Name: 亚毫秒构象变化蛋白的光热光束偏转已解决 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 2 s
Description: 了解光热光束偏转技术用于研究神经元钙传感器蛋白的亚毫秒级构象变化。该方法结合DM-nitrophen光释放钙离子，可同时检测反应体积与焓变，为钙信号传导机制提供热力学参数。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本工作由美国国家科学基金会（MCB 1021831，JM）和J. &amp; E. 生物医学研究计划（佛罗里达州卫生部，JM）资助。

1. 样品制备
<ol>
	<li>在暗室中进行样品制备及所有样品操作，以防止发生非预期的光解反应。</li>
	<li>将DM-硝酚（(1-(2-硝基-4,5-二甲氧基苯基)-N,N,N',N'-四(羰基氧基甲基)-1,2-乙二胺)）溶于50 mM HEPES缓冲液、100 mM KCl、pH 7.0中，终浓度为400 µM（ε350nm = 4330 M-1cm-1 9）。</li>
	<li>从0.1 M储备液中加入CaCl2，以达到所需的[Ca2+]:[DM-硝酚]比例。对于Ca2+结合的Kd大于10 µM的蛋白质，建议采用1:1的[Ca2+]:[DM-硝酚]比例，以防止光解释放的Ca2+与去笼状态的DM-硝酚结合。实际上，考虑到DM-硝酚的Kd值为10 nM，且DM-硝酚与Ca2+的总浓度为400 µM时，约有90%的钙结合蛋白（Kd = 10 μM）将处于无钙状态。另一方面，在研究Ca2+与Kd < 10 µM的蛋白质结合时，建议将[Ca2+]:[DM-硝酚]比例降低至0.95，以防止在笼状物光解离之前Ca2+与无钙蛋白形成复合物。</li>
	<li>将参比化合物K3[Fe(III)(CN)6]或Na2CrO4溶于与样品相同的缓冲液中。</li>
</ol>
2. 实验设置
<ol>
	<li>基本实验装置如图所示 图2.</li>
	<li>使用针孔（P2）调节探针光束（He-Ne 激光器的 632 nm 输出，激光功率约 5 mW）的直径至 1 mm，并使用 M 将探针光束引导通过置于温控细胞池中的细胞中心1 镜子</li>
	<li>使用一面镜子（M2在样品后方调整位置，使探针光束对准位置敏感探测器的中心。</li>
	<li>将探测光束聚焦在探测器中心，使得探测器上侧两个二极管与下侧两个二极管之间的电压差，以及左侧两个二极管与右侧两个二极管之间的电压差均为零。</li>
	<li>随后，使用一个3 mm的针孔（P）对Q开关Nd:YAG激光器输出的355 nm泵浦光束（FWHM 5 nsec）进行整形以确定其直径1) 置于两片355 nm激光反射镜之间。</li>
	<li>将泵浦光束沿比色皿中心共传播，如图所示 图2两束激光必须几乎共线地穿过光学池的中心，以获得可测量的偏转角，从而产生高幅度的PBD信号，这一点非常重要。在实验条件下，探测光束与泵浦光束的交汇角度小于 15°.</li>
	<li>使用参考化合物对探针光束和泵浦光束进行准直，以获得满意的PBD信号。 即 良好的信噪比以及在较长时间尺度（约100毫秒）下稳定的PBD振幅。</li>
	<li>通过逐步调节355 nm激光的反射镜，微调泵浦光束相对于探测光束的位置。</li>
	<li>测量位置敏感探测器上两个顶部和底部光电二极管之间的PBD参考信号幅度。PBD信号应在快速时间尺度上表现出幅度的迅速增加&lt;10 µsec）并在100毫秒时间尺度上保持稳定，如所示 图3PDB信号幅度的逐发波动在信号幅度的5%以内，信号重复性主要受振动影响。</li>
	<li>通过测量PBD信号对激发激光功率以及对所吸收的爱因斯坦数E的线性依赖关系，检验PBD信号幅度与释放的热能之间的线性关系a = (1-10- A其中A对应于激发波长处的参考吸光度。</li>
	<li>将激光功率保持在约以下 1,000 µJ 且样品/参比化合物在激发波长处的吸光度应小于0.5，以分别防止多光子吸收和泵浦光束功率下降，并确保PBD信号的线性。</li>
</ol>
3. PBD 测量
<ol>
	<li>首先测量参考样品的PBD信号。将参考化合物溶液置于1.0 cm × 1.0 cm或1.0 cm × 0.5 cm的石英比色皿中，并将比色皿放入温控样品架内。两种光程长度所获得的PBD信号幅度相当。</li>
	<li>在16–35 °C的温度范围内，以3 °C为温度增量，检测参考样品的PBD信号随温度的变化。</li>
	<li>每次改变温度后，检查探测光束在位置敏感探测器上的位置，并在必要时将其重新调整至探测器中心。</li>
	<li>根据公式2，检查PBD信号相对于[(dn/dt)/Cpρ]项的线性关系。</li>
	<li>将待测样品溶液装入与参考化合物相同的光学比色皿中，并保持比色皿方向与参考测量时一致。</li>
	<li>在与参考样品相同的温度范围内检测样品的PBD信号，并验证样品PBD信号幅度相对于[(dn/dt)/Cpρ]项的线性关系。</li>
</ol>
4. 数据分析
偏转幅度与样品加热引起的体积变化（ΔVth）以及非热体积变化（ΔVnonth）成正比，关系如公式1所示： <img src="/files/ftp_upload/50969/50969eq1.jpg" alt="说明化学体系中体积变化分析的公式，ΔV，显示体积组分ΔVth和ΔVnonth。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="公式1"> 
样品（AS）和参比（Ar）的光束偏转检测（PBD）信号幅度可分别用公式2和公式3描述。 <img src="/files/ftp_upload/50969/50969eq2.jpg" alt="静态平衡；公式：AS=KEa[(dn/dt)(1/ρCp)Q+ρ(dn/dp)ΔVnonth+Δnabs]。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="公式2"> 
 <img src="/files/ftp_upload/50969/50969eq3.jpg" alt="热扩散率公式；表达式：Aᵗ = KEₐEₙ[(dn/dt)(1/ρCₚ)]；用于传热研究。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="公式3"> 

