Name: 内质网子域的培养细胞中的可视化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-18T13:45:00.000+00:00
Duration: 16 min 43 s
Description: 学习利用活细胞共聚焦成像和荧光漂白恢复技术研究培养细胞中内质网子域的分布与蛋白质动态。该方法结合透射电子显微镜可深入解析细胞超微结构变化。

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作者感谢Fondazione Filarete在本文发表过程中提供的帮助与支持。我们还要感谢Centro Europeo di Nanomedicina提供TECNAI G2透射电子显微镜的使用。

1. 质粒、细胞培养及内质网荧光蛋白转染
<ol>
	<li>本研究中使用的质粒包含一种增强型绿色荧光蛋白（GFP），其C末端通过一段连接序列与大鼠细胞色素b(5)内质网亚型（本文简称为b(5)）的尾部区域融合。该尾部区域含有在胰蛋白酶切割天然b(5)后仍与膜结合的完整序列（Pro94-Asp134），其中包括17个氨基酸残基的跨膜结构域（TMD），其上下游分别由极性序列（UPS和DPS）包围。连接序列由myc表位和[(Gly)4Ser]3组成，整个cDNA插入哺乳动物表达载体pCDNA3的Hind3-Xba1位点。该质粒构建的详细信息已在先前发表的研究中描述，其中将其命名为GFP-ER16。</li>
	<li>在37 °C、10% CO2的培养箱中，使用添加10%胎牛血清、2 mM L-谷氨酰胺和1%青霉素/链霉素的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）培养COS-7细胞。</li>
	<li>转染。将3 × 105个细胞接种于6孔板中的圆形玻璃盖玻片上，次日按照制造商说明使用JetPEI系统进行转染。请注意，已针对不同质粒和细胞系优化了JetPEI/DNA的最佳比例以实现最高转染效率：在本实验条件下，JetPEI:DNA比例为2:1时，转染效率可达70–80%。</li>
</ol>
2. 活细胞荧光扫描共聚焦显微镜
<ol>
	<li>活细胞成像。将转染细胞接种的盖玻片放入专用于24 mm盖玻片的钢制培养腔室中，腔室内加入不含酚红的DMEM培养基，补充10% FBS、2 mM L-谷氨酰胺、1%青霉素/链霉素、25 mM HEPES、50 μg/ml环己酰亚胺以及1:100稀释的OxyFluor以防止样品发生光漂白。使用配备温控CO2培养箱（37 °C，5% CO2）的SP5共聚焦显微镜进行活细胞成像实验，通过488 nm激光激发并结合525/50带通发射滤光片对dGFP-ER进行可视化观察。</li>
	<li>光漂白后荧光恢复（FRAP）。选定一个与OSER结构相对应的兴趣区域（ROI），使用20次迭代进行漂白，同时结合488 nm（30 mW氩离子激光器的100%，相当于样品处5.5–6 μW）和405 nm（30 mW二极管405激光器的60%，相当于样品处11.6 μW）激光器，根据我们的经验，该组合可实现高效且快速的光漂白。</li>
	<li>通过每10秒采集一帧图像，持续记录10分钟内漂白ROI中荧光信号的恢复情况（像素时间为1.61 μsec/px）。</li>
	<li>光漂白过程中的荧光丢失（FLIP）。选定一个与OSER结构相对应的兴趣区域（ROI），并按上述方法进行漂白。每30秒重复一次漂白过程，漂白后图像每10秒采集一次，持续30分钟（像素时间为1.61 μsec/px）。</li>
	<li>FRAP与FLIP数据分析。所有图像均使用ImageJ软件（<a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html" target="_blank">http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html</a>）进行分析。在FRAP实验中，随时间测量漂白ROI的荧光恢复强度，并将其归一化至整个漂白细胞的总荧光强度，后者需始终确认在时间过程中保持恒定。</li>
	<li>对于FLIP实验，绘制一个位于漂白OSER之外但覆盖整个细胞的兴趣区域（ROI）。测量该区域随时间变化的荧光强度，并将其归一化至在未漂白细胞上绘制的ROI的荧光水平，以校正成像过程本身可能引起的任何荧光衰减。</li>
	<li>在所有实验中，从ROI的荧光强度中扣除在细胞外区域测定的背景信号。最后，使用GraphPad Prism软件绘制结果图。</li>
</ol>
3. 透射电子显微镜下的超微结构分析
鉴于许多试剂具有毒性，所有操作均应在通风橱内进行，并穿戴适当的实验服和手套。
<ol>
	<li>从培养皿中取出盖玻片后，用过滤的2%戊二醛溶于0.1 M卡考基酸盐缓冲液（pH 7.4）中，在室温下固定培养皿底部生长的剩余细胞单层，固定时间为10分钟。</li>
	<li>使用聚四氟乙烯刮刀刮取细胞，并将其转移至1.5 ml离心管中。在9,000 g离心10分钟使细胞成团，弃去上清液，加入新鲜固定液，并于4 °C下放置过夜。</li>
	<li>用缓冲液洗涤细胞团块，然后在室温下用1%四氧化锇溶于卡考基酸盐缓冲液中后固定1小时。</li>
