Name: 内质网子域的培养细胞中的可视化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-18T13:45:00.000+00:00
Duration: 16 min 43 s
Description: 学习利用活细胞共聚焦成像和荧光漂白恢复技术研究培养细胞中内质网子域的分布与蛋白质动态。该方法结合透射电子显微镜可深入解析细胞超微结构变化。

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作者感谢Fondazione Filarete在本文发表过程中提供的帮助与支持。我们还要感谢Centro Europeo di Nanomedicina提供TECNAI G2透射电子显微镜的使用。

1. 质粒、细胞培养及内质网荧光蛋白转染
<ol>
	<li>本研究中使用的质粒包含一种增强型绿色荧光蛋白（GFP），其C末端通过一段连接序列与大鼠细胞色素b(5)内质网亚型（本文简称为b(5)）的尾部区域融合。该尾部区域含有在胰蛋白酶切割天然b(5)后仍与膜结合的完整序列（Pro94-Asp134），其中包括17个氨基酸残基的跨膜结构域（TMD），其上下游分别由极性序列（UPS和DPS）包围。连接序列由myc表位和[(Gly)4Ser]3组成，整个cDNA插入哺乳动物表达载体pCDNA3的Hind3-Xba1位点。该质粒构建的详细信息已在先前发表的研究中描述，其中将其命名为GFP-ER16。</li>
	<li>在37 °C、10% CO2的培养箱中，使用添加10%胎牛血清、2 mM L-谷氨酰胺和1%青霉素/链霉素的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）培养COS-7细胞。</li>
	<li>转染。将3 × 105个细胞接种于6孔板中的圆形玻璃盖玻片上，次日按照制造商说明使用JetPEI系统进行转染。请注意，已针对不同质粒和细胞系优化了JetPEI/DNA的最佳比例以实现最高转染效率：在本实验条件下，JetPEI:DNA比例为2:1时，转染效率可达70–80%。</li>
</ol>
2. 活细胞荧光扫描共聚焦显微镜
<ol>
	<li>活细胞成像。将转染细胞接种的盖玻片放入专用于24 mm盖玻片的钢制培养腔室中，腔室内加入不含酚红的DMEM培养基，补充10% FBS、2 mM L-谷氨酰胺、1%青霉素/链霉素、25 mM HEPES、50 μg/ml环己酰亚胺以及1:100稀释的OxyFluor以防止样品发生光漂白。使用配备温控CO2培养箱（37 °C，5% CO2）的SP5共聚焦显微镜进行活细胞成像实验，通过488 nm激光激发并结合525/50带通发射滤光片对dGFP-ER进行可视化观察。</li>
	<li>光漂白后荧光恢复（FRAP）。选定一个与OSER结构相对应的兴趣区域（ROI），使用20次迭代进行漂白，同时结合488 nm（30 mW氩离子激光器的100%，相当于样品处5.5–6 μW）和405 nm（30 mW二极管405激光器的60%，相当于样品处11.6 μW）激光器，根据我们的经验，该组合可实现高效且快速的光漂白。</li>
	<li>通过每10秒采集一帧图像，持续记录10分钟内漂白ROI中荧光信号的恢复情况（像素时间为1.61 μsec/px）。</li>
	<li>光漂白过程中的荧光丢失（FLIP）。选定一个与OSER结构相对应的兴趣区域（ROI），并按上述方法进行漂白。每30秒重复一次漂白过程，漂白后图像每10秒采集一次，持续30分钟（像素时间为1.61 μsec/px）。</li>
	<li>FRAP与FLIP数据分析。所有图像均使用ImageJ软件（<a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html" target="_blank">http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html</a>）进行分析。在FRAP实验中，随时间测量漂白ROI的荧光恢复强度，并将其归一化至整个漂白细胞的总荧光强度，后者需始终确认在时间过程中保持恒定。</li>
	<li>对于FLIP实验，绘制一个位于漂白OSER之外但覆盖整个细胞的兴趣区域（ROI）。测量该区域随时间变化的荧光强度，并将其归一化至在未漂白细胞上绘制的ROI的荧光水平，以校正成像过程本身可能引起的任何荧光衰减。</li>
	<li>在所有实验中，从ROI的荧光强度中扣除在细胞外区域测定的背景信号。最后，使用GraphPad Prism软件绘制结果图。</li>
</ol>
3. 透射电子显微镜下的超微结构分析
鉴于许多试剂具有毒性，所有操作均应在通风橱内进行，并穿戴适当的实验服和手套。
<ol>
	<li>从培养皿中取出盖玻片后，用过滤的2%戊二醛溶于0.1 M卡考基酸盐缓冲液（pH 7.4）中，在室温下固定培养皿底部生长的剩余细胞单层，固定时间为10分钟。</li>
	<li>使用聚四氟乙烯刮刀刮取细胞，并将其转移至1.5 ml离心管中。在9,000 g离心10分钟使细胞成团，弃去上清液，加入新鲜固定液，并于4 °C下放置过夜。</li>
	<li>用缓冲液洗涤细胞团块，然后在室温下用1%四氧化锇溶于卡考基酸盐缓冲液中后固定1小时。</li>
	<li>用MilliQ水冲洗，再用1%醋酸铀溶于蒸馏水中进行块染（en bloc染色），时间为20–60分钟。</li>
	<li>将样品依次用浓度递增的乙醇系列（70%、80%、90%、100%、100%，每步10分钟）进行脱水，并用丙烯酸氧化物短暂清洗两次（每次15分钟）。</li>
	<li>用丙烯酸氧化物与Epon的混合液（1:1）对样品进行渗透处理，时间为2小时至过夜。</li>
	<li>将样品包埋于Epon环氧树脂中，并在60 °C下固化至少24小时。</li>
	<li>使用配备45°金刚石刀的LEICA UC6超薄切片机对人工修整后的树脂块进行切片，获得厚度为60–70 nm的切片，并将切片收集于300目铜网上。</li>
	<li>在铜网上用醋酸铀饱和溶液染色20分钟，再用柠檬酸铅染色7分钟，随后将铜网浸入双蒸过滤水中彻底清洗，并在室温下自然干燥。</li>
	<li>使用TECNAI G2透射电子显微镜观察染色后的铜网样品，并通过底部安装的CCD相机在不同最终放大倍数下（通常为6,000–39,000X）采集图像。</li>
</ol>