PBD 信号与仪器响应参数（K）和吸收的爱因斯坦数（Ea）成正比。公式 2 中的第一项（dn/dt）(1/ρCp)Q 对应于由于释放到溶剂中的热量引起的信号变化。其中 dn/dt 项表示折射率随温度的变化，ρ 为溶剂的密度，Cp 为比热容。这些参数在纯水中是已知的，而对于缓冲溶液，可通过比较参考化合物在纯水和适当缓冲液中的 PBD 信号来确定。Q 是返回到溶剂中的热量。ρ (dn/dρ) 项是一个无量纲常数，在 10–40 °C 温度范围内与温度无关10。Δnabs 项对应于由于溶液中存在吸光物质所引起的折射率变化；若探测光束的波长相对于溶液中任何物质的吸收光谱发生偏移，则该值可忽略不计。由参考化合物产生的信号（Ar）由公式 3 表示，其中 Ehν 为激发波长下的光子能量，当激发波长为 355 nm 时，Ehν = 80.5 kcal/mol。
<ol>
	<li>将参考PBD信号的幅度取为触发前与触发后PBD信号之间的差值，如图3所示。以类似方式，确定样品PBD信号的快速相（Asfast）和慢速相（Asslow）的幅度。</li>
	<li>为消除仪器响应参数K，将样品PBD信号的幅度除以参考PBD信号的幅度进行归一化。样品信号与参考信号的比值即为公式4，可表示为：
	 <img src="/files/ftp_upload/50969/50969eq4.jpg" alt="热力学公式4，实验背景下压力与体积变化分析。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="公式4"> </li>
	<li>利用该公式，通过绘制[(As/Ar) Ehν]项与温度依赖项[(dn/dt)(1/ρCp)]的关系图，分别从其斜率和截距确定光引发反应释放到溶液中的热量（Q）以及非热体积变化（ΔVnonth）。</li>
	<li>为确定快速过程和慢速过程的反应体积和焓变，根据公式5-7将观测到的体积变化和焓变按相应的量子产率进行归一化。
		 <img src="/files/ftp_upload/50969/50969eq5.jpg" alt="热力学公式 ΔH=Eₙ-Q/Φ，用于焓计算和热传递分析。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="公式5"> 
		 <img src="/files/ftp_upload/50969/50969eq6.jpg" alt="热传递公式 ΔH_slow=-Q/Φ；用于能量吸收分析的热力学公式。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="公式6"> 
		 <img src="/files/ftp_upload/50969/50969eq7.jpg" alt="静态平衡公式 ΔV=ΔVnonthr/Φ，用于教育研究中的方程上下文。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="公式7"> 
		 对于动力学过程发生在10 µsec~200 msec时间尺度上的多步反应，可分别确定反应各步骤相关的体积变化和焓变。通过将数据拟合至描述体积和焓变时间分布的函数F(t)，分析各步骤的幅度和寿命。 
			<img alt="瞬态吸收，公式 F(t)=α₀+Σαᵢ[1-exp(-t/τᵢ)]，科学研究中的方程。" src="/files/ftp_upload/50969/50969eq8.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="公式8"> 
		其中α0对应Asfast，每个独立过程的αi对应Asslow，τi为各反应步骤的寿命。根据各过程速率常数（ki = 1/τi）的温度依赖性，可通过Eyring图简便地确定活化焓和活化熵参数。</li>
</ol>