	<li>用MilliQ水冲洗，再用1%醋酸铀溶于蒸馏水中进行块染（en bloc染色），时间为20–60分钟。</li>
	<li>将样品依次用浓度递增的乙醇系列（70%、80%、90%、100%、100%，每步10分钟）进行脱水，并用丙烯酸氧化物短暂清洗两次（每次15分钟）。</li>
	<li>用丙烯酸氧化物与Epon的混合液（1:1）对样品进行渗透处理，时间为2小时至过夜。</li>
	<li>将样品包埋于Epon环氧树脂中，并在60 °C下固化至少24小时。</li>
	<li>使用配备45°金刚石刀的LEICA UC6超薄切片机对人工修整后的树脂块进行切片，获得厚度为60–70 nm的切片，并将切片收集于300目铜网上。</li>
	<li>在铜网上用醋酸铀饱和溶液染色20分钟，再用柠檬酸铅染色7分钟，随后将铜网浸入双蒸过滤水中彻底清洗，并在室温下自然干燥。</li>
	<li>使用TECNAI G2透射电子显微镜观察染色后的铜网样品，并通过底部安装的CCD相机在不同最终放大倍数下（通常为6,000–39,000X）采集图像。</li>
</ol>

<ol><li>Fasana, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+VAPB+mutant+linked+to+amyotrophic+lateral+sclerosis+generates+a+novel+form+of+organized+smooth+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">A VAPB mutant linked to amyotrophic lateral sclerosis generates a novel form of organized smooth endoplasmic reticulum.</a> FASEB J. 24, 1419-1430 (2010).</li>
<li>Borgese, N., Francolini, M., Snapp, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endoplasmic+reticulum+architecture%3A+structures+in+flux%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Endoplasmic reticulum architecture: structures in flux.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 18, 358-364 (2006).</li>
<li>Ronchi, P., Colombo, S., Francolini, M., Borgese, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmembrane+domain-dependent+partitioning+of+membrane+proteins+within+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Transmembrane domain-dependent partitioning of membrane proteins within the endoplasmic reticulum.</a> J. Cell Biol. 181, 105-118 (2008).</li>
<li>Lippincott-Schwartz, J., Snapp, E., Kenworthy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+protein+dynamics+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Studying protein dynamics in living cells.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2, 444-456 (2001).</li>
<li>Lee, M. C., Miller, E. A., Goldberg, J., Orci, L., Schekman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bi-directional+protein+transport+between+the+ER+and%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Bi-directional protein transport between the ER and.</a> 20, 87-123 (2004).</li>
<li>Snapp, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+stacked+ER+cisternae+by+low+affinity+protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Formation of stacked ER cisternae by low affinity protein interactions.</a> J. Cell Biol. 163, 257-269 (2003).</li>
