophila 菌株间的毒力差异，也可在G. mellonella 模型中得到验证；且细菌毒力因子在指数后生长阶段的诱导表达是其发挥毒力所必需的36，这进一步确认G. mellonella 是研究L. pneumophila 感染的合适模型。
测定单独感染或混合感染后幼虫体内 L. pneumophila 的菌落形成单位（CFU），可显著提升该模型的应用价值。此前已发现多个因素在一种或多种感染模型中对细菌复制具有细微影响29,48-51。尽管幼虫不具备适应性免疫系统，但其固有免疫反应的存在相较于仅使用巨噬细胞的模型提供了更强的选择压力，可能有助于放大细微的表型差异。因此，虽然这些菌株可能不会显著影响幼虫的死亡率，但在 G. mellonella 模型中可能表现出细菌复制能力或适应性下降。除了 L. pneumophila 在幼虫体内的复制外，我们还观察到感染后期血细胞显著减少。由于 L. pneumophila 在复制周期结束时预计会裂解宿主细胞，因此血细胞减少程度也可作为细菌复制的间接衡量指标。此前已有研究将血细胞减少与昆虫感染后的死亡率相关联3,52，尽管近期结果表明这一关系比最初认为的更为复杂37。最近有研究显示，幼虫饥饿会通过抑制免疫反应而增加其对感染的易感性53。在本研究所描述的实验中，幼虫在整个实验期间未予喂食，目前尚不清楚充分喂食的幼虫对 L. pneumophila 感染的反应如何。
G. mellonella 作为模式生物的一个优势在于能够简便地从感染的幼虫中提取并定量血细胞。以往的视频已展示了从昆虫中提取血细胞的多种方法54,55，但本文所述方法更为简便，适用于立即进行后续处理。提取后的血细胞可轻松进行定量，用于免疫荧光、透射电子显微镜36或流式细胞术56分析，也可进行体外培养并实施离体感染ex vivo3，从而深入研究细胞对感染的响应。这显著提高了该模型的灵活性。在G. mellonella中应用免疫荧光技术的一个局限是，目前经验证可用于G. mellonella蛋白的抗体种类有限。然而，已有研究成功制备出针对幼虫蛋白的抗体57，并且发现针对人类免疫相关蛋白的抗体也能识别G. mellonella的蛋白11，表明在G. mellonella血细胞上开展免疫荧光分析具有可行性。
G. mellonella 感染模型操作简便，可用于快速进行中等通量的筛选，以比较不同军团菌（Legionella）物种和菌株的毒力，并可进一步分析已在其他模型中证实对毒力必需的毒力因子，如黏附分子58或Ⅱ型分泌系统59。此外，利用该模型有助于发现并深入表征新的毒力因子，包括分泌和易位的效应蛋白。最近研究表明，L. pneumophila 的磷脂酶 C 活性在 G. mellonella 中具有毒力作用60，且 Dot/Icm 效应蛋白 SdhA 是其毒力所必需的37。此外，我们近期研究还表明，在 G. mellonella 中观察到的表型与 A/J 小鼠品系中的表型之间存在相关性37。
这凸显了该工具在补充环境原生动物、单细胞宿主以及小鼠感染模型方面的价值。G. mellonella 模型在未来将变得更加重要，一旦幼虫的基因组序列公布，并且建立更多的遗传学工具。朝这一方向迈进的步骤包括最近发表的免疫相关转录组研究61，以及推动在鳞翅目（Lepidoptera spp）中实现基因沉默的技术联盟的成立62。
利用G. mellonella幼虫，我们可以获得多种简单且快速的细菌毒力检测指标，用于研究L. pneumophila的致病机制。L. pneumophila菌株和血清群的这些检测方法的建立以及更广泛的应用，将提高这一新工具的实用性，并有助于加深我们对L. pneumophila致病机制的理解。

