Name: 一个小鼠红细胞亚群富集去核活动由多光谱成像流式细胞仪鉴定 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: 了解利用多光谱成像流式细胞术鉴定小鼠红细胞亚群去核活动的方法。该技术可实时可视化去核过程，识别关键信号通路和细胞骨架成分，为研究红细胞生成机制提供可靠手段。

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作者感谢辛辛那提儿童医院研究基金会的研究流式细胞术核心实验室，以及来自EMD Millipore旗下Amnis公司的技术专家Richard Demarco、Sherree Friend和Scott Mordecai提供的专业技术支持。本研究由美国国立卫生研究院资助，基金编号为K08HL088126和R01HL116352（T.A.K.）以及P30 DK090971（Y.Z.）。

长期 体外 红细胞生成培养（离体 由Giarratana提供的红系分化培养方案 等8，为小鼠细胞改良与适配
这是一个三步长期方案 体外 红细胞生成方案。第一步（第0-4天）2 x 105 细胞/ml被置于添加了干细胞因子（SCF）、白细胞介素-3（IL-3）和促红细胞生成素（Epo）的成红细胞生长培养基中。在第二步（第5-6天），细胞被重悬于2 x 105 细胞/ml，并在仅添加Epo的新鲜成红细胞生长培养基中与贴壁基质细胞（MS5）共培养。第三步（第7-9天），将细胞接种于MS-5细胞层上，在不含细胞因子的新鲜成红细胞生长培养基中继续培养，直至脱核图1A).
所有动物实验方案均经辛辛那提儿童医院医疗中心机构动物照护与使用委员会（IACUC）批准。
<ol>
	<li>骨骼的采集与低密度骨髓细胞的分离
	<ol>
		<li>在15 ml锥形管中加入2 ml含2%胎牛血清（FBS）的无菌IMDM，并置于冰上保存。</li>
		<li>按照机构批准的方案，处死一只2-6月龄的野生型C57/BL6小鼠（可同时或不同时处死感兴趣的基因靶向小鼠）例如 CO2 吸入麻醉，随后进行颈椎脱位。</li>
		<li>使用镊子和手术刀分离骨盆骨、股骨和双侧胫骨，将其加入含有IMDM+2% FBS的离心管中，并置于冰上保存。</li>
		<li>在无菌流式细胞术管中加入1 ml IMDM+2% FBS，使用镊子和带有25 G针头的结核菌素注射器冲洗骨骼&#160;x 5/8&#34; 针头。用 IMDM+2% FBS 缓冲液轻轻冲洗骨骼数次（从细胞悬液中吸取约 500 µl，再通过骨骼冲洗），并将骨髓细胞收集至流式管中。当骨骼呈现白色时，表明冲洗完成。</li>
		<li>将细胞悬液通过置于50 ml锥形管顶部的40 μm细胞筛过滤。用IMDM+2% FBS洗涤细胞筛，并用相同培养基调节细胞悬液终体积至5&#160;毫升</li>
		<li>通过密度梯度离心法制备低密度骨髓细胞（LDBM）：小心地将5&#160;毫升&#160;将细胞悬液置于含5 ml密度梯度细胞分离介质（1.083 g/ml）的15 ml离心管中，于750 × g离心&#160;室温（RT）下25分钟，无刹车/低速加速。</li>
		<li>将上清液（保留至15 ml离心管中约2 ml刻度处，以获取血沉棕黄层）转移至新的15 ml离心管中，用IMDM+2% FBS在525 × g条件下再洗涤一次&#160;5 分钟&#160;室温</li>
		<li>吸弃上清液，将沉淀重悬于3 ml红细胞裂解缓冲液中，裂解残留的红细胞（RBC），室温孵育5分钟&#160;室温。如果在最后一步需要更高纯度的成红细胞（例如 （用于生化研究），在此步骤中进一步将 LDBM 细胞纯化为 Lin阴性 通过磁分离法分离细胞。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>离体 从LDBM或Lin细胞起始的红系分化培养方案阴性 细胞（图1A)