<ol><li>Gensch, T., Viappiani, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-resolved+photothermal+methods%3A+accessing+time-resolved+thermodynamics+of+photoinduced+processes+in+chemistry+and+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem.+Photobiol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Time-resolved photothermal methods: accessing time-resolved thermodynamics of photoinduced processes in chemistry and biology.</a> Photochem. Photobiol. Sci. 2, 699-721 (2003).</li>
<li>Larsen, R. W., Mikšovská, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+resolved+thermodynamics+of+ligand+binding+to+heme+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Coord.+Chem.+Rev%22%5BJournal%5D)">Time resolved thermodynamics of ligand binding to heme proteins.</a> Coord. Chem. Rev. 251 (9-10), 1101-1127 (2007).</li>
<li>Westrick, J. A., Peters, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+photoacoustic+calorimetric+study+of+horse+myoglobin%5BTitle%5D)+AND+%22Bioph.+Chem%22%5BJournal%5D)">A photoacoustic calorimetric study of horse myoglobin.</a> Bioph. Chem. 37 (1-3), 73-79 (1990).</li>
<li>Belogortseva, N., Rubio, M., Terrell, W., Miksovska, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+contribution+of+heme+propionate+groups+to+the+conformational+dynamics+associated+with+CO+photodissociation+from+horse+heart+myoglobin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Inorg.+Biochem%22%5BJournal%5D)">The contribution of heme propionate groups to the conformational dynamics associated with CO photodissociation from horse heart myoglobin.</a> J. Inorg. Biochem. 101 (7), 977-986 (2007).</li>
<li>Mikšovská, J., Suquet, C., Satterlee, J. D., Larsen, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Conformational+Changes+Coupled+to+Ligand+Photodissociation+from+the+Heme+Binding+Domain+of+FixL%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Characterization of Conformational Changes Coupled to Ligand Photodissociation from the Heme Binding Domain of FixL.</a> Biochemistry. 44 (30), 10028-10036 (2005).</li>
<li>Miksovska, J., Gennis, R. B., Larsen, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photothermal+studies+of+CO+photodissociation+from+mixed+valence+Escherichia+coli+cytochrome+bo3%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Photothermal studies of CO photodissociation from mixed valence Escherichia coli cytochrome bo3.</a> FEBS Lett. 579 (14), 3014-3018 (2005).</li>
<li>Losi, A., Michler, I., Gärtner, W., Braslavsky, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-resolved+Thermodynamic+Changes+Photoinduced+in+5%2C12-trans-locked+Bacteriorhodopsin.+Evidence+that+Retinal+Isomerization+is+Required+for+Protein+Activation%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem.+Photobiol%22%5BJournal%5D)">Time-resolved Thermodynamic Changes Photoinduced in 5,12-trans-locked Bacteriorhodopsin. Evidence that Retinal Isomerization is Required for Protein Activation.</a> Photochem. Photobiol. 72, 590-597 (2000).</li>
<li>Kondoh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-Induced+Conformational+Changes+in+Full-Length+Arabidopsis+thaliana+Cryptochrome%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Light-Induced Conformational Changes in Full-Length Arabidopsis thaliana Cryptochrome.</a> J. Mol. Biol. 413 (1), 128-137 (2011).</li>
<li>Kaplan, J. H., Ellis-Davies, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photolabile+chelators+for+the+rapid+photorelease+of+divalent+cations%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Photolabile chelators for the rapid photorelease of divalent cations.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85 (17), 6571-6575 (1988).</li>
<li>Eisenberg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Equation+for+the+Refractive+Index+of+Water%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chem.+Phys%22%5BJournal%5D)">Equation for the Refractive Index of Water.</a> J. Chem. Phys. 43 (11), 3887-3892 (1965).</li>
<li>Ellis-Davies, G. C., Kaplan, J. H., Barsotti, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+photolysis+of+caged+calcium%3A+rates+of+calcium+release+by+nitrophenyl-EGTA+and+DM-nitrophen%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Laser photolysis of caged calcium: rates of calcium release by nitrophenyl-EGTA and DM-nitrophen.</a> Biophys. J. 70, 1006-1016 (1996).</li>
<li>Miksovska, J., Larsen, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-function+relationships+in+metalloproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Structure-function relationships in metalloproteins.</a> Methods Enzymol. 360, 302-329 (2003).</li>
<li>Miksovska, J., Norstrom, J., Larsen, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermodynamic+profiles+for+CO+photodissociation+from+heme+model+compounds%3A+effect+of+proximal+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Inorg.+Chem%22%5BJournal%5D)">Thermodynamic profiles for CO photodissociation from heme model compounds: effect of proximal ligands.</a> Inorg. Chem. 44 (4), 1006-1014 (2005).</li>
<li>Dhulipala, G., Rubio, M., Michael, K., Miksovska, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermodynamic+profile+for+urea+photo-release+from+a+N-%282-nitrobenzyl%29+caged+urea+compound%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem.+Photobiol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Thermodynamic profile for urea photo-release from a N-(2-nitrobenzyl) caged urea compound.</a> Photochem. Photobiol. Sci. 8, 1157-1163 (2009).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