感染的动物模型在确定细菌毒力因子方面已被证明具有不可估量的价值。然而，无脊椎动物模型作为传统哺乳动物感染模型的可行替代方案，正受到越来越多的关注。大蜡螟（Galleria mellonella）的幼虫正被越来越多地用于研究多种重要的人类病原体，包括革兰氏阳性1和革兰氏阴性细菌2,3以及多种致病性真菌4,5。与传统的哺乳动物模型相比，使用昆虫模型具有多项优势：作为一种无脊椎动物，G. mellonella 不受哺乳动物实验伦理限制的约束。此外，该幼虫易于培养，可通过注射方式感染而无需麻醉，可接受化学抑制剂的预处理6，并可在37 °C条件下持续孵育7。有趣的是，已有研究证实多种微生物在G. mellonella中的致病性与哺乳动物感染模型之间存在良好的相关性2,8。对G. mellonella免疫系统的深入理解也促进了对该模式生物的特征刻画。尽管昆虫不具备哺乳动物所具有的适应性免疫系统，但它们拥有复杂的细胞和体液防御机制，包括抗菌肽的产生9。血细胞是细胞免疫防御的主要介导者，也是G. mellonella血淋巴（或称血液）中最丰富的细胞类型10。这些细胞是专职的吞噬细胞，其功能类似于人类的巨噬细胞和中性粒细胞，可通过吞噬-溶酶体结构摄取并降解细菌10,11，并围绕入侵细菌形成结节，从而在物理上限制细菌的增殖12。
Legionella pneumophila 是一种呼吸道病原体，可在老年人或免疫功能低下等易感人群中引发严重肺炎（即军团菌病）13。Legionella 广泛存在于自然环境和人工水源中，在其中可感染多种淡水阿米巴原虫14,15。Legionella 通过利用一种名为 Dot/Icm（细胞器运输/胞内增殖缺陷）的 IV 型分泌系统（T4SS），将超过 275 种效应蛋白转运至宿主细胞内，从而在这些专职吞噬细胞中存活并增殖16-20。这些蛋白可干扰宿主细胞正常的吞噬通路，促使形成包含 Legionella 的液泡（LCV）。LCV 可避免与溶酶体融合，并转而招募由内质网（ER）来源的囊泡，最终形成一种类似粗面内质网的特殊区室21,22。L. pneumophila 被认为是一种偶然感染人类的机会性病原体；其在阿米巴原虫内增殖所依赖的相同机制，也使其能够在人肺泡巨噬细胞中复制23。
已将哺乳动物宿主作为人类Legionella感染的模型进行研究，包括小鼠和豚鼠24,25。然而，大多数小鼠品系对Legionella感染具有抗性26，仅近交系白化A/J小鼠例外，其可发生轻度且自限性的感染24。尽管豚鼠模型更接近人类疾病表现25，但由于缺乏基因突变体且成本较高，限制了其应用27。此外，已开发出多种无脊椎动物模型用于研究Legionella pneumophila感染，包括Caenorhabditis elegans28、Drosophila melanogaster29以及多种阿米巴原虫30-32。然而，这些模型均存在局限性：C. elegans系统中的毒力不依赖于Dot/Icm系统28，从而限制了该模型的应用价值。Drosophila模型在研究细菌毒力因子方面已被证明有效29，且前景良好，但该模型尚未被充分表征。单细胞阿米巴原虫是L. pneumophila的自然环境宿主，适用于在分子水平上研究毒力因子的作用机制33，但缺乏哺乳动物宿主细胞应对感染所必需的若干重要介质，例如caspase34。现有模型的局限性，加之哺乳动物实验的高昂成本及伦理问题，促使研究人员寻找其他合适的模式生物29,35。
我们最近证明了G. mellonella是研究L. pneumophila致病机制的合适模型36,37。本方案详细描述了感染G. mellonella幼虫的实验技术，分析幼虫死亡率，提取血细胞进行计数和免疫荧光检测，以及通过测定感染幼虫中的活菌落形成单位（CFU）来确定细菌复制情况。