	<ol>
		<li>加入 7 ml IMDM+2% FBS，以 525 x g 离心&#160;5 分钟&#160;室温下将沉淀的细胞重悬于2 ml红系祖细胞生长培养基（EGM）中，该培养基成分为： 
		a. 含有 StemPro-34 培养基， 
		b. 2.6% StemPro-34 培养基添加剂， 
		c. 20% BIT-9500, 
		d. 900 ng/ml 硫酸亚铁， 
		e. 90 ng/ml 硝酸铁， 
		f. 100 单位/毫升青霉素/链霉素，2 mM L-谷氨酰胺 
		g. 10-6 M 氢化可的松 
		h. 并新鲜添加的细胞因子： 
		i) 100 ng/ml SCF， 
		ii) 5 ng/ml IL-3，以及 
		iii) 3 IU/ml Epo。</li>
		<li>使用自动细胞计数器或在显微镜下利用血细胞计数板进行手动计数。
		</li>
		<li>在6孔细胞培养板中以5 × 10⁵个/孔的浓度接种5 细胞/孔，用EGM补至终体积2.5 ml（2 × 10⁵）5 LDBM 细胞/ml），在 37 °C 培养（此为培养的第 0 天）。
		</li>
		<li>通过吸取1.5 ml上清液更换培养基，于525 × g离心&#160;5 分钟&#160;RT，在第2、3、4天每天将细胞重悬于1.5 ml含有全部3种细胞因子的新鲜培养基中，并将细胞重新接种回培养孔中，以优化增殖阶段。在第3天，收集全部细胞，计数后分种至适当数量的培养孔中，以维持培养孔中的细胞浓度约为2 × 105 细胞/ml。在37 °C、5% CO₂条件下培养。2.</li>
		<li>第4天，将MS5细胞（小鼠基质细胞系）接种至新的细胞培养6孔板的各孔中。MS5细胞培养基为含20%胎牛血清、100单位/毫升青霉素/链霉素和2 mM L-谷氨酰胺的α-MEM。</li>
		<li>第5天，使用自动细胞计数器或在显微镜下利用血细胞计数板手动计数原培养板中每个孔的细胞数量（此时细胞已显著富集为成红细胞）。</li>
		<li>从每个孔中收集全部细胞并转移至15 ml锥形管中，于525 × g离心&#160;5 分钟在&#160;室温下吸除上清液，用仅含促红细胞生成素（Epo，3 IU/ml）的新鲜内皮细胞生长培养基重悬沉淀，调整细胞浓度至 2 x 105 细胞/毫升</li>
		<li>吸弃前一日接种MS-5细胞（共培养时细胞融合度应达到70–80%）孔中的上清液，加入红系细胞，使用仅含Epo的EGM培养基（尽管非其最适培养基，MS-5细胞在EGM中仍可存活数天）。</li>
		<li>第6天更换培养基并加入新鲜EPO。</li>
		<li>第7天更换培养基，使用未添加细胞因子的EGM。在第7至9天，每天使用抗Ter119和Syto-16染色后，通过流式细胞术检测样品的去核情况，并继续进行多光谱成像流式细胞术染色（详见第3节）。 
		注意： 在铺板前以及培养的第2、4、6和7天，通过流式细胞术检测细胞表面标志物CD44和Ter119相对于细胞大小（FSC）的表达，以监测培养细胞中成红血球的富集与分化情况。9 也可使用 CD71、Ter119 和 FSC10,11.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 根据吉田等人et al.12描述并加以修改的快速去核实验（图1B）
<ol>
	<li>应激性红细胞生成诱导与基质细胞制备 体外 红细胞生成培养
	<ol>
		<li>按照IACUC指南对一只2-6个月大的野生型C57/BL6小鼠进行麻醉（例如 使用异氟烷溶液进行麻醉。通过轻捏后肢足垫以确认小鼠无反射性反应，并在操作过程中观察其呼吸是否规律，以确保麻醉充分。麻醉期间使用兽用眼膏涂抹眼睛，防止角膜干燥。</li>