光热方法背后的物理原理是：被光激发的分子通过振动弛豫将多余能量耗散至基态，导致周围溶剂产生热加热效应1,12。对于水等溶剂，这会产生快速的体积膨胀（ΔVth）。处于激发态的分子还可能发生光化学过程，由于键的断裂/形成和/或分子结构的变化，导致非热体积变化（ΔVnonth），这些变化可改变分子的分子尺寸（i.e.&#160;范德华体积的变化），以及改变分子的电荷分布，从而引起电致收缩效应。这导致被照射区域迅速膨胀，产生折射率变化，可通过多种光学方法进行探测。光束偏转检测（PBD）利用了如下事实：由于高斯形状的激光脉冲在样品中建立了折射率梯度，当探测光束穿过样品时会发生偏转，如图2所示。
光热束偏转技术能够测定多种光引发过程的时间分辨体积变化和焓变，包括配体-血红素复合物的光解反应机理13、笼状化合物复合物中生物活性分子的释放14，以及荧光团三重态寿命的探测。与常用于监测生物大分子结构变化的传统技术（如瞬态吸收光谱和荧光光谱）...

光热方法（如光声量热法、光热束偏转（PDB）以及与纳秒激光激发耦合的瞬态光栅）为研究短寿命中间体的时间分辨实验提供了强有力的替代瞬态光学光谱学的手段1,2。与瞬态吸收和红外光谱等监测发色团周围吸收变化时间过程的光学技术不同，光热技术检测的是热/体积变化的时间依赖性，因此是研究光学上“静默”过程时间特征的有力工具。迄今为止，光声量热法和瞬态光栅已成功应用于研究光诱导过程的构象动力学，包括球蛋白中双原子配体的迁移3,4、配体与氧感应蛋白FixL的相互作用5、血红素-铜氧化酶6以及光系统II中的电子和质子传递，以及视紫红质中的光异构化7和隐花色素中的构象动力学8。
为了将光热技术的应用扩展到缺乏内源性生色团和/或荧光团的生物体系，PBD 技术被结合使用笼锁化合物，以在几微秒或更快的时间内（取决于所用的笼锁化合物）通过光触发实现配体/底物浓度的升高。该方法使得能够监测配体/底物与缺乏内源性荧光团或生色团的蛋白质结合时所伴随的结构变化的动力学和热力学过程，其时间尺度是商用停流仪器无法达到的。本文展示了利用 PBD 技术监测笼锁化合物 Ca2+DM-nitrophen 光解反应的热力学，以及 Ca2+ 与神经元钙感应蛋白下游调节元件拮抗剂调节蛋白（DREAM）C端结构域结合的动力学。Ca2+ 在 10 μsec 内从 Ca2+DM-nitrophen 中通过光照释放，并以约 300 μsec 的时间常数重新结合到未光解的笼锁分子上。另一方面，在存在 apoDREAM 的情况下，观察到一个额外的、发生在毫秒时间尺度上的动力学过程，反映了配体与蛋白质的结合。由于仪器上的困难，PBD 技术在探测生物体系构象转变方面的应用曾受到一定限制；例如，探针光束与泵浦光束难以对准，导致难以获得强而可重复的 PBD 信号。然而，通过精心设计仪器装置、精确控制温度，以及仔细对准探针光束和泵浦光束，可以获得稳定且可靠的 PBD 信号，从而在 10 µsec 至约 200 msec 的宽时间尺度上监测时间分辨的体积变化和焓变。此外，对实验流程进行改进，以确保在相同的温度、缓冲液组成、光学池取向和激光功率等条件下检测样品和参比信号，&#160;等等，可显著降低测得的反应体积和焓值的实验误差。