<li>Papiani, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restructured+endoplasmic+reticulum+generated+by+mutant+amyotrophic+lateral+sclerosis-linked+VAPB+is+cleared+by+the+proteasome%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Restructured endoplasmic reticulum generated by mutant amyotrophic lateral sclerosis-linked VAPB is cleared by the proteasome.</a> J. Cell Sci. 125, 3601-3611 (2012).</li>
<li>Almsherqi, Z. A., Kohlwein, S. D., Deng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cubic+membranes%3A+a+legend+beyond+the+Flatland%2A+of+cell+membrane+organization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cubic membranes: a legend beyond the Flatland* of cell membrane organization.</a> J. Cell Biol. 173, 839-844 (2006).</li>
<li>Federovitch, C. M., Ron, D., Hampton, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamic+ER%3A+experimental+approaches+and+current+questions%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The dynamic ER: experimental approaches and current questions.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 17, 409-414 (2005).</li>
<li>Takei, K., Mignery, G. A., Mugnaini, E., Sudhof, T. C., De Camilli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inositol+1%2C4%2C5-trisphosphate+receptor+causes+formation+of+ER+cisternal+stacks+in+transfected+fibroblasts+and+in+cerebellar+Purkinje+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Inositol 1,4,5-trisphosphate receptor causes formation of ER cisternal stacks in transfected fibroblasts and in cerebellar Purkinje cells.</a> Neuron. 12, 327-342 (1994).</li>
<li>Feldman, D., Swarm, R. L., Becker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+study+of+rat+liver+and+liver+neoplasms+after+long-term+treatment+with+phenobarbital%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural study of rat liver and liver neoplasms after long-term treatment with phenobarbital.</a> Cancer Res. 41, 2151-2162 (1981).</li>
<li>Sprocati, T., Ronchi, P., Raimondi, A., Francolini, M., Borgese, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+and+reversible+restructuring+of+the+endoplasmic+reticulum+induced+by+PDMP+in+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Dynamic and reversible restructuring of the endoplasmic reticulum induced by PDMP in cultured cells.</a> J. Cell Sci. 119, 3249-3260 (2006).</li>