		<li>通过尾部放血诱导应激性红细胞生成，放血终末体积为500 μl。使用胰岛素注射器向腹腔内注射等体积的生理盐水，以确保动物体液复苏（注射前将动物置于头低脚高位，并在下腹部注射，避免损伤内脏器官）。</li>
		<li>在小鼠恢复运动控制能力之前，不得将其单独留下；运动控制能力恢复的标志是动物开始在笼内活动，并能够站立和行走而不跌倒。采血后的小鼠应单独置于一个无其他小鼠的笼子中。</li>
		<li>2 天后，将 MS-5 细胞接种于 24 孔细胞培养板的孔中。在 37 °C、5% CO₂ 条件下培养 MS-5 细胞2 在MS5细胞培养基（含20% FBS、100单位/毫升青霉素/链霉素和2 mM L-谷氨酰胺的a-MEM）中培养，目标是在48小时后使培养板孔中的细胞融合度达到70–80%。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>脾脏的收获与脾细胞的制备
	<ol>
		<li>在诱导应激性红细胞生成四天（96 小时）后，按照 IACUC 批准的方案处死先前放血的小鼠（例如 CO2 吸入麻醉后颈椎脱位法</li>
		<li>取出脾脏并放入含有 IMDM 2% FBS 的 15 ml 锥形管中，置于冰上保存。</li>
		<li>回到实验室，在超净台内的无菌条件下，将含有脾脏的试管倒置在置于50 ml离心管上方的40 μm细胞筛网上。使用5 ml塑料注射器的推杆研磨脾脏。</li>
		<li>用含2% FBS的IMDM洗涤细胞筛，并用相同培养基将细胞悬液终体积调整至5 ml。</li>
		<li>将5 ml脾细胞悬液小心地铺在装有5 ml密度梯度细胞分离液（1.083 g/ml）的15 ml离心管中，于750 × g离心&#160;25 分钟&#160;无制动/低加速度的实时检测</li>
		<li>将上清液（溶液保留至15 ml离心管约2 ml刻度处，以获取血沉棕黄层）转移至新的15 ml离心管中，用IMDM+2% FBS在525 × g条件下再洗涤一次&#160;5 分钟&#160;室温</li>
		<li>吸弃上清液，加入3 ml红细胞裂解缓冲液重悬沉淀，室温裂解5 min&#160;室温</li>
		<li>加入7 ml IMDM+2% FBS以洗涤细胞，并稀释和中和红细胞裂解缓冲液，随后在525 × g离心&#160;5 分钟&#160;4 °C</li>
		<li>吸弃上清液，将沉淀的细胞重悬于2 ml红系祖细胞生长培养基（EGM）中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>分离的低密度脾细胞（富含成红细胞）在塑料培养皿上的培养（快速红系扩增的第一阶段） 体外 红细胞生成培养
	<ol>
		<li>使用自动细胞计数器或血细胞计数板手动计数细胞。此阶段每只脾脏通常可分离得到约 15 × 10⁶ 个细胞。6.</li>
		<li>在含有以下细胞因子（终浓度）的 EGM 培养基中进一步悬浮细胞：SCF 50 ng/ml、IL-3 5 ng/ml 和 Epo 2 U/ml。</li>
		<li>接种 1–5 × 106 在24孔细胞培养板中，每孔加入1 ml终体积的细胞悬液（根据细胞总数，每孔细胞数量相同），于37 °C、5% CO₂条件下过夜培养。2.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在MS5细胞上培养红细胞前体细胞（快速方案的第二阶段） 体外 红细胞生成培养
	<ol>
		<li>吸弃塑料孔中的上清液，加入 2 ml 液体以重悬细胞（富含成红血细胞）&#160;在冰上向每孔加入预冷的含10 mM EDTA的PBS溶液5分钟。</li>