<table><tbody><tr><td>1-(4,5-二甲氧基-2-硝基苯基)-1,2-二氨基乙烷-&lt;em&gt;N,N,N&amp;#039;,N&amp;#039;&lt;/em&gt;-四乙酸</td><td>Life Technologies</td><td>D-6814</td><td>DM-硝基苯，钙笼合物，储备液需避光保存以防止光解</td></tr><tr><td>4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸，&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;-(2-羟乙基)哌嗪-&lt;em&gt;N&amp;prime;&lt;/em&gt;-(2-乙磺酸)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>0909C</td><td>HEPES缓冲液</td></tr><tr><td>铁氰化钾(III)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>702587</td><td>PBD测量用参比化合物</td></tr><tr><td>铬酸钠</td><td>Sigma Aldrich</td><td>307831</td><td>PBD测量用参比化合物</td></tr><tr><td>氦氖激光二极管，5 mW，635 nm</td><td>Edmund Optics</td><td>54-179</td><td>用作PBD测量的探测光束</td></tr><tr><td>示波器&amp;nbsp;</td><td>LeCroy</td><td>Wave Surfer 42Xs</td><td>400 MHz带宽</td></tr><tr><td>Nd:YAG激光器</td><td>Continuum</td><td>ML II</td><td>PBD测量的泵浦光束</td></tr><tr><td>M&lt;sub&gt;355&lt;/sub&gt;；Nd:YAG激光反射镜</td><td>Edmund Optics</td><td>47-324</td><td>355 nm激光线用反射镜</td></tr><tr><td>M&lt;sub&gt;1&lt;/sub&gt; 和 M&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;；激光二极管反射镜</td><td>Edmund Optics</td><td>43-532</td><td>可见光平面反射镜，波长范围300–700 nm</td></tr><tr><td>P&lt;sub&gt;1&lt;/sub&gt; 和 P&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;；虹膜光阑</td><td>Edmund Optics</td><td>62-649</td><td>针孔，用于整形探测光束和泵浦光束</td></tr><tr><td>L&lt;sub&gt;1&lt;/sub&gt;；双凸透镜</td><td>Thorlabs</td><td>LB1844</td><td>用于将探测光束聚焦至探测器的透镜，有效焦距50 mm，波长范围350–2,000 nm</td></tr><tr><td>DM，二向色镜</td><td>Thorlabs</td><td>DMLP505</td><td>长通二向色镜，截止波长505 nm</td></tr><tr><td>F&lt;sub&gt;1&lt;/sub&gt;；边缘滤光片</td><td>Andower</td><td>500FH90-25</td><td>长通滤光片，截止波长500 nm</td></tr><tr><td>温控比色皿支架</td><td>Quantum Northwest</td><td>FLASH 300</td><td>&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

