啮齿类动物成神经细胞的核转染以研究成神经细胞迁移 体外

本实验的总体目标是转染原代啮齿类动物出生后神经母细胞，以研究目的蛋白对其迁移的影响。该过程首先从啮齿类动物脑部的吻侧迁移流中分离神经母细胞；第二步是将这些细胞解离，并通过核酸转染技术使用DNA或shRNA对其进行转染。

接下来，将神经母细胞在悬滴中重新聚集，然后在悬浮条件下培养适当时间。最后一步是将重新聚集的神经母细胞簇嵌入三维基质中，使其迁移。最终通过免疫荧光或延时成像显微镜分析神经母细胞的迁移情况。

该方法有助于回答神经发生领域中的一个关键问题，例如出生后大脑中干细胞来源的成神经细胞迁移的调控机制。该技术的主要优势在于，与使用病毒载体相比，该方法相对简单且快速，而病毒载体的使用往往具有挑战性且耗时。在处死一批出生后第6至第7天的大鼠幼崽后，用手术刀片在每只大鼠的皮肤上沿矢状缝从鼻部至小脑做一后正中切口。

接下来，剥去皮肤。沿颅骨做相同的切口。然后用镊子轻轻移除颅骨瓣，并用刮匙小心地将脑组织连同嗅球一起取出。

随后，切除脑组织最前端的三分之一并弃去。接着，使用组织切片机将脑组织切成厚度为 1.4 毫米的冠状切片。将切片转移至含有冰冷解剖液的培养皿中。

然后在解剖显微镜下观察切片，用针小心将其分离。嗅球切片中央的吻侧迁移流呈现为一个三角形的半透明区域，以及一个小的圆形区域。

在更完整的脑切片中，使用显微外科刀将每个切片中的吻侧迁移流（RMS）切割出来，注意避免包含周围组织。接着，用塑料移液管收集RMS片段，并将其置于含有冰冷解剖液的小培养皿中，置于冰上。然后轻轻旋转培养皿，使RMS片段聚集于培养皿中央。

用塑料移液管收集组织碎片，并将其转移至15毫升离心管中。静置，使碎片沉降至管底。弃去解剖液，加入2毫升T3解离液。

使用 P1000 移液器将 RMS 组织碎片悬液轻轻吹打约 10 次，以评估碎片的解离程度。随后将装有组织碎片的离心管置于 37 摄氏度水浴中孵育 2 分钟。接着再次吹打溶液 10 次，并确认组织碎片已充分解离。

然后加入5毫升预热的含10%胎牛血清（FCS）的DMEM培养基以灭活胰蛋白酶，并在433 × g离心5分钟。弃去上清液，重悬细胞沉淀。用1毫升预热的含10% FCS的DMEM培养基轻轻吹打重悬细胞沉淀，再加入4毫升相同的培养基。

然后进行细胞计数。每次转染至少需要 2.5 × 10⁶ 个细胞，而使用每转染 3 × 10⁶ 至 4 × 10⁶ 个细胞可获得最佳结果。

以433 × g离心细胞悬液5分钟。随后，尽可能彻底移除该步骤中的培养基。立即用先前孵育过的的大鼠神经元核转染溶液重悬细胞沉淀。

在室温下，将100微升细胞悬液转移至每支含有SI R-N-A-D-N-A的EOR管中。然后使用P200移液器轻柔吹打两到三次以混匀。接着，将样品加入核酸亲和柱底部，注意避免产生气泡。

对于转染操作，大鼠细胞使用G-013程序，小鼠细胞使用O-005程序。转染后，立即向转染样品中加入1毫升预热的DMEM培养基（含10%FCS）。使用核酸转染试剂盒提供的塑料移液管，将样品转移至含有5毫升预热DMEM培养基（含10%FCS）的15毫升离心管中。

然后以433 × g离心样品5分钟。小心移除所有过量培养基，并用P20移液器将沉淀重悬于25至30 µL预热的含10% FCS的DMEM中。培养基体积不得超过30 µL。