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;材料/设备&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>ACES酵母提取物（AYE）肉汤</td><td></td><td></td><td>4 g ACES，4 g 酵母提取物，0.4 g &amp;#945;-酮戊二酸，pH 6.9，400 ml H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O，高压灭菌，4 ml 铁溶液*，4 ml 半胱氨酸溶液*&lt;br/&gt; *在高压灭菌后加入无菌成分</td></tr><tr><td>活性炭缓冲酵母提取物（CYE）平板</td><td></td><td></td><td>同上，添加0.6 g 活性炭和6 g 琼脂</td></tr><tr><td>无菌铁溶液（焦磷酸铁）</td><td>Sigma</td><td>P6526</td><td>0.6 mM 溶液，经无菌过滤</td></tr><tr><td>无菌半胱氨酸溶液</td><td>Sigma</td><td>C7880</td><td>3.3 mM 溶液，经无菌过滤</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;G. mellonella &lt;/em&gt;（蜡虫）</td><td>Livefood UK</td><td>W250</td><td></td></tr><tr><td>抗HA-四甲基罗丹明异硫氰酸酯（TRITC）</td><td>Sigma</td><td>H9037</td><td></td></tr><tr><td>抗&lt;em&gt;Legionella&lt;/em&gt; LPS</td><td>Cambridge Biosciences</td><td>PA1-7227</td><td></td></tr><tr><td>抗兔IgG Alexa488</td><td>Jackson Immunoreach</td><td>711-485-152</td><td></td></tr><tr><td>异丙基&amp;#946;-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷（IPTG）</td><td>Sigma</td><td>I6758</td><td></td></tr><tr><td>杜尔贝科氏磷酸盐缓冲液（D-PBS）</td><td>Sigma</td><td>D8662</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Agar Scientific</td><td>R1026</td><td></td></tr><tr><td>氯化铵（NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;Cl）</td><td>Sigma</td><td>A9434</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝溶液</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>皂苷</td><td>Sigma</td><td>D141</td><td></td></tr><tr><td>细胞松弛素D</td><td>Biomol International</td><td>BML-T109-0001</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;材料&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>微量注射器</td><td>Sigma</td><td>24544</td><td></td></tr><tr><td>细胞计数板，双线，改进型Neubauer型</td><td>VWR</td><td>631-0926</td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td></td><td></td><td>用于离心培养板</td></tr><tr><td>荧光显微镜</td><td></td><td></td><td>任何配备所需荧光染料滤光片的显微镜</td></tr><tr><td>倒置显微镜</td><td></td><td></td><td>用于活细胞计数</td></tr><tr><td>防穿刺手套</td><td>Turtleskin</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

使用galleria mellonella作为模式生物研究legionella pneumophila感染

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

Legionella pneumophila 是一种重要的人类病原体，可引起一种名为军团菌病的严重肺炎，该病原体能够感染并复制于肺泡巨噬细胞内。其毒力依赖于 Dot/Icm IV 型分泌系统（T4SS），该系统对于形成允许细菌复制的空泡（即含Legionella的空泡，LCV）至关重要。L. pneumophila 感染可在小鼠中建模，但大多数小鼠品系不支持感染，因此需要寻找新的感染模型。我们近期研究表明，蜡螟Galleria mellonella的幼虫适用于研究L. pneumophila感染。G. mellonella 越来越多地被用作人类病原体的感染模型，多种细菌在该昆虫模型与哺乳动物模型中的毒力表现具有良好相关性。幼虫免疫防御的关键组分是血细胞，即专职吞噬细胞，可摄取并清除入侵病原体。L. pneumophila 能够感染这些细胞，并在其中形成 LCV 并进行复制。本文展示了在G. mellonella 模型中分析L. pneumophila 毒力的实验方案，包括如何培养具有感染性的L. pneumophila、使用抑制剂预处理幼虫、感染幼虫，以及如何提取被感染细胞用于定量分析和免疫荧光显微镜观察。我们还描述了在竞争实验中定量细菌复制能力与适应性（fitness）的方法。这些方法可用于快速筛选突变株，以确定影响L. pneumophila 毒力的重要因子，为深入理解这一复杂病原体提供了一种新工具。