<ol><li>Fasana, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+VAPB+mutant+linked+to+amyotrophic+lateral+sclerosis+generates+a+novel+form+of+organized+smooth+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">A VAPB mutant linked to amyotrophic lateral sclerosis generates a novel form of organized smooth endoplasmic reticulum.</a> FASEB J. 24, 1419-1430 (2010).</li>
<li>Borgese, N., Francolini, M., Snapp, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endoplasmic+reticulum+architecture%3A+structures+in+flux%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Endoplasmic reticulum architecture: structures in flux.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 18, 358-364 (2006).</li>
<li>Ronchi, P., Colombo, S., Francolini, M., Borgese, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmembrane+domain-dependent+partitioning+of+membrane+proteins+within+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Transmembrane domain-dependent partitioning of membrane proteins within the endoplasmic reticulum.</a> J. Cell Biol. 181, 105-118 (2008).</li>
<li>Lippincott-Schwartz, J., Snapp, E., Kenworthy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+protein+dynamics+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Studying protein dynamics in living cells.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2, 444-456 (2001).</li>
<li>Lee, M. C., Miller, E. A., Goldberg, J., Orci, L., Schekman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bi-directional+protein+transport+between+the+ER+and%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Bi-directional protein transport between the ER and.</a> 20, 87-123 (2004).</li>
<li>Snapp, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+stacked+ER+cisternae+by+low+affinity+protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Formation of stacked ER cisternae by low affinity protein interactions.</a> J. Cell Biol. 163, 257-269 (2003).</li>
<li>Papiani, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restructured+endoplasmic+reticulum+generated+by+mutant+amyotrophic+lateral+sclerosis-linked+VAPB+is+cleared+by+the+proteasome%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Restructured endoplasmic reticulum generated by mutant amyotrophic lateral sclerosis-linked VAPB is cleared by the proteasome.</a> J. Cell Sci. 125, 3601-3611 (2012).</li>
<li>Almsherqi, Z. A., Kohlwein, S. D., Deng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cubic+membranes%3A+a+legend+beyond+the+Flatland%2A+of+cell+membrane+organization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cubic membranes: a legend beyond the Flatland* of cell membrane organization.</a> J. Cell Biol. 173, 839-844 (2006).</li>
<li>Federovitch, C. M., Ron, D., Hampton, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamic+ER%3A+experimental+approaches+and+current+questions%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The dynamic ER: experimental approaches and current questions.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 17, 409-414 (2005).</li>
<li>Takei, K., Mignery, G. A., Mugnaini, E., Sudhof, T. C., De Camilli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inositol+1%2C4%2C5-trisphosphate+receptor+causes+formation+of+ER+cisternal+stacks+in+transfected+fibroblasts+and+in+cerebellar+Purkinje+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Inositol 1,4,5-trisphosphate receptor causes formation of ER cisternal stacks in transfected fibroblasts and in cerebellar Purkinje cells.</a> Neuron. 12, 327-342 (1994).</li>
<li>Feldman, D., Swarm, R. L., Becker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+study+of+rat+liver+and+liver+neoplasms+after+long-term+treatment+with+phenobarbital%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural study of rat liver and liver neoplasms after long-term treatment with phenobarbital.</a> Cancer Res. 41, 2151-2162 (1981).</li>
<li>Sprocati, T., Ronchi, P., Raimondi, A., Francolini, M., Borgese, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+and+reversible+restructuring+of+the+endoplasmic+reticulum+induced+by+PDMP+in+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Dynamic and reversible restructuring of the endoplasmic reticulum induced by PDMP in cultured cells.</a> J. Cell Sci. 119, 3249-3260 (2006).</li>
<li>Costantini, L. M., Fossati, M., Francolini, M., Snapp, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+the+tendency+of+fluorescent+proteins+to+oligomerize+under+physiologic+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Assessing the tendency of fluorescent proteins to oligomerize under physiologic conditions.</a> Traffic. 13, 643-649 (2012).</li>
<li>Pyszniak, A. M., Welder, C. A., Takei, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+surface+distribution+of+high-avidity+LFA-1+detected+by+soluble+ICAM-1-coated+microspheres%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cell surface distribution of high-avidity LFA-1 detected by soluble ICAM-1-coated microspheres.</a> J. Immunol. 152, 5241-5249 (1994).</li>
<li>Taylor, J. P., Hardy, J., Fischbeck, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxic+proteins+in+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Toxic proteins in neurodegenerative disease.</a> Science. 296, 1991-1995 (2002).</li>
<li>Winklhofer, K. F., Tatzelt, J., Haass, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+two+faces+of+protein+misfolding%3A+gain-+and+loss-of-function+in+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">The two faces of protein misfolding: gain- and loss-of-function in neurodegenerative diseases.</a> EMBO J. 27, 336-349 (2008).</li>
<li>Borgese, N., Gazzoni, I., Barberi, M., Colombo, S., Pedrazzini, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+of+a+tail-anchored+protein+to+endoplasmic+reticulum+and+mitochondrial+outer+membrane+by+independent+but+competing+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Targeting of a tail-anchored protein to endoplasmic reticulum and mitochondrial outer membrane by independent but competing pathways.</a> Mol. Biol. Cell. 12, 2482-2496 (2001).</li>
<li>Chudakov, D. M., Matz, M. V., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+proteins+and+their+applications+in+imaging+living+cells+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Fluorescent proteins and their applications in imaging living cells and tissues.</a> Physiol Rev. 90, 1103-1163 (2010).</li>
<li>Bancaud, A., Huet, S., Rabut, G., Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+perturbation+techniques+to+study+mobility+and+molecular+dynamics+of+proteins+in+live+cells+FRAP%2C+photoactivation%2C+photoconversion%2C+and+FLIP%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Fluorescence perturbation techniques to study mobility and molecular dynamics of proteins in live cells FRAP, photoactivation, photoconversion, and FLIP.</a> Cold Spring Harb. Protoc. 2010, (2010).</li>
<li>Michida, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+endothelin+1+in+hemorrhagic+shock-induced+gastric+mucosal+injury+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Role of endothelin 1 in hemorrhagic shock-induced gastric mucosal injury in rats.</a> Gastroenterology. 106, 988-993 (1994).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文所述的实验方案和成像方法已被用于研究转染后定位于活细胞内质网中的TA荧光蛋白的分布与移动性。我们还通过超微结构分析，研究了这些蛋白过表达对该细胞器亚细胞结构的影响。
活细胞共聚焦成像与电子显微镜技术的结合是研究蛋白质动态特性的强有力手段，可为蛋白质功能提供重要信息。所述方法耗时较短（通常需三天工作时间），且随着大量用户友好型图像采集与分析软件的开发，基于光漂白的活细胞成像已变得相对简便。
这些技术的主要局限性在于使用荧光融合蛋白，因为荧光标签可能影响目标蛋白的正确折叠和/或组装。此外，过表达可能改变转染后荧光标记蛋白的行为，因而无法真实反映内源性蛋白的实际特性；然而，通过使用可诱导且稳定转染的细胞系，可精确调控表达水平，使其与内源性蛋白的表达水平相当，从而克服这一问题1,7。荧光蛋白（FPs）易于发生寡聚化的倾向已有广泛报道，可能显著改变嵌合蛋白的行为（即 动力学特性、非预期的蛋白质-蛋白质相互作用以及聚集体的形成）。因此，应考虑使用经过优化的单体荧光蛋白17。...