<li>Costantini, L. M., Fossati, M., Francolini, M., Snapp, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+the+tendency+of+fluorescent+proteins+to+oligomerize+under+physiologic+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Assessing the tendency of fluorescent proteins to oligomerize under physiologic conditions.</a> Traffic. 13, 643-649 (2012).</li>
<li>Pyszniak, A. M., Welder, C. A., Takei, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+surface+distribution+of+high-avidity+LFA-1+detected+by+soluble+ICAM-1-coated+microspheres%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cell surface distribution of high-avidity LFA-1 detected by soluble ICAM-1-coated microspheres.</a> J. Immunol. 152, 5241-5249 (1994).</li>
<li>Taylor, J. P., Hardy, J., Fischbeck, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxic+proteins+in+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Toxic proteins in neurodegenerative disease.</a> Science. 296, 1991-1995 (2002).</li>
<li>Winklhofer, K. F., Tatzelt, J., Haass, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+two+faces+of+protein+misfolding%3A+gain-+and+loss-of-function+in+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">The two faces of protein misfolding: gain- and loss-of-function in neurodegenerative diseases.</a> EMBO J. 27, 336-349 (2008).</li>
<li>Borgese, N., Gazzoni, I., Barberi, M., Colombo, S., Pedrazzini, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+of+a+tail-anchored+protein+to+endoplasmic+reticulum+and+mitochondrial+outer+membrane+by+independent+but+competing+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Targeting of a tail-anchored protein to endoplasmic reticulum and mitochondrial outer membrane by independent but competing pathways.</a> Mol. Biol. Cell. 12, 2482-2496 (2001).</li>
<li>Chudakov, D. M., Matz, M. V., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+proteins+and+their+applications+in+imaging+living+cells+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Fluorescent proteins and their applications in imaging living cells and tissues.</a> Physiol Rev. 90, 1103-1163 (2010).</li>