本文证明，G. mellonella 是一种合适且易于使用的模型，可用于研究 L. pneumophila 感染。先前研究表明，L. pneumophila 在巨噬细胞、阿米巴以及哺乳动物模型中的毒力依赖于 Dot/Icm 分泌系统的存在41-43。按照上述方法感染 G. mellonella 幼虫，并比较野生型（WT）菌株与缺乏 Dot/Icm 系统的突变株的毒力。接种 107 CFU 的 L. pneumophila 130b 菌株后，感染后 24 小时内（p.i.）幼虫死亡率达到 100%。然而，缺乏功能性 Dot/Icm IV 型分泌系统（T4SS）的 L. pneumophila ΔdotA 突变株在此实验中无毒力（图 1）。该结果表明，L. pneumophila 在 G. mellonella 中的毒力依赖于 Dot/Icm 效应蛋白的转运，因此该模型适用于对这些蛋白功能的表征研究。
最近研究表明，使用细胞松弛素处理抑制吞噬作用会增加幼虫对白色念珠菌（Candida albicans）感染的易感性6。由于L. pneumophila是一种胞内病原菌，因此有必要确定该细菌的摄取是否在其对该模型的致病过程中起关键作用。实验中，幼虫在37 °C条件下预先用10 μl浓度为100 μM的细胞松弛素D（CyD）处理4小时，随后接种107 CFU的野生型L. pneumophila 130b，并在感染后24小时监测死亡率。单独使用抑制剂处理对幼虫存活率无显著影响。然而，与经DMSO处理的感染昆虫相比，预先用CyD处理后再感染的幼虫存活率显著更高（P = 0.0066，非配对t检验）（图2）。但在感染后48小时，CyD处理的效应已消失（结果未显示），这可能与该药物在G. mellonella体内的半衰期有关。上述结果表明，L. pneumophila被G. mellonella血细胞摄取是其细菌毒力的关键环节。
为了验证效应蛋白的表达并确定其在G. mellonella中的亚细胞定位，提取了血细胞并进行免疫荧光显微镜分析。用表达明确的IV型分泌系统（T4SS）效应蛋白SidC41-918片段（融合4个N端HA标签）的野生型和ΔdotA L. pneumophila 130b菌株感染幼虫。该效应蛋白已被证实可通过磷脂酰肌醇-4-磷酸结合结构域与LCV结合44。使用抗HA抗体（红色）和抗Legionella抗体（绿色）染色后，在感染的血细胞中观察到4HA-SidC41-918定位于LCV（图3）。此前已在阿米巴Dictyostelium discoideum及哺乳动物巨噬细胞中观察到该定位现象44,45，证实了该模型的可比性。
蛋白质对毒力的重要性通常通过比较野生型和突变型细菌的生长动力学来确定。为了追踪感染过程中细菌的复制动力学，每个时间点（0、5、18 和 24 小时 p.i.）分别处死三只幼虫，收集并合并血淋巴，测定每 0.1 克提取血淋巴中的菌落形成单位（CFU）。在感染后 5 小时出现初始下降后，野生型（WT）细菌的 CFU 持续增加至感染后 24 小时；然而，ΔdotA 菌株未发生复制，并在感染后 18 小时被清除（图 4）。
其能力 L. pneumophila 以依赖T4SS的方式导致巨噬细胞裂解的现象已有长期文献记载46，然而尚未开展类似的实验研究 体内在感染后5、18和24小时测定循环血细胞的浓度。幼虫被野生型（WT）或Δ感染。dotA 嗜肺军团菌 130b，从感染的昆虫中提取血细胞，并使用台盼蓝排斥法计数活细胞。在感染后5小时，不同菌株间的血细胞数量无显著差异（图5）。然而，在感染后18小时，野生型（WT）的血细胞浓度显著下降，而Δ型则未出现此现象dotA，感染的幼虫。该差异在感染后24小时仍持续存在。血细胞数量的下降，结合免疫荧光观察到的胞内细菌的存在，提示 L. pneumophila 在血细胞内复制后裂解宿主细胞，使细菌能够进行多轮复制。
<img alt="生存分析图；生存率百分比 vs. 注射后小时数；WT、ΔDotA、PBS 对生存率的影响。" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/50964/50964fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 1"> 
图1. 感染 L. pneumophila 可诱导依赖 Dot/Icm 系统的幼虫死亡。 10 条幼虫分别感染 PBS 缓冲液、野生型（WT）或 ΔdotA L. pneumophila 130b 菌株（107 CFU），于 37 °C 培养 72 小时，并记录幼虫死亡时间。所有感染野生型菌株的幼虫在感染后 24 小时内全部死亡，而仅注射 PBS 或感染 ΔdotA 菌株的幼虫均未出现死亡。结果为三次独立实验的平均值，误差线表示标准差。
<img alt="存活率柱状图；处理方式：PBS、DMSO WT、100μM CyD WT；统计数据分析。" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/50964/50964fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 2"> 
图2. 死亡率依赖于细菌的内化作用。 10只L. pneumophila幼虫在37 °C下预先用10 μl浓度为100 μM的细胞松弛素D（CyD）处理4小时，随后感染107 WT，并在感染后24小时监测死亡率。经预处理的幼虫死亡率显著降低（P = 0.0066，非配对t检验）。结果代表四次独立实验的平均值±标准差，每种条件下使用10只幼虫。
<img alt="使用DAPI染色的军团菌感染共聚焦显微镜图像，显示野生型和ΔdotA突变体结果。" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50964/50964fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图3"> 
图3. 提取的血细胞中效应蛋白的免疫荧光成像。 从感染表达4HA-SidC41-918的L. pneumophila 130b野生型或ΔdotA菌株5小时后的幼虫中提取血细胞。细胞使用抗HA抗体（红色）、抗Legionella抗体（绿色）以及DAPI DNA染料（蓝色）进行染色以显示细胞核。4HA-SidC41-918仅在野生型细菌周围被观察到，而在ΔdotA突变体周围未见。比例尺为5 μm。
<img alt="L. pneumophila CFU growth chart, WT vs ΔdotA strains, hours post injection, bacterial analysis." fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/50964/50964fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 4"> 
图4. L. pneumophila 重复组内 G. mellonella 以 Dot/Icm 依赖的方式。 幼虫被野生型或Δ感染dotA 嗜肺军团菌 在感染后0、5、18和24小时，收集三只感染昆虫的血淋巴混合样本，接种于CYE平板，测定CFU并根据接种量及提取的血淋巴重量进行归一化处理。WT L. pneumophila 在实验过程中重复进行，而ΔdotA 感染后18小时内菌株被清除。结果为三次独立实验的平均值±标准差。
<img alt="军团菌生长比较；柱状图；随时间变化的可存活细胞数；野生型与ΔdotA菌株；实验结果。" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/50964/50964fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 5"> 
图5. 野生型 L. pneumophila 感染导致血细胞显著破坏。 在感染野生型或ΔdotA L. pneumophila 的幼虫中，分别于感染后5、18和24小时提取血细胞，并使用血细胞计数板计数可存活细胞数。在感染后5小时，两种菌株间的细胞数量无显著差异；但在感染后18小时，野生型菌株感染组幼虫中仅约15%的血细胞存活，而ΔdotA 菌株感染组则无此显著减少。结果为三次独立实验的平均值，误差线表示标准差。