绿色荧光蛋白（GFP）及其光谱变体的发现，以及荧光显微镜技术的同步发展，为研究蛋白质在细胞内的行为开辟了全新的途径。荧光漂白后恢复（FRAP）和荧光漂白损失（FLIP）等技术正是基于荧光分子在强光照射下可逆地熄灭其荧光的内在特性而建立的，这些技术依赖于共聚焦活细胞成像和转染表达的荧光融合蛋白1-3。这些方法不仅广泛用于评估蛋白质的亚细胞定位，还可用于研究其移动性和囊泡运输过程，从而揭示有关其功能的重要线索4。
真核细胞的独特特征在于其具有特定脂质和蛋白质组成的细胞内区室。尽管细胞器在物理上相互隔离，但它们需要彼此间进行通讯并共享分子组分，以维持细胞稳态。分泌途径可确保在内质网中合成的蛋白质和脂质被准确地运送至其发挥功能的最终目的地。细胞内细胞器还可通过动态的接触位点相互连接，从而允许分子（如脂质）在不同区室之间直接交换。此外，许多蛋白质需要组装成大型异源复合物，或与特定种类的脂质（如脂筏/微区）结合，才能获得功能活性或被运输至其最终定位位置。上述这些生物学过程显著影响蛋白质的动力学特性，因此可通过下述技术进行恰当研究。
我们的研究团队已广泛采用荧光漂白恢复技术（FRAP）和荧光损失法（FLIP）结合电子显微镜，用于研究内质网的结构及其不同亚区域。内质网是分泌途径的第一站，在蛋白质和脂质分选过程中发挥关键作用5。它是一种高度动态的细胞器，其不同的亚结构区域反映了多种多样的功能（即 蛋白质和脂质的生物合成与运输、蛋白质折叠、Ca2+ 储存与释放，以及外源性物质代谢）。然而，尽管这些区域在形态、空间分布和功能上各不相同，它们彼此之间是连续的，并且在生理和病理条件下，其相对丰度可在细胞中发生改变。内质网最广为人知且通常在空间上分离的结构域包括核膜、光面内质网和粗面内质网；然而，我们及其他研究者已证明，在多种细胞类型和组织的生理条件下，存在具有更复杂结构和三维组织形式的内质网结构，这些结构亦可通过缺氧、药物处理或内质网驻留跨膜蛋白的过表达等应激刺激诱导产生2,6 （以及其中引用的参考文献）。
我们最近还证明了此类结构存在于人类疾病细胞模型中1,7。这些结构起源于光滑内质网（smooth ER）的层叠小管囊泡，在2003年被统称为规则排列的光滑内质网（organized smooth endoplasmic reticulum, OSER）6，尽管根据其结构特征（与其大小一样具有可变性），它们也被称为karmellae、lamellae或晶状内质网（crystalloid ER）。当细胞转染了与尾锚定（TA）内质网驻留蛋白胞质区融合的绿色荧光蛋白（GFP）（dEGFP-ER）后，GFP在反式（trans）条件下微弱的二聚倾向会显著改变内质网的组织结构和形态。荧光漂白恢复（FRAP）和荧光损失法（FLIP）实验表明，dEGFP-ER可在OSER内部自由扩散，且其可在网状内质网与OSER之间相互移动，这一事实说明这些聚集体与周围的网状内质网是连续的。超微结构分析使我们能够将荧光数据与OSER在纳米尺度上的精细结构和组织特征相关联：OSER始终由成对的光滑内质网小管囊泡堆叠而成，但其空间排列形式可能各异，例如规则排列的正弦阵列或卷曲结构，或呈六边形的&#34;晶状&#34;管状阵列。这些结构重排可导致立方体形态的形成8，而此类形态已在生理条件下9以及缺氧10、药物处理11和癌症9等应激状态下发现，因此可能具有作为超微结构标志物的重要潜力。
在首次利用GFP融合蛋白进行演示后，我们通过成像实验分析了内质网（ER）结构域在药物处理下的增殖情况12，评估了荧光蛋白在细胞内发生寡聚化的倾向13，并研究了一种突变型、与肌萎缩侧索硬化症（ALS）相关的TA蛋白在源自内质网的细胞内聚集物形成中的作用，这可能与其致病性相关1,8。有研究提出，细胞内聚集物的形成（在多种神经退行性疾病中均有发生14）可能是一种保护性机制，旨在阻止毒性突变蛋白与周围细胞组分之间的相互作用15。
以下描述了一种结合光学显微镜和电子显微镜的方法，用于研究C端疏水结构域插入内质网（ER）膜的构建物，以及分析其在培养细胞中动态行为和过表达对ER结构域架构的影响（实验方案的流程图见图1）。