<li>Bancaud, A., Huet, S., Rabut, G., Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+perturbation+techniques+to+study+mobility+and+molecular+dynamics+of+proteins+in+live+cells+FRAP%2C+photoactivation%2C+photoconversion%2C+and+FLIP%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Fluorescence perturbation techniques to study mobility and molecular dynamics of proteins in live cells FRAP, photoactivation, photoconversion, and FLIP.</a> Cold Spring Harb. Protoc. 2010, (2010).</li>
<li>Michida, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+endothelin+1+in+hemorrhagic+shock-induced+gastric+mucosal+injury+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Role of endothelin 1 in hemorrhagic shock-induced gastric mucosal injury in rats.</a> Gastroenterology. 106, 988-993 (1994).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文所述的实验方案和成像方法已被用于研究转染后定位于活细胞内质网中的TA荧光蛋白的分布与移动性。我们还通过超微结构分析，研究了这些蛋白过表达对该细胞器亚细胞结构的影响。
活细胞共聚焦成像与电子显微镜技术的结合是研究蛋白质动态特性的强有力手段，可为蛋白质功能提供重要信息。所述方法耗时较短（通常需三天工作时间），且随着大量用户友好型图像采集与分析软件的开发，基于光漂白的活细胞成像已变得相对简便。
这些技术的主要局限性在于使用荧光融合蛋白，因为荧光标签可能影响目标蛋白的正确折叠和/或组装。此外，过表达可能改变转染后荧光标记蛋白的行为，因而无法真实反映内源性蛋白的实际特性；然而，通过使用可诱导且稳定转染的细胞系，可精确调控表达水平，使其与内源性蛋白的表达水平相当，从而克服这一问题1,7。荧光蛋白（FPs）易于发生寡聚化的倾向已有广泛报道，可能显著改变嵌合蛋白的行为（即 动力学特性、非预期的蛋白质-蛋白质相互作用以及聚集体的形成）。因此，应考虑使用经过优化的单体荧光蛋白17。...

绿色荧光蛋白（GFP）及其光谱变体的发现，以及荧光显微镜技术的同步发展，为研究蛋白质在细胞内的行为开辟了全新的途径。荧光漂白后恢复（FRAP）和荧光漂白损失（FLIP）等技术正是基于荧光分子在强光照射下可逆地熄灭其荧光的内在特性而建立的，这些技术依赖于共聚焦活细胞成像和转染表达的荧光融合蛋白1-3。这些方法不仅广泛用于评估蛋白质的亚细胞定位，还可用于研究其移动性和囊泡运输过程，从而揭示有关其功能的重要线索4。
真核细胞的独特特征在于其具有特定脂质和蛋白质组成的细胞内区室。尽管细胞器在物理上相互隔离，但它们需要彼此间进行通讯并共享分子组分，以维持细胞稳态。分泌途径可确保在内质网中合成的蛋白质和脂质被准确地运送至其发挥功能的最终目的地。细胞内细胞器还可通过动态的接触位点相互连接，从而允许分子（如脂质）在不同区室之间直接交换。此外，许多蛋白质需要组装成大型异源复合物，或与特定种类的脂质（如脂筏/微区）结合，才能获得功能活性或被运输至其最终定位位置。上述这些生物学过程显著影响蛋白质的动力学特性，因此可通过下述技术进行恰当研究。
我们的研究团队已广泛采用荧光漂白恢复技术（FRAP）和荧光损失法（FLIP）结合电子显微镜，用于研究内质网的结构及其不同亚区域。内质网是分泌途径的第一站，在蛋白质和脂质分选过程中发挥关键作用5。它是一种高度动态的细胞器，其不同的亚结构区域反映了多种多样的功能（即 蛋白质和脂质的生物合成与运输、蛋白质折叠、Ca2+ 储存与释放，以及外源性物质代谢）。然而，尽管这些区域在形态、空间分布和功能上各不相同，它们彼此之间是连续的，并且在生理和病理条件下，其相对丰度可在细胞中发生改变。内质网最广为人知且通常在空间上分离的结构域包括核膜、光面内质网和粗面内质网；然而，我们及其他研究者已证明，在多种细胞类型和组织的生理条件下，存在具有更复杂结构和三维组织形式的内质网结构，这些结构亦可通过缺氧、药物处理或内质网驻留跨膜蛋白的过表达等应激刺激诱导产生2,6 （以及其中引用的参考文献）。