亚毫秒级蛋白质构象变化的光热束偏转法解析

Submillisecond Conformational Changes in Proteins Resolved by Photothermal Beam Deflection

光热束偏转、光声量热法和热光栅均属于光热方法，可监测蛋白质在光诱导构象变化过程中微秒至毫秒时间尺度下的体积和焓变的时间过程，这一时间范围是传统停流仪器无法达到的。此外，由于这些技术探测的是总体积和/或焓的改变，因此可应用于缺乏荧光团或发色团标记的蛋白质及其他生物大分子。用于监测与Ca²⁺相关的结构变化的动力学和热力学过程2+ 结合钙信号转导分子，例如神经元钙感受器，采用笼锁型钙化合物DM-nitrophen来光触发快速（τ &#60; 使用光热束偏转技术探测游离钙离子浓度的增加（20 μsec）以及相关的体积和焓变。

Ca2+DM-硝酚光解释放Ca2+的典型PBD轨迹示例如图3所示。快速相对应于Ca2+DM-硝酚的光裂解及Ca2+的释放，而慢速相则反映了Ca2+与未光解笼合物的结合。根据公式4，将样品PBD信号在快速相和慢速相的振幅相对于参考化合物振幅进行归一化，并结合温度依赖因子[Cpρ/(dn/dt)]，同时依据公式5-7将观测到的溶液中释放热量和非热体积变化归一化至DM-硝酚光解离的量子产率（Φ = 0.18）11，由此获得快速相的反应焓变和体积变化值（ΔVfast = -12±5 ml/mol 和 ΔHfast = -50±20 kcal/mol）以及慢速相的相应值（ΔVslow = 9±5 ml/mol 和 ΔHslow = -23±12 kcal/mol）。Ca2+与神经元钙感受...

本文报道了光热束偏转技术与笼锁型钙化合物DM-nitrophen相结合的应用，用于监测钙离子与神经元钙感受器——下游调控元件拮抗调节因子（Downstream Regulatory Element Antagonist Modulator）结合过程中伴随的微秒和毫秒级结构变化的动力学及热力学特性。