<table><tbody><tr><td>杜尔贝科&amp;rsquo;s 改良伊格尔培养基（DMEM）</td><td>Invitrogen</td><td>41966029</td><td></td></tr><tr><td>杜尔贝科&amp;rsquo;不含酚红的改良型伊格尔培养基（DMEM）</td><td>Invitrogen</td><td>31053028</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Invitrogen</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺 200 mM 溶液</td><td>Invitrogen</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>jetPEI</td><td>Polyplus 转染</td><td>PP10110</td><td></td></tr><tr><td>OxyFluor</td><td>Oxyrase 公司</td><td>OF-0005</td><td></td></tr><tr><td>戊二醛 I 级</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G5882</td><td></td></tr><tr><td>三水合二甲胂酸钠</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C0250</td><td></td></tr><tr><td>四氧化锇 4% 溶液</td><td>电子显微镜科学</td><td>19150</td><td></td></tr><tr><td>乙酸铀酰二水合物</td><td>Sigma Aldrich</td><td>73943</td><td>微弱放射性</td></tr><tr><td>环氧丙烷</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>82320</td><td></td></tr><tr><td>EPON包埋介质试剂盒</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>45359-1EA-F</td><td></td></tr><tr><td>柠檬酸铅 </td><td>电子显微镜科学</td><td>17800</td><td></td></tr><tr><td>台式离心机</td><td>Eppendorf</td><td>5415 D</td><td></td></tr><tr><td>共聚焦光谱显微镜 </td><td>徕卡显微系统</td><td>TCS SP5</td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 显微镜培养箱孵育系统 </td><td>OkoLab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>超薄切片机 </td><td>Leica Microsystems</td><td>UC6</td><td></td></tr><tr><td>金刚石刀 </td><td>硅藻</td><td>Ultra 45 &amp;deg;</td><td></td></tr><tr><td>透射电子显微镜 </td><td>FEI</td><td>Tecnai G2</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism 软件</td><td>GraphPad Software, Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>用于24 mm盖玻片的钢制培养细胞腔室</td><td>生物科学工具</td><td>CSC-25</td><td></td></tr><tr><td>电子显微镜载网</td><td>电子显微镜科学</td><td>G300Cu</td><td></td></tr></tbody></table>