随后，将悬液用移液器以液滴形式加至 P 35 培养皿盖的内侧。然后将盖子倒置在含有两毫升完全培养基的 P 35 培养皿上。置于 37°C、5% 二氧化碳的培养箱中孵育至少五小时。

五小时后，使用剪去尖端的 P 1000 移液枪将悬滴从皿盖转移至培养皿中的完全培养基中。然后将样品在 37°C、5% 二氧化碳条件下孵育 24 小时，用于 DNA NU 核感染，或孵育 48 小时用于 SI A HRA 核影响。

现在配制25毫升完全培养基，并在37摄氏度、5%二氧化碳条件下预平衡数小时。在此期间，从-80摄氏度冰箱中取出基底膜基质的冷冻分装样品，置于冷室中的冰上融化。每次转染时，准备一个六厘米培养皿，内含最多八片13毫米无菌盖玻片。

将培养皿置于覆盖有保鲜膜的冰盒上。为保持湿度，在一个15厘米的培养皿内放置一条湿润的组织纸，该培养皿用于承载最多三个含有嵌入膝部的成骨细胞的6厘米培养皿。接着，按1:3的比例将完全培养基加入haw基质中，将重新聚集的细胞团转移至15毫升离心管中，并在433 × g条件下离心5分钟。

随后，去除多余的培养基，并将沉淀重悬于 10 µL 完全培养基中。然后将 2 µL 细胞聚集体悬液滴加到每张无菌盖玻片上。加入 18 µL 基质完全培养基混合物，并用移液器吸头将基质均匀铺布至整个盖玻片表面。

将含有盖玻片的6厘米培养皿放入15厘米培养皿后立即进行滑动操作。将培养皿转移至37°C、含5%二氧化碳的培养箱中孵育15至20分钟。待基质凝固后，轻轻向每个6厘米培养皿中加入5毫升完全培养基，并用移液器吸头压下任何漂浮的盖玻片，随后在37°C、含5%碳氧混合气体（carbogen）条件下继续孵育24小时，以使神经母细胞从细胞聚集体中迁移出来。

在此图中，分离的大鼠 RMS 细胞显示对迁移性成神经细胞标志物 DCX 和 beta three tubulin 呈免疫阳性。此图显示迁移性成神经细胞标志物 DCX 和 PSA-NCA 在从小鼠 RMS 迁移出的细胞中表达。为观察小鼠成神经细胞的核转染情况，将分离的小鼠 RMS 成神经细胞用 GFP 进行核转染，重新聚集后嵌入三维基质中，并允许其迁移 6 小时。

从重新聚集的细胞簇中迁移出的神经母细胞显示出高转染效率。在此实验中，大鼠神经母细胞通过核转染导入两种编码GFP的不同质粒，随后重新聚集并包埋于基质中，培养24小时以允许细胞迁移。之后将细胞固定，并对GFP和βIII微管蛋白进行免疫染色，以测量细胞迁移距离。

将聚集的细胞簇分为六个相等的扇区，测量每个扇区中细胞簇边缘与最远迁移细胞之间的距离。该图显示了GFP阳性NUCLE受影响细胞与GFP阴性非NUCLE受影响对照细胞迁移的相对距离的定量结果，用于监测神经母细胞的迁移。在S-H-R-N-A Nucle感染后，大鼠神经母细胞被感染对照S-H-R-N-A载体，或含有HRNA靶向快速肌动蛋白束蛋白的相同载体，随后重新聚集48小时，包埋于基质中，并继续迁移24小时。

随后对聚集体进行固定，并对GFP和βIII微管蛋白进行免疫染色。通过Western印迹分析可在S-H-R-N-A慢病毒核转染后50小时检测到有效的FasTun蛋白耗竭，此处以Actin作为上样对照。图为相对迁移距离的定量分析，显示FasTun蛋白耗竭显著损害了神经母细胞的迁移能力。

在完成该操作后，可进行其他方法，如出生后电穿孔，以在体内验证通过NU核转染迁移实验获得的结果。