自主的生物发光哺乳动物细胞连续和实时监测细胞毒性
October 28th, 2013
哺乳动物细胞表达生物发光细菌基因盒（勒克斯），自主产生光。化学品接触后产生的生物发光动力学已被证明，以反映细胞生长和代谢的治疗效果，使这些细胞的一种廉价的，连续的，实时的毒性筛选的工具，可以很容易地适应高通量自动化。
该程序的总体目标是自主使用发光人类细胞进行连续和实时的细胞毒性监测。这是通过首先获得足够数量的活跃生长的自动生物发光细胞来实现的。在第二步中，将相同数量的细胞接种到多孔板的各个孔中。
接下来，用一系列浓度的目标化合物处理细胞。在最后一步中，使用兼容的仪器测量生物发光信号。最终，生物发光输出动力学可用于证明测试化合物对细胞代谢活性的影响。
与现有方法（例如使用从昆虫或海底物种中分离的荧光素酶的方法）相比，该技术的主要优点是不需要样品破坏或添加底物即可产生可检测信号。演示该程序的是实验室的本科生 James Webb 在适当的培养基中将感兴趣的生物发光细胞培养至 80% 汇合后，在 PBS 中用轻轻旋转的胰蛋白酶眼睛洗涤细胞培养物，细胞在 37 摄氏度下，直到细胞从培养瓶中分离。然后将重悬的细胞收集在 PBS 中，转移到干净的离心管中，测定细胞数量，计数后，在室温下以 300 Gs 离心细胞悬液 5 分钟，然后复苏。
将沉淀悬浮在新鲜的预热培养基中，然后将等量的细胞接种到不透明多孔板板的各个孔中，将等体积的培养基单独接种在一组一式三份的孔中作为阴性对照。然后将三个未处理的细胞孔作为目标实验化合物的对照，直接留给适当实验浓度的细胞，一式三份。实验处理后，立即将板放入适当仪器的成像室中，以进行图像采集和生物发光测量。
然后为每个读数设置适当的积分时间，并在 24 小时内每 15 分钟测量一次生物发光。最后，使用适当的兼容软件确定每个孔中的感兴趣区域。为了量化每个实验样品的生物发光强度，以每秒光子数显示光输出以说明总通量，或以每个Ceridian每平方厘米每秒光子数显示，以展示每个样品的平均辐射度。
在这项研究中，响应抗生素暴露，在 24 小时内连续监测自动生物发光 HEC 2 9 3 细胞的动力学。这种抗生素是 Blio Mycin 家族的一员，已知通过结合两个活细胞并裂解 DNA 来杀死活细胞，与未处理的细胞相比，生物发光产生的减少证明了这种毒性作用，这可以通过伪彩色图像直接可视化。如此处所示，HEC 2 9 3 细胞的生物发光性质允许在不同的处理条件下对样品进行重复平行筛选，从而可以在任何给定时间点比较不同的实验处理浓度，以便于进行剂量反应分析。
例如，在此图中，将细胞在处理 15、18 或 20 小时后产生的生物发光与添加的实验化合物的浓度作图，这表明增加抗生素处理导致细胞以剂量依赖性方式减少生物发光产生。本视频中介绍的技术适用于跟踪急性毒性作用，但可以通过增加时间间隔重复对细胞进行成像，同时在两次读数之间将培养物保持在标准孵育条件下，从而适应评估慢效或长期毒性。
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概述
这项研究展示了利用生物发光的人类细胞进行细胞毒性的连续和实时监测。通过测量生物发光信号，研究人员可以评估细胞对各种化合物的代谢活动反应。
关键研究组成部分
科学领域
- 细胞生物学
- 生物发光
- 毒性筛选
背景
- 哺乳动物细胞可以表达细菌生物发光基因。
- 这些细胞自主产生光，反映了它们的代谢状态。
- 实时监测相较于传统方法提供优势。
- 高通量自动化在这种方法下是可行的。
研究目的
- 开发一种实时细胞毒性监测的方法。
- 利用生物发光输出作为细胞健康的指标。
- 促进化合物的高通量筛选。
使用的方法
- 获取活跃生长的生物发光的人类细胞。
- 将相等数量的细胞接种到多孔板中。
- 用不同浓度的化合物处理细胞。
- 使用兼容的仪器测量生物发光信号。
主要结果
- 生物发光动力学与处理效果相关。
- 细胞生长和代谢可以实时监测。
- 这种方法具有成本效益并适合自动化。
- 结果展示了高通量应用的潜力。
结论
- 生物发光的人类细胞对毒性筛选有效。
- 该方法提供了细胞反应的连续监测。
- 它为毒理学研究人员提供了一个有前景的工具。
常见问题
Executive Industry Relevance
Autonomously bioluminescent mammalian cells enable continuous, non-destructive monitoring of cytotoxicity, addressing the high cost and time burden of traditional destructive assays. This approach supports real-time metabolic readouts that improve predictive confidence in early target validation and lead identification by linking compound exposure to cellular health dynamics. The method’s compatibility with existing imaging infrastructure and automation potential enhances scalability for enterprise R&D workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through real-time correlation of bioluminescent output with cellular metabolism and growth.
- Operational Value: Supports functional target validation by providing a biosentinel readout that reflects adverse effects on cell viability without sample destruction.
- Predictive Value: Facilitates dose-response analysis and mechanistic de-risking by allowing repeated measurements across concentrations and time points.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for downstream screening by establishing stable, autonomous light-producing cell lines.
- Reproducibility: Ensures consistent quantitative outputs through normalized seeding and controlled environmental conditions.
- Scalability: Enables parallel sample processing across multiwell plates using standard imaging equipment, supporting high-throughput compound evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Maintains disease-relevant monitoring from discovery through preclinical stages by tracking metabolic adaptation to toxicant exposure.
- Risk-Adjusted Decisions: Supports advancement criteria by linking bioluminescent dynamics to cellular health thresholds observed in dose-response curves.
- Biomarker Alignment: Uses light emission as a functional biomarker of metabolic state, enabling correlation with phenotypic outcomes in preclinical models.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from early biology to lead identification, where real-time cytotoxicity monitoring informs compound prioritization before preclinical investment.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by linking bioluminescent signal changes to compound-induced metabolic disruption.
- Screening: Delivers assay readiness through reproducible signal measurement over time, enabling reliable comparison of treatment conditions.
- Analytics: Provides quantitative flux and radiance readouts that allow teams to assess cytotoxicity kinetics and potency.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by maintaining viable cells for longitudinal monitoring, reflecting in vivo-like metabolic responses.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable biosensor platform adaptable to multiple targets and compound classes across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity through continuous, label-free metabolic tracking.
- Operational Value: Enhances standardization and reproducibility by eliminating reagent addition and sample destruction steps.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling reuse of samples and reducing consumable costs in cytotoxicity screening.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted prioritization by delivering early metabolic liability data that supports go/no-go decisions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mammalian cell culture and stable transfection to maintain lux-expressing lines.
- Depends on access to low-light imaging equipment capable of photon-counting bioluminescence detection.
- Necessitates standardization of seeding density, incubation conditions, and measurement intervals across teams.
- Involves adaptation considerations when extending to primary or non-human cell lines with varying transfection efficiency.
- Limited by the metabolic dependence of the signal, which may not capture non-metabolic cytotoxic mechanisms.