培养细胞中内质网亚区室的可视化

Visualization of Endoplasmic Reticulum Subdomains in Cultured Cells

真核细胞中的脂质和蛋白质在细胞器之间持续交换，尽管各细胞器在频繁的分子运输过程中仍保持其独特的组成和功能。本文所述技术是研究蛋白质和脂质流动性及运输的有力手段 体内 及其生理环境中的动态过程。光漂白后荧光恢复（FRAP）和光漂白中荧光丢失（FLIP）是广泛应用于活细胞成像的技术，可用于研究通过胞吐-胞吞途径的细胞内转运、细胞器或亚区室之间的连续性、蛋白质复合物的形成以及蛋白质在脂质微区中的定位，这些过程均可在生理和病理条件下进行观察。这些方法的主要局限性源于使用荧光融合蛋白，其潜在缺点包括在细胞中人为过表达，以及标记蛋白与天然蛋白在折叠和定位上可能存在差异。最后，由于光学显微镜的分辨率极限（约200 nm），无法对内质网的精细结构或细胞在应激条件下可能形成的特定亚区室进行深入研究即 缺氧、药物给药、跨膜内质网驻留蛋白的过表达）或在病理条件下，我们结合转染培养细胞的活细胞成像与基于透射电子显微镜的超微结构分析。