我们最近还证明了此类结构存在于人类疾病细胞模型中1,7。这些结构起源于光滑内质网（smooth ER）的层叠小管囊泡，在2003年被统称为规则排列的光滑内质网（organized smooth endoplasmic reticulum, OSER）6，尽管根据其结构特征（与其大小一样具有可变性），它们也被称为karmellae、lamellae或晶状内质网（crystalloid ER）。当细胞转染了与尾锚定（TA）内质网驻留蛋白胞质区融合的绿色荧光蛋白（GFP）（dEGFP-ER）后，GFP在反式（trans）条件下微弱的二聚倾向会显著改变内质网的组织结构和形态。荧光漂白恢复（FRAP）和荧光损失法（FLIP）实验表明，dEGFP-ER可在OSER内部自由扩散，且其可在网状内质网与OSER之间相互移动，这一事实说明这些聚集体与周围的网状内质网是连续的。超微结构分析使我们能够将荧光数据与OSER在纳米尺度上的精细结构和组织特征相关联：OSER始终由成对的光滑内质网小管囊泡堆叠而成，但其空间排列形式可能各异，例如规则排列的正弦阵列或卷曲结构，或呈六边形的&#34;晶状&#34;管状阵列。这些结构重排可导致立方体形态的形成8，而此类形态已在生理条件下9以及缺氧10、药物处理11和癌症9等应激状态下发现，因此可能具有作为超微结构标志物的重要潜力。
在首次利用GFP融合蛋白进行演示后，我们通过成像实验分析了内质网（ER）结构域在药物处理下的增殖情况12，评估了荧光蛋白在细胞内发生寡聚化的倾向13，并研究了一种突变型、与肌萎缩侧索硬化症（ALS）相关的TA蛋白在源自内质网的细胞内聚集物形成中的作用，这可能与其致病性相关1,8。有研究提出，细胞内聚集物的形成（在多种神经退行性疾病中均有发生14）可能是一种保护性机制，旨在阻止毒性突变蛋白与周围细胞组分之间的相互作用15。
以下描述了一种结合光学显微镜和电子显微镜的方法，用于研究C端疏水结构域插入内质网（ER）膜的构建物，以及分析其在培养细胞中动态行为和过表达对ER结构域架构的影响（实验方案的流程图见图1）。

<table><tbody><tr><td>杜尔贝科&amp;rsquo;s 改良伊格尔培养基（DMEM）</td><td>Invitrogen</td><td>41966029</td><td></td></tr><tr><td>杜尔贝科&amp;rsquo;不含酚红的改良型伊格尔培养基（DMEM）</td><td>Invitrogen</td><td>31053028</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Invitrogen</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺 200 mM 溶液</td><td>Invitrogen</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>jetPEI</td><td>Polyplus 转染</td><td>PP10110</td><td></td></tr><tr><td>OxyFluor</td><td>Oxyrase 公司</td><td>OF-0005</td><td></td></tr><tr><td>戊二醛 I 级</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G5882</td><td></td></tr><tr><td>三水合二甲胂酸钠</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C0250</td><td></td></tr><tr><td>四氧化锇 4% 溶液</td><td>电子显微镜科学</td><td>19150</td><td></td></tr><tr><td>乙酸铀酰二水合物</td><td>Sigma Aldrich</td><td>73943</td><td>微弱放射性</td></tr><tr><td>环氧丙烷</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>82320</td><td></td></tr><tr><td>EPON包埋介质试剂盒</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>45359-1EA-F</td><td></td></tr><tr><td>柠檬酸铅 </td><td>电子显微镜科学</td><td>17800</td><td></td></tr><tr><td>台式离心机</td><td>Eppendorf</td><td>5415 D</td><td></td></tr><tr><td>共聚焦光谱显微镜 </td><td>徕卡显微系统</td><td>TCS SP5</td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 显微镜培养箱孵育系统 </td><td>OkoLab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>超薄切片机 </td><td>Leica Microsystems</td><td>UC6</td><td></td></tr><tr><td>金刚石刀 </td><td>硅藻</td><td>Ultra 45 &amp;deg;</td><td></td></tr><tr><td>透射电子显微镜 </td><td>FEI</td><td>Tecnai G2</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism 软件</td><td>GraphPad Software, Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>用于24 mm盖玻片的钢制培养细胞腔室</td><td>生物科学工具</td><td>CSC-25</td><td></td></tr><tr><td>电子显微镜载网</td><td>电子显微镜科学</td><td>G300Cu</td><td></td></tr></tbody></table>

