亚毫秒构象变化蛋白的光热光束偏转已解决
2014年2月18日
在这里，我们报告的光热光束偏转技术在同一个笼中钙化合物，DM-nitrophen，监控微秒和毫秒动态及与钙的关联关联到一个神经元的钙传感器，下游调控元件拮抗剂调制器结构变化热力学相结合的应用。
以下实验的总体目标是在亚毫秒时间尺度上表征与配体与钙换能物结合相关的确认变化。APO 蛋白与钙结合蛋白之间的确认转变是由笼状钙化合物钙 DM 硝基的光裂解触发的，导致游离钙的光释放。反射率的相关变化是使用四重位置敏感探测器测量为探针光束的位移。
接下来，将光热光束偏转轨迹作为样品和参考温度的函数进行测量。对光电束偏转轨迹的化合物分析提供了对钙诱导反应体积和焓变确认开关机制的见解。相对于现有桅杆（例如顶部流），光热光束偏转的主要优点是，这种技术允许在亚毫秒时间尺度上同时检测体积和熵的变化。
该技术的视觉演示是必要的，因为仪器的精确对准对于热力学参数的恢复至关重要。演示该程序的是我实验室的研究生 Walter Gonzalez，他在暗室中进行样品制备和所有样品作，以防止任何不必要的解笼。在本视频中，演示了在光线下拍摄的步骤。
要开始在 50 毫摩尔堆中溶解 DM 硝基，请缓冲 100 毫摩尔氯化钾，pH 7.0 至终浓度为 400 微摩尔。从 0.1 摩尔储备溶液中加入氯化钙，以达到理想的钙与 DN 硝基浓度比。接下来，将参比化合物氰化钾或铬酸钠溶解在同一缓冲液中。
至于样品，请参阅文本协议以获取光热光束偏转的基本实验配置示意图。设置实验时，将探测光束传播穿过放置在温控池支架中的池中心。然后使用针孔，将探针光束的直径调整到 1 毫米，在样品后面使用第二个镜子将探测光束对准位置敏感探测器的中心。
将 pro 光束聚焦在探测器的中心，使顶部两个二极管和底部两个二极管之间的电压差以及探测器左侧和右侧两个二极管之间的电压差为零。随后塑造泵浦光束的直径，即 ND YAG 激光器的 355 纳米输出。使用放置在 2 355 纳米激光镜之间的 3 毫米针孔，将泵浦光束共传播到叶片中心。
重要的是，两束激光都以近共线的方式通过光学单元的中心传播。为了获得可测量的偏转角，从而获得光热光束偏转或 PBD 信号的高振幅，请使用参考化合物对准探头和泵浦光束，以获得令人满意的 PBD 信号，其特点是良好的信噪比和较长时间尺度上的稳定 PBD 振幅。然后通过增量调整 355 纳米激光镜，将泵浦光束相对于探针光束定位。
测量 PBD 参考信号的幅度，作为位置敏感探测器上两个顶部和底部光电二极管之间的差值。PBD 信号应在快速时间尺度上表现出振幅的快速增加，并在 100 毫秒的时间尺度上保持稳定。通过测量 PBD 信号对激发激光功率和吸收的爱因斯坦数量的线性依赖性，检查 PBD 信号振幅相对于释放热能的线性度。
将激光功率保持在大约 1000 微焦耳以下，以防止多光子吸收。此外，将样品或参比化合物的吸光度保持在小于 0.5 的激发波长，以防止泵浦束功率降低。这些步骤将确保 PBD 信号的线性度。
从 PBD 迹线的测量开始。对于参比，将参比化合物的溶液放入石英池中，并将参比池置于温控支架中。在 16 至 35 摄氏度的温度范围内检测参考 PBD 信号与温度的函数关系，温度增量为 3 摄氏度。
每次温度变化时。检查位置敏感探测器上探测光束的位置，并将位置重新调整到探测器的中心。如有必要，按照文本协议中的说明检查 PBD 信号的线性度。
然后将样品溶液放入与参比化合物相同的光学池中，保持与用于参比化合物的光学池方向相同，以便进行参比测量。继续在与参比相同的温度范围内检测样品 PBD 迹线，并检查样品 PBD 振幅的线性度。将参考 PBD 信号的幅度作为前触发和后触发 PBD 信号之间的差值。
以类似的方式，确定样本 PBD 信号的快速和慢速相位的幅度。要消除仪器响应参数，请将样品 PBD 信号的振幅缩放 PBD 信号的振幅。对于参考，样品信号与参考信号的比率给出了一个方程，从中，释放到溶液中的热量和与光引发反应相关的非热体积变化可以通过振幅比乘以能量与温度相关项的图的斜率和截距来确定，以确定快速和慢速过程规模的反应体积和焓变， 观察到的体积和焓变为适当的量子产率。
根据文本协议中的方程，通过将数据拟合到描述体积和焓变的时间相关函数来分析各个步骤的振幅和寿命。快速步长的振幅对应于样本 PBD 信号的提示阶段的振幅，后续步骤的振幅对应于样本 PBD 信号的慢速阶段的振幅。对于每个单独的过程，根据单个过程的速率常数的温度依赖性，活化焓和熵参数可以使用 IR 图轻松确定。
此处显示了钙 DM 硝基释放钙光的 PBD 迹线的代表性示例。快相对应于钙 DM 硝基的光裂解和钙的释放，而慢相反映了钙与非光笼的结合。钙与神经元钙传感器下游调节元件拮抗剂、调节因子或梦的 C 末端结构域结合的 PBD 轨迹在钙光解离时显示在此处。
照片释放的配体与 Dream 的 C 末端结构域相关，时间常数为 1.3 正负 0.3 毫秒，在 20 摄氏度时与观察到的速率常数的温度依赖性相结合。钙与 dream 的 C 末端结构域结合的激活屏障被确定为每摩尔 9.2 正负 0.4 公斤卡路里。尝试此过程时，请务必记住在与参考相同的条件下测量样品 PBD 迹线。
观看本视频后，您应该对如何制备样品、对齐仪器和分析数据以获得可重现的热力学参数有很好的了解。
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概述
本研究利用光热光束偏转技术以及笼状钙化合物DM-nitrophen，来研究神经钙传感器结构变化的动力学。重点关注钙结合事件的微秒和毫秒时间尺度。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 生物物理学
- 结构生物学
背景
- 钙转导器在神经元信号传导中扮演关键角色。
- 理解构象变化对于阐明钙信号传导机制至关重要。
- 光热光束偏转提供了研究这些快速动力学的新方法。
- DM-nitrophen是一种笼状钙化合物，允许控制钙的释放。
研究目的
- 表征与钙转导器的配体结合相关的构象变化。
- 测量这些变化在亚毫秒时间尺度上的动力学。
- 分析钙结合过程中的反应体积和焓变化。
使用的方法
- 应用光热光束偏转技术。
- 使用DM-nitrophen进行自由钙的光释放。
- 测量反射率指数变化作为探测光束的位移。
- 分析光热光束偏转轨迹随温度变化的函数关系。
主要结果
- 成功测量APO和钙结合蛋白之间的构象转变。
- 对钙诱导的构象转换机制的见解。
- 同时检测体积和熵变化的演示。
- 光热光束偏转相比传统方法的优势得到强调。
结论
- 该研究提供了对钙信号传导动力学的更深入理解。
- 光热光束偏转是研究快速分子变化的有价值工具。
- 未来研究可以在这些发现的基础上探索其他钙相关过程。
常见问题
Executive Industry Relevance