图2展示了一项蛋白质移动性的荧光漂白后恢复（FRAP）研究示例。dEGFP-ER蛋白的移动性通过在被漂白的OSER区域中荧光信号的快速恢复得以体现。为进行定量分析，通过拟合以下单指数方程，从实验测得的数据中推导出半恢复时间与可移动组分比例：
F(t) = Fpost + (Frec-Fpost)(1-e-t/τ)
其中 Fpost 为光漂白后的荧光信号，Frec 为漂白后达到的最大荧光恢复值，t 为记录时间， τ 为时间常数。
请注意，在图像采集过程中必须避免像素饱和，因为饱和可能改变荧光恢复，从而影响蛋白质迁移率的分析。此外，必须始终将漂白区域（ROI）内的荧光信号归一化为同一细胞的总荧光强度，以校...

我们描述了用于研究转染的荧光蛋白在内质网（ER）中分布与移动性的成像方法，该方法通过共聚焦成像技术对活细胞进行观察。同时，我们还从超微结构层面分析了这些蛋白表达对该亚细胞区室结构的影响。

真核细胞中的脂质和蛋白质在细胞区室之间持续交换，尽管这些区室仍保持其独特的组成和……

以下实验的总体目标是研究转染的荧光蛋白在内质网中的分布和运动方式，并评估其表达对超微结构架构的影响。为此，将培养的细胞瞬时转染带有GFP标签的尾锚定型内质网驻留蛋白。转染后，对活细胞进行共聚焦成像，以评估光漂白后的荧光恢复（FRAP）及荧光丢失情况。在光漂白或FLIP实验中，采用透射电子显微镜进行超微结构分析。所得数据表明，表达GFP标记的B五融合蛋白会显著改变内质网的组织结构，并诱导聚集体的形成。本文所展示的方法可为蛋白质和脂质的流动性与运输等基础细胞生物学过程提供深入见解。它还可用于研究对药物治疗的反应，以评估荧光蛋白、寡核苷酸优化，或研究致病性突变蛋白在细胞内聚集体形成中的作用，这些聚集体的起源可能与其致病性相关，例如在肌萎缩侧索硬化症中的情况。本研究使用的质粒包含一种增强型GFP，通过连接序列将其C末端与大鼠细胞色素B五的er亚型的尾部区域融合。B五的尾部区域包含在胰蛋白酶切割后仍与膜结合的完整序列。这包括一个17个残基的跨膜区，其上下游两侧分别为极性序列。连接区由M表位后接四个甘氨酸-丝氨酸重复序列（GLY4S3）构成。整个cDNA被插入哺乳动物表达载体pCDNA3的HindIII和XhoI位点。为准备转染，于转染前一天在37°C、5% CO2条件下，使用添加补液的DMEM培养COS-7细胞；次日，将3 × 10⁵个细胞接种于六孔板中的圆形24毫米玻璃盖玻片上。按照制造商的说明，使用 jet PEI 系统转染细胞，采用的 jet PEI 与 DNA 比例为 2:1。这通常可达到 70% 至 80% 的转染效率。成像前，在 37 摄氏度和 5% CO2 条件下培养细胞 24 小时。接着，使用镊子将带有转染细胞的盖玻片转移至成像腔室中。将组织培养皿放回培养箱，以保存剩余细胞。用于电子显微镜的超微结构分析。进行活细胞成像时，向钢制细胞培养腔中加入 2 毫升成像培养基。成像介质中包含Xi Fluor，以防止样本发生光漂白。O实验必须在存在smide的情况下进行，smide是一种翻译抑制剂，可避免因蛋白质生物合成导致A荧光信号及总荧光信号的增加。将成像腔室置于共聚焦显微镜载物台上，显微镜需配备温度控制的CO2培养箱，以及具有适当光电倍增管设置的激光器，以进行荧光恢复实验。光漂白或光裂解后，将细胞调至焦点，设置采集参数以避免像素饱和。同时确保激光功率尽可能调低，以防止因图像采集导致的光漂白。成像参数设置完成后，移动至包含两个或更多细胞的新视野。每次成像视野中应保留一个未漂白的细胞，以便用于对已漂白的一个或多个细胞的荧光信号进行归一化。进行漂白时，绘制一个与有序的粗面内质网（OSER）相对应的兴趣区域（ROI）。将成像程序设置为漂白模式，采用足够次数的迭代以实现高效且快速的光漂白。如有需要，可结合使用488纳米和405纳米激光器。设置软件在整个实验过程中每10秒