培养细胞中内质网亚区室的可视化

Visualization of Endoplasmic Reticulum Subdomains in Cultured Cells

真核细胞中的脂质和蛋白质在细胞器之间持续交换，尽管各细胞器在频繁的分子运输过程中仍保持其独特的组成和功能。本文所述技术是研究蛋白质和脂质流动性及运输的有力手段 体内 及其生理环境中的动态过程。光漂白后荧光恢复（FRAP）和光漂白中荧光丢失（FLIP）是广泛应用于活细胞成像的技术，可用于研究通过胞吐-胞吞途径的细胞内转运、细胞器或亚区室之间的连续性、蛋白质复合物的形成以及蛋白质在脂质微区中的定位，这些过程均可在生理和病理条件下进行观察。这些方法的主要局限性源于使用荧光融合蛋白，其潜在缺点包括在细胞中人为过表达，以及标记蛋白与天然蛋白在折叠和定位上可能存在差异。最后，由于光学显微镜的分辨率极限（约200 nm），无法对内质网的精细结构或细胞在应激条件下可能形成的特定亚区室进行深入研究即 缺氧、药物给药、跨膜内质网驻留蛋白的过表达）或在病理条件下，我们结合转染培养细胞的活细胞成像与基于透射电子显微镜的超微结构分析。

图2展示了一项蛋白质移动性的荧光漂白后恢复（FRAP）研究示例。dEGFP-ER蛋白的移动性通过在被漂白的OSER区域中荧光信号的快速恢复得以体现。为进行定量分析，通过拟合以下单指数方程，从实验测得的数据中推导出半恢复时间与可移动组分比例：
F(t) = Fpost + (Frec-Fpost)(1-e-t/τ)
其中 Fpost 为光漂白后的荧光信号，Frec 为漂白后达到的最大荧光恢复值，t 为记录时间， τ 为时间常数。
请注意，在图像采集过程中必须避免像素饱和，因为饱和可能改变荧光恢复，从而影响蛋白质迁移率的分析。此外，必须始终将漂白区域（ROI）内的荧光信号归一化为同一细胞的总荧光强度，以校...

我们描述了用于研究转染的荧光蛋白在内质网（ER）中分布与移动性的成像方法，该方法通过共聚焦成像技术对活细胞进行观察。同时，我们还从超微结构层面分析了这些蛋白表达对该亚细胞区室结构的影响。

真核细胞中的脂质和蛋白质在细胞区室之间持续交换，尽管这些区室仍保持其独特的组成和……

以下实验的总体目标是研究转染的荧光蛋白在内质网中的分布和运动方式，并评估其表达对超微结构架构的影响。为此，将培养的细胞瞬时转染带有GFP标签的尾锚定型内质网驻留蛋白。转染后，对活细胞进行共聚焦成像，以评估光漂白后的荧光恢复（FRAP）及荧光丢失情况。在光漂白或FLIP实验中，采用透射电子显微镜进行超微结构分析。所得数据表明，表达GFP标记的B五融合蛋白会显著改变内质网的组织结构，并诱导聚集体的形成。本文所展示的方法可为蛋白质和脂质的流动性与运输等基础细胞生物学过程提供深入见解。它还可用于研究对药物治疗的反应，以评估荧光蛋白、寡核苷酸优化，或研究致病性突变蛋白在细胞内聚集体形成中的作用，这些聚集体的起源可能与其致病性相关，例如在肌萎缩侧索硬化症中的情况。本研究使用的质粒包含一种增强型GFP，通过连接序列将其C末端与大鼠细胞色素B五的er亚型的尾部区域融合。B五的尾部区域包含在胰蛋白酶切割后仍与膜结合的完整序列。这包括一个17个残基的跨膜区，其上下游两侧分别为极性序列。连接区由M表位后接四个甘氨酸-丝氨酸重复序列（GLY4S3）构成。整个cDNA被插入哺乳动物表达载体pCDNA3的HindIII和XhoI位点。为准备转染，于转染前一天在37°C、5% CO2条件下，使用添加补液的DMEM培养COS-7细胞；次日，将3 × 10⁵个细胞接种于六孔板中的圆形24毫米玻璃盖玻片上。按照制造商的说明，使用 jet PEI 系统转染细胞，采用的 jet PEI 与 DNA 比例为 2:1。这通常可达到 70% 至 80% 的转染效率。成像前，在 37 摄氏度和 5% CO2 条件下培养细胞 24 小时。接着，使用镊子将带有转染细胞的盖玻片转移至成像腔室中。将组织培养皿放回培养箱，以保存剩余细胞。用于电子显微镜的超微结构分析。进行活细胞成像时，向钢制细胞培养腔中加入 2 毫升成像培养基。成像介质中包含Xi Fluor，以防止样本发生光漂白。O实验必须在存在smide的情况下进行，smide是一种翻译抑制剂，可避免因蛋白质生物合成导致A荧光信号及总荧光信号的增加。将成像腔室置于共聚焦显微镜载物台上，显微镜需配备温度控制的CO2培养箱，以及具有适当光电倍增管设置的激光器，以进行荧光恢复实验。光漂白或光裂解后，将细胞调至焦点，设置采集参数以避免像素饱和。同时确保激光功率尽可能调低，以防止因图像采集导致的光漂白。成像参数设置完成后，移动至包含两个或更多细胞的新视野。每次成像视野中应保留一个未漂白的细胞，以便用于对已漂白的一个或多个细胞的荧光信号进行归一化。进行漂白时，绘制一个与有序的粗面内质网（OSER）相对应的兴趣区域（ROI）。将成像程序设置为漂白模式，采用足够次数的迭代以实现高效且快速的光漂白。如有需要，可结合使用488纳米和405纳米激光器。设置软件在整个实验过程中每10秒采集一帧图像，持续10分钟，包括漂白前、漂白和恢复阶段。一切准备就绪后，开始进行漂白并采集图像。