最近，蜡螟 Galleria mellonella 的幼虫已被确立为研究 Legionella pneumophila 感染的 in vivo 模型。本文中，我们展示了利用该幼虫模型表征 Legionella 致病性的基本技术，包括接种、细菌毒力与复制能力的测定，以及感染血细胞的提取与分析。

使用Galleria mellonella作为模式生物研究Legionella pneumophila感染

嗜肺军团菌（Legionella pneumophila）是引起一种严重肺炎——军团菌病的病原体，是一种重要的人类病原菌，可感染并……

本实验的总体目标是利用蜡螟幼虫（Galleria mellonella）来分析细菌病原体嗜肺军团菌（Legionella pneumophila）的致病机制。实验开始时，通过注射方式将嗜肺军团菌（L. pneumophila）菌株接种至幼虫体内，并在随后的72小时内进行观察。幼虫死亡率的诱导表现为活动能力丧失以及出现黑色素化幼虫，分别在不同时间点处死幼虫以收集其血淋巴。随后将血淋巴接种培养，用于细菌计数并观察昆虫细胞。最终，通过分析细菌增殖情况并结合免疫荧光显微镜检测，可深入了解军团菌在体内感染过程中建立的胞内生态位，以及不同菌株间毒力的差异。与军团菌小鼠模型和细胞培养模型相比，该技术的主要优势在于其伦理接受度更高，并且能够在多细胞生物体中快速、经济地分析大量军团菌菌株，从而清晰地展示实验流程。本实验由我实验室的博士生哈丁（Harding）操作。根据当地规定，操作嗜肺军团菌（L. pneumophila）时必须在微生物安全柜中的生物安全二级防护条件下进行。首先将细菌平板培养四天，然后在感染幼虫前一天，取含有数个菌落的一环细菌，悬浮于1毫升预温的A YE培养基中，并在600纳米波长下测定菌液的吸光度。接着，将新鲜的3 mL YE培养基以OD600为0.1的浓度接种。在37°C、200 rpm条件下振荡培养21小时，直至进入后指数生长期，用于后续感染实验。测定菌悬液在600 nm处的吸光度。然后将培养物稀释至每毫升含十亿个CFU。在DPBS中，用钝头镊子将一张直径10厘米的圆形滤纸置于10厘米培养皿底部，为G型黑色素瘤幼虫准备容器。将10只大小相近、健康的幼虫放置于滤纸上，剔除呈棕色或外观斑驳的不健康昆虫。健康的幼虫体色均匀，呈乳白色，无任何深色变色区域，并能迅速自行翻转。若需将其翻转，可通过将滤纸固定在安全柜上来制备注射平台，然后将一个P 1000吸头用胶带固定在滤纸上。现在，用20微升微量滴定注射器吸取70%乙醇，并将注射器在70%乙醇中孵育至少10分钟，以进行灭菌。通过反复吸取和排出无菌水数次，去除注射器中残留的乙醇。然后吸取10微升浓度为每毫升10亿CFU的嗜肺军团菌悬液。取一只幼虫，轻轻但稳固地将其翻转，使其背部弯曲在 P 1000 吸头尖端上。将注射器针尖置于幼虫右前足的前端上方，然后轻轻将针尖插入前足。确保针头已进入幼虫体内，且插入过程平稳顺畅。注入全部10微升团注液。如果注射器插入正确，应能够仅用注射器吸起幼虫并将其转移至腔室中。每种条件注射10条幼虫，并另用10条幼虫仅注射DPBS作为对照。注射过程是该操作中技术难度最高的环节，需要反复练习。最后，用胶带将培养皿封好，并放入次级容器中。在实验期间，将其置于37摄氏度环境中保存。应在感染后的多个时间点分析死亡率。