Photothermal beam deflection enables direct, label-free quantification of submillisecond conformational changes in proteins, providing unique insight into rapid ligand-induced structural transitions. This capability addresses a critical gap in early discovery and mechanistic de-risking, especially for targets lacking intrinsic chromophores or fluorophores. The method enhances predictive confidence in target validation and supports risk-adjusted portfolio decisions by delivering quantitative thermodynamic parameters inaccessible to traditional techniques.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct measurement of ligand-induced conformational changes on microsecond to millisecond timescales.
- Quantifies reaction volume and enthalpy changes, supporting mechanistic de-risking of target engagement.
- Facilitates functional validation of protein targets without the need for extrinsic labels.
- Improves predictive confidence for advancing targets through the discovery pipeline.
Screening & Assay Development
- Provides validated, quantitative readouts of protein conformational dynamics for assay development.
- Supports reproducibility and standardization by enabling simultaneous detection of volume and enthalpy changes.
- Prepares robust biological systems for downstream screening workflows, even for non-fluorescent targets.
- Enables reliable evaluation of compound-induced structural effects in early screening.
Translational & Preclinical Research
- Aligns biophysical measurements with disease-relevant protein function for translational continuity.
- Supports risk-adjusted advancement by quantifying activation barriers and kinetic parameters relevant to preclinical models.
- Provides mechanistic data to inform biomarker strategies when supported by target biology.
Pipeline & Workflow Integration
Photothermal beam deflection integrates into the discovery continuum from early target validation through assay development and preclinical mechanistic studies, particularly where rapid conformational dynamics are critical decision points.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by quantifying fast structural transitions and thermodynamic parameters.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for assay readiness and compound triage.
- Analytics: Provides high-resolution measurements of reaction kinetics, volume, and enthalpy changes for comparative analysis.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical validation by aligning kinetic and thermodynamic data with functional outcomes.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable, label-free platform for diverse protein targets and ligand classes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability across protein systems.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions and capital efficiency by providing early, quantitative biophysical data.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of targets with robust mechanistic evidence.
Implementation Considerations
- Requires expertise in photothermal instrumentation alignment and data analysis.
- Demands precise temperature control and optical setup for reproducible measurements.
- Necessitates cross-team standardization of sample preparation and reference calibration.
- Adaptable to proteins lacking chromophores or fluorophores, broadening applicability.
- Instrument sensitivity and alignment are critical for accurate thermodynamic parameter recovery.