采集完成后，移动至新的视野区域并重复此过程。每个盖玻片采集四到五个视野区域。移动至下一个视野以测量光漂白或翻转过程中的荧光损失。设置程序在10分钟内每30秒执行一次漂白及漂白后成像，每次持续10秒，然后移至新的视野。绘制一个与OSER结构相对应的感兴趣区域（ROI），并如前所述启动漂白和图像采集以进行分析。将 frap 和 flip 图像导入 Image J 软件。首先，针对 frack 实验，评估漂白 ROI 随时间推移的荧光恢复情况；然后通过选择细胞外区域并测量其随时间变化的平均荧光强度，确定背景荧光。接下来，从 ROI 的荧光强度中减去背景信号。将数据归一化至漂白细胞的总荧光强度，该值在时间过程中应保持恒定。然后拟合此处所示的单指数方程，其中 F_post 为光漂白后的荧光信号，F_rec 为漂白后达到的最大荧光恢复值，T 为记录的最终时间，tau 为记录的半程时间。对于翻转实验的分析，应在光漂白的OSER区域外绘制一个ROI，覆盖整个细胞，并随时间测量其荧光强度。对于光漂白恢复实验（frack实验），通过使用细胞外区域扣除背景。通过将数据归一化至在未光漂白细胞上绘制的ROI的荧光水平，以校正成像过程本身引起的任何荧光衰减。最后，使用 GraphPad Prism 或类似软件绘制结果。制备电镜样品所用的许多试剂具有毒性，因此以下步骤应在穿戴实验服和手套并在通风橱内操作。从培养皿中取出盖玻片用于光学显微镜观察后，将培养皿底部剩余的单层细胞在室温下固定10分钟。接着，使用聚四氟乙烯（Teflon）刮刀刮下细胞，并转移至1.5毫升微量离心管中，于9,000 × g离心10分钟使细胞形成沉淀。离心后弃去上清液，加入新鲜固定液，于4摄氏度下过夜固定，次日继续后续操作。用移液管轻轻吸去固定液，向沉淀中加入Cate缓冲液进行洗涤。添加缓冲液时，应沿管壁缓慢加入，以避免扰动沉淀。吸去洗涤液后，将细胞置于含1%四氧化锇的Cate缓冲液中，在室温下后固定1小时。接着，用 Milli Q 水冲洗，并将 1% 醋酸铀溶于蒸馏水中，直接加入微型离心管。脱块染色 20 分钟至 1 小时，然后将样品依次置于浓度递增的乙醇溶液（70%、80%、90%、100% 和再次 100%）中各 10 分钟进行脱水。随后，用丙酮氧化物洗涤沉淀物两次，每次 15 分钟。通过将丙烯氧化物替换为丙烯氧化物与环氧树脂（epon）的1:1混合液，对样品进行渗透处理，孵育至少两小时，最长可过夜。接下来，进行样品包埋：将细胞沉淀碎片置于预先填充环氧树脂（epon）的包埋模具中，在60°C下固化至少24小时。次日，将树脂块安装在配备45度钻石刀的超薄切片机上。使用修块刀手动修整树脂块，去除未包埋样品的树脂部分。然后使用超薄切片机切出60至70纳米的切片。将切片收集在300目铜网上，用于后续染色。将载网置于30微升醋酸铀酰饱和溶液液滴上，孵育20分钟。然后用Milli-Q水冲洗三次，再将载网置于柠檬酸铅小液滴上孵育7分钟。孵育后，将载网浸入Milli-Q水中彻底清洗，并于室温下晾干。使用透射电子显微镜观察染色的载网，并通过底部安装的CCD相机在最终放大倍数为6,000至39,000倍的条件下采集图像，以研究D-E-G-F-P-ER在有序的光滑内质网中的侧向扩散。如本视频中所示的时间序列所示，对来自三个盖玻片的七例瞬时转染细胞进行了荧光漂白后恢复（FRAP）分析。在该序列中，两个OSER结构被漂白，并随时间记录荧光恢复情况。漂白后1分钟即检测到明显的荧光恢复，4分钟后信号进一步增强，用于确定恢复半衰期并量化D-E-G-F-P-ER的可移动组分比例。捕获的图像分析方法如本视频所述，结果如图所示。漂白区域的荧光强度随时间逐渐增加，表明荧光蛋白在聚集体内具有高度移动性。为了研究内质网不同亚区域之间的连续性，进行了翻转实验，如该时间序列所示。此处由黄色箭头指示的 OSER 的持续漂白，导致同一细胞内其他 ER 区域及其他 OSER 结构中的荧光信号逐渐减弱。红色箭头指示未漂白细胞的一部分，其荧光信号随时间保持恒定。对这些数据的定量分析揭示了网状 ER 的荧光信号迅速且逐步地耗尽，表明这些聚集体在物理上与其余 ER 相连。为了观察这些聚集体的精细结构，采用透射电子显微镜观察高表达 D-E-G-F-P ER 的细胞。该显微照片显示了含有膜聚集物的细胞质低倍放大图像。该聚集物由细胞质囊泡堆叠结构（stack cyi）和波浪状正弦样膜组成。如图所示。线粒体可见聚集在 OSER 结构周围，而由箭头所示的核糖体仅分布于最外层胞质网（cyi）的膜上。请注意，膜之间11纳米厚的电子致密区域与细胞质相连续。OS ER 可由层状内质网（lamellar er）形成，后者是由扁平化的内质网胞质网（er cyi）堆叠而成，在薄切片中呈现为连续或断裂的结构，偶尔可观察到从堆叠最外层胞质网出芽形成的囊泡，如此处所示。综合这些数据表明，在转染了 D-E-G-F-P ER 的培养细胞中观察到的荧光聚集物，代表了光滑且扁平的内质网区域，这些区域在空间上自组织形成明确定义的三维结构。在进行该实验操作时，务必注意获取的所有图像均不应包含饱和像素，因为饱和像素可能改变荧光恢复，从而影响对蛋白质迁移性的分析。在漂白区域（即感兴趣区域）中，必须始终将荧光信号归一化至同一细胞的总荧光强度，以校正因图像采集过程中发生漂白或焦平面微小变化所导致的荧光强度波动。

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