光热束偏转、光声量热法和热光栅均属于光热方法家族，用于监测……

以下实验的总体目标是在亚毫秒时间尺度上表征配体结合至钙信号转导蛋白时所伴随的构象变化。通过光解笼锁型钙化合物钙 DM 硝苯（calcium DM nitro）引发从无钙结合的 APO 蛋白到钙结合蛋白的构象转变，从而实现游离钙离子的光释放。相关的折射率变化通过四象限位置敏感探测器测量探针光束的偏移来检测。接下来，测量样品和参比物质在不同温度下的光热光束偏转轨迹。对光束偏转轨迹的综合分析，可从反应体积和焓变的角度揭示钙离子诱导构象转换的机制。与现有的主流技术（如停流法）相比，光热光束偏转技术的主要优势在于，能够在亚毫秒时间尺度上同时检测体积变化和熵变。该技术的可视化演示十分必要，因为仪器的精确校准对于热力学参数的准确获取至关重要。本实验操作由本实验室的研究生 Walter Gonzalez 演示。所有样品制备及操作步骤均需在避光环境中进行，以防止发生非预期的光解反应。本视频中为拍摄需要，在光照条件下演示各步骤。首先，将DM Nitro溶于50毫摩尔HEPES缓冲液（含100毫摩尔氯化钾，pH 7.0）中，使其终浓度为400微摩尔。从0.1摩尔的氯化钙储备液中加入氯化钙，以达到所需的钙离子与DN nitro的浓度比例。接着，将参比化合物氰化钾或铬酸钠用相同的缓冲液溶解。关于样品，请参考文字版实验方案中光热束偏转基本实验装置的示意图。在搭建实验装置时，使探测光束穿过置于温控样品池架中的样品池中心。然后使用小孔光阑调节探测光束的直径至1毫米，并利用样品后方的第二面反射镜，将探测光束对准位置敏感探测器的中心。将探针光束聚焦在探测器中心，使得探测器上下两个二极管之间的电压差，以及左右两侧两个二极管之间的电压差均为零。随后调整泵浦光束的直径，该光束为 ND YAG 激光器输出的 355 纳米光。在两个 355 纳米激光反射镜之间放置一个 3 毫米的小孔，使泵浦光束与 vete 中心共传播。确保两束激光几乎共线地通过光学池的中心位置至关重要。为了获得可测量的偏转角，从而得到光热束偏转（PBD）信号的高幅值，应使用参比化合物对探测光束和泵浦光束进行准直，以获得具有良好的信噪比和在较长时间尺度上稳定的PBD信号。随后，通过逐步调节355纳米激光器的反射镜，微调泵浦光束相对于探测光束的位置。在位置敏感探测器的上下两个光电二极管之间，测量PBD参考信号的幅度，该幅度为二者之间的差值。PBD信号应在快速时间尺度上表现出幅度的迅速增加，并在100毫秒时间尺度上保持稳定。通过测量PBD信号幅度随激发激光功率以及吸收的爱因斯坦光子数的线性依赖关系，检验PBD信号幅度相对于释放热能的线性特性。将激光功率保持在约1000微焦以下，以防止多光子吸收。同时，将样品或参比化合物在激发波长处的吸光度保持在0.5以下，以防止泵浦光束功率下降。这些步骤将确保PBD信号的线性。首先测量PBD轨迹。作为参照，将参照化合物的溶液放入石英比色皿中，并将比色皿置于温度可控的样品架内。在16至35摄氏度的温度范围内，以3摄氏度为温度增量，检测参照PBD信号随温度的变化。每次温度变化后，检查探针光束在位置敏感探测器上的位置，并重新调整至探测器中心。如有必要，按照文本方案中所述检查 PBD 信号的线性度。然后将样品溶液放入与参比化合物所用相同的光学池中，并保持光学池在参比测量时的相同取向。在与参比相同的温度范围内检测样品的PBD信号轨迹，并检查样品PBD信号幅度的线性。以触发前与触发后PBD信号之间的差值作为参比PBD信号的幅度。以类似方式，确定样品PBD信号快相和慢相的振幅。为消除仪器响应参数的影响，将样品PBD信号的振幅按参考PBD信号的振幅进行归一化处理。对于参考样品，样品信号与参考信号的比值可导出一个方程，通过该方程可由振幅比值乘以能量对温度依赖项作图的斜率和截距，确定光引发反应所释放到溶液中的热量以及非热体积变化，从而获得快过程和慢过程的反应体积变化和焓变。将观测到的体积变化和焓变按相应的量子产率进行归一化处理。根据文本方案中给出的方程，通过将数据拟合到描述体积和焓变的时间依赖函数，来分析各个步骤的振幅和寿命。快速步骤的振幅对应于样品PBD信号初始相的振幅，随后步骤的振幅则对应于样品PBD信号慢相的振幅。对于各个独立过程，可根据其速率常数随温度的变化关系，利用IR图轻松确定各过程的活化焓和活化熵参数。此处展示了一个典型的PBD轨迹示例，用于说明钙离子从钙DM硝基化合物中光解释放的过程。快速相代表钙DM硝基化合物的光裂解及钙离子的释放，而慢速相则反映钙离子结合到未受光照的笼状化合物上。此处还展示了钙离子光解离后，钙离子与神经元钙传感器下游调节元件拮抗剂、调节因子或DREAM的C端结构域结合的PBD轨迹。光释放的配体在20摄氏度下与DREAM的C端结构域结合，其时间常数为1.3 ± 0.3毫秒，该值基于观测到的速率常数的温度依赖性得出。钙离子结合到DREAM的C端结构域的活化能垒确定为9.2 ± 0.4千卡每摩尔。在进行该实验操作时，重要的是要记住，在与对照完全相同的条件下测量样品的PBD轨迹。观看本视频后，您应能充分理解如何制备样品、校准仪器以及分析数据，以获得可重复的热力学参数。

submillisecond-conformational-changes-proteins-resolved-photothermal

Research

科研

JoVE Journal

Chemistry

化学

亚毫秒构象变化蛋白的光热光束偏转已解决

蛋白质功能的关键步骤，特别是主链构象变化和质子转移反应，通常发生在微秒到毫秒的时间尺度上。这些动力学过程可以通过时间分辨步进扫描傅里叶变换红外光谱技术进行研究，尤其适用于其功能由光触发的蛋白质。...