		<li>将细胞转移至新的离心管中，用不含细胞因子的EGM洗涤一次，并用相同的培养基重悬。</li>
		<li>接种 5 x 105-1 × 106 向24孔板中每个包被有MS5细胞的孔加入1-2 ml细胞悬液。如果实验中使用药物抑制剂，此时应加入适当浓度的抑制剂。</li>
		<li>孵育6至8小时&#160;（时间由显微镜观察对照野生型样本中约30%–40%的脱核率确定）。成红细胞与MS-5细胞的结合可加速其脱核过程。</li>
		<li>用预冷的含 10 mM EDTA 的 PBS 2 ml 加入每孔，冰上孵育 5 分钟，使细胞脱落。此过程中除成红血细胞外，MS-5 细胞也会被一并收集，但在后续流式细胞术分析中可通过 FSC 参数轻松排除你好 Ter119- 细胞</li>
		<li>此时，细胞可进行固定并染色，用于多光谱成像流式细胞术分析。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 通过多光谱成像流式细胞术对红细胞生成过程中细胞内蛋白或脂筏定位的成红细胞染色&#160;
<ol>
	<li>用 PBS 洗涤细胞，525 × g 离心&#160;5 分钟&#160;室温下离心并吸除上清液。</li>
	<li>将细胞沉淀重悬于500 μl含3.7%多聚甲醛的PBS溶液中，室温固定15分钟（固定时间可根据待检测抗原的特性适当调整），期间轻柔吹打。</li>
	<li>转移至1.5 ml塑料离心管中，在15分钟内孵育&#160;室温</li>
	<li>在台式微量离心机中以 2,000 x g 离心&#160;20秒，吸去上清液，向每管中加入500 μl PBS，轻轻吹打，进行一次洗涤。</li>
	<li>在台式微量离心机中以 2,000 x g 离心&#160;20 秒，吸去上清液，将离心管置于冰上至少 15 分钟。透化步骤 3.6–3.9 应快速高效地进行，每次室温离心或抽吸后，细胞沉淀应立即放回冰上，以更好地保持细胞完整性。</li>
	<li>从 -20 °C 冰箱中取出丙酮溶液并置于冰上。先将细胞沉淀用 500 μl 冰冷的 50% 丙酮（与 dH₂O 1:1 配制）重悬，以透化细胞。2轻柔地用移液器吸取。</li>
	<li>在台式微量离心机中以 2,000 x g 离心&#160;20 秒，吸除上清液，并将细胞沉淀重悬于 500 μl 中&#160;冰冷的&#160;用移液器轻轻加入100%丙酮。</li>
	<li>在台式微量离心机中以 2,000 x g 离心&#160;20 秒，吸去上清液，再用 500 μl 重悬细胞沉淀&#160;冰冷的&#160;轻轻用移液器加入50%丙酮。</li>
	<li>在台式微量离心机中以2,000 x g离心&#160;20秒后，吸去上清液，用预冷的FACS缓冲液（PBS + 0.5% BSA）轻柔吹打洗涤细胞一次。</li>
	<li>制备标记混合液，用于目标分子的抗体或标记物染色：每100 μl中加入0.1 U AF488-鬼笔环肽（AF488-phalloidin）用于F-肌动蛋白染色，以及1 μl/100 μl Ter119-PECy7用于红系细胞染色。也可选用或额外进行以下染色：AF-488-抗β-微管蛋白抗体（1:50）、AF-594标记的霍乱毒素B亚基（1:200）用于脂筏标记、抗磷酸化肌球蛋白调节轻链（pMRLC，Ser19）一抗（1:50），随后使用AF-488标记的抗兔二抗（1:400）；以及抗γ-微管蛋白兔一抗（1:100），随后使用AF-555标记的抗兔二抗（1:300）。</li>
	<li>离心后弃去上清液，将细胞沉淀重悬于100 μl标记物混合液中，轻轻吹打混匀，于30分钟内孵育&#160;室温</li>
	<li>配制含有2.5 μM核染料Draq5的FACS缓冲液。</li>
	<li>用 FACS 缓冲液洗涤细胞，在台式微