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

内质网子域的培养细胞中的可视化

本文介绍一种在哺乳动物组织培养细胞中可视化内质网相关mRNA的方法。该技术包括利用皂苷选择性通透细胞膜以去除胞质内容物，随后进行荧光标记 原位 杂交以检测总多聚(A) mRNA...

哺乳动物细胞中内质网定位mRNA的可视化

网格蛋白介导的内吞作用是一种快速且高度动态的过程，可将多种蛋白质（包括信号受体）内化。本文所述的实验方案可直接可视化单个内吞事件的动力学过程。这对于理解内吞机制核心组分之间如何相互协调，以及蛋白质货物如何影响该过程至关重要。...

通过全内反射荧光显微镜以单事件分辨率可视化G蛋白偶联受体的网格蛋白介导的内吞作用

在此，我们介绍一种高灵敏度可视化和定量固定细胞中内质网与线粒体之间内源性相互作用的方法。该方案采用了一种优化的 原位 靶向线粒体相关膜界面处的三磷酸肌醇受体/葡萄糖调节蛋白75/电压依赖性阴离子通道/亲环素D复合物的邻近连接...

内质网与线粒体相互作用的研究方法 原位 固定细胞中的邻近连接测定

利用对pH敏感的荧光蛋白——超 ecliptic...

利用pHluorin标记的受体监测亚细胞定位与转运

我们提出了一种研究线粒体和内质网在基因改造后于全细胞中分布的方案，该方案结合了相关光镜与三维电子显微镜技术，包括抗坏血酸过氧化物酶2和辣根过氧化物酶染色、在同一切片中对含有或不含目标基因的细胞进行连续切片，以及通过电子显微镜进行连续成像。...

线粒体与内质网的光与体电子显微镜关联成像

一种简单且全面的方案，用于获取肝脏肝细胞或其他组织细胞中细胞器之间膜接触位点的三维细节。...

利用连续切片电子显微镜对肝细胞中细胞器间接触位点进行三维表征

本实验方案描述了一种利用量子点对心脏组织切片中的蛋白质进行免疫标记的方法。该技术为在超微结构水平上观察任何蛋白质的亚细胞定位和表达提供了有效的工具。...

利用量子点介导的免疫标记结合透射电子显微镜观察心脏中蛋白质的亚细胞定位

由于人们对研究膜接触位点（MCSs）及其组分的细胞结构日益关注，迫切需要开发新的研究方法。本文介绍了一种整合了已有显微镜技术的实验方案，用于鉴定并定量位于膜接触位点的细胞器内及细胞器间蛋白质复合物。...

通过邻位连接检测法对内质网-线粒体接触位点内源性细胞器内蛋白质相互作用的可视化与定量分析

本文介绍了一种基于内源性荧光标记的优化切片上相关光镜-电镜联用技术方案，用于研究稀有蛋白质相对于细胞超微结构的定位。该方法的优势通过在未使用巴佛洛霉素处理的饥饿细胞中实现内源性LC3蛋白的超微结构定位得以展示。...

通过切片上相关联的光学-电子显微镜对内源性LC3进行超微结构定位

确定培养物中的细胞数量对于标准化培养条件以及进行准确的定量实验至关重要。在本视频中，我们演示如何使用血细胞计数板对细胞进行计数。...

计数并测定培养细胞的存活率

学习利用活细胞共聚焦成像和荧光漂白恢复技术研究培养细胞中内质网子域的分布与蛋白质动态。该方法结合透射电子显微镜可深入解析细胞超微结构变化。

培养细胞中内质网亚区室的可视化

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