利用时间分辨步进扫描傅里叶变换红外光谱研究光敏蛋白中的质子转移与蛋白质构象动力学

我们提出了一种利用高分辨率库仑爆炸成像装置创建分子转动波包实时电影的实验方案。...

直接成像激光驱动的超快分子转动

本文介绍了时间分辨红外振动光谱和电子衍射的差分检测分析方法，这些方法能够观测柱状液晶中光激发分子周围局部结构的形变，从而从原子尺度揭示该光敏材料的结构与动力学之间的关系。...

观察光响应性液晶结构动力学的新技术

时间分辨序列飞秒晶体学实验的成功依赖于高效的样品递送。本文介绍了优化从高黏度微挤出注射器中挤出紫膜蛋白微晶的实验方案。该方法依赖于使用一种新型三通耦合器对样品进行均质化处理，并通过高速相机实现可视化观察。...

提高高粘度微晶挤出效率以用于X射线激光器上的时间分辨串行飞秒晶体学研究

我们介绍一种在微流控装置中固定单个大分子并量化其在剪切流中构象变化的实验方案。该方案可用于表征蛋白质和DNA等生物分子在流动环境中的生物力学特性与功能特性。...

利用荧光显微镜表征剪切流中单分子构象变化

本文介绍了在Diamond光源I24线站进行序列同步辐射晶体学实验的固定靶样品制备、数据收集和数据处理的综合指南。...

在钻石光源进行固定靶连续数据采集

时间分辨单分子蛋白质诱导荧光增强是一种有用的荧光光谱邻近传感器，可灵敏检测蛋白质局部结构变化。本文展示了该方法可用于揭示α-突触核蛋白中稳定的局部构象，而使用长程FRET标尺测量时，该蛋白通常被认为呈球状无序且不稳定。...

利用时间分辨的蛋白质诱导荧光增强技术逐个识别单个α-突触核蛋白单体的稳定局部构象

中子背散射谱学提供了一种无损且无需标记的方法，用于研究蛋白质及其水合水在皮秒至纳秒时间尺度上的动力学行为。本文通过两项关于淀粉样蛋白的研究展示了该方法的工作流程：一是溶菌酶在聚集过程中时间分辨的动力学研究，二是tau蛋白在形成纤维时其水合水动力学的研究。...

高分辨率中子谱学研究蛋白质及水合水的皮秒至纳秒动力学

本文展示了利用光热非共振轻敲（PORT）技术观察生物分子相互作用的成像方案，其中我们优化了成像参数，确定了系统局限性，并探究了在三叉星DNA结构组装成像中的潜在改进方法。...

高速原子力显微镜成像技术用于DNA三点星形结构自组装的光热非共振轻敲模式研究

本文介绍了在共聚焦显微镜模式下，利用单分子时间分辨荧光各向异性研究生物大分子局部柔韧性和动力学特性的实验方案。...

单分子时间分辨荧光各向异性用于表征生物大分子局部柔性

等离激元纳米镊子利用金纳米结构中的局域表面等离激元共振，在纳米尺度的光场中捕获单个纳米颗粒，包括蛋白质。散射信号的变化可揭示蛋白质的存在及其构象动态，从而实现无需荧光标记或表面固定的实时监测。...

利用等离激元纳米镊子监测单个未修饰蛋白质的构象动力学

了解光热光束偏转技术用于研究神经元钙传感器蛋白的亚毫秒级构象变化。该方法结合DM-nitrophen光释放钙离子，可同时检测反应体积与焓变，为钙信号传导机制提供热力学参数。

亚毫秒级蛋白质构象变化的光热束偏转法解析

探索更多视频