为观察感染幼虫的死亡情况，使用平头镊子将幼虫翻转，观察其腿部是否活动。健康的幼虫应能迅速自行扭动复位。色素沉着表明对感染产生了强烈的免疫反应。只要观察到任何活动，即在不同时间点将幼虫计为存活。随机选取三条幼虫，放入一个14毫升的试管中。将试管置于冰上5到10分钟，直至观察不到幼虫腿部运动为止。然后将幼虫转移至培养皿中。使用解剖刀在尾部附近两个体节之间做切口，以采集每只幼虫的血淋巴。切口应远离肠道，以防止肠道细菌污染。将幼虫的血淋巴挤入无菌的1.5毫升离心管中。每只幼虫可获得15至50微升血淋巴。现在必须在10分钟内使用血淋巴，否则其将凝固，从而影响昆虫活力的测定。将20微升血淋巴与20微升台盼蓝溶液混合，加入96孔板的一个孔中，以同样方式加样三个孔。室温孵育反应5分钟。然后，对于每个反应，取 10 µL 用血细胞计数板计数活的非蓝色细胞。用于显微镜观察血细胞的处理。将血淋巴样品用移液器滴加到 24 孔板中的 10 至 15 毫米玻璃盖玻片上。然后加入 0.5 毫升 DPBS，轻轻混匀，充分混悬血淋巴。使用防气溶胶的离心板架，将培养板在室温下以 500 ×g 离心 10 分钟。随后使用倒置显微镜观察每个孔，确认血细胞已贴壁。随后，移除上清液，并通过向孔壁加入 0.5 毫升 DPBS 轻柔地洗涤细胞三次。轻轻晃动培养板数次，然后吸除 DPBS。固定和染色的详细步骤见文本方案。为了定量细菌的菌落形成单位（CFUs），用无菌的 YE 培养基对血淋巴进行连续十倍梯度稀释。接着，将含有 SPECT 霉素的 CYE 平板底部均分为六个相等的区域。从最稀释的稀释液开始，在平板的每个区域分别接种三滴，每滴 25 微升（µL）。将这些培养皿进行孵育，随后计数菌落。G. melan 幼虫被野生型和 ICM 缺陷型 L. pneumophila 菌株感染。以 1 × 10⁷ CFU 的 1-30B 菌株感染后，24 小时内导致 100% 的死亡率。然而，缺乏功能性 ICM T 四型分泌系统的 delta A 菌株在致病过程中是否依赖细菌的摄取仍需确定。在此模型中，幼虫先经细胞松弛素 D 预处理，随后进行感染；单独使用该抑制剂处理在 24 小时内对存活率无影响，但经预处理后再感染的幼虫相较于对照组表现出显著更高的存活率。为验证效应蛋白的表达并确定其在表达已知液泡定位于 LCV 的效应蛋白片段的 g Melan 军团菌中的亚细胞定位。使用带有四个串联及末端 HA 标签的 SID C 感染幼虫，并通过显微镜分析以追踪细菌复制动力学。在感染后的多个时间点处死幼虫，测定每克提取血淋巴中的菌落形成单位（CFU）。在感染 5 小时后出现初始下降，野生型细菌的 CFU 随后增加；然而，Δa 菌株未发生复制，并在 18 小时内被清除。从感染昆虫中提取血细胞，并采用台盼蓝排斥法计数活细胞。在感染后 5 小时，未观察到差异。Incyte统计了不同菌株间的数量差异。然而，在18小时时，野生型感染的幼虫体内血细胞浓度显著下降，而ΔA突变株感染的幼虫则未出现此现象。该体内实验结果表明，嗜肺军团菌在血细胞内复制并随后将其裂解。观看本视频后，您应该能够充分掌握如何感染幼虫、提取血淋巴以及处理血细胞，以分析军团菌致病性的各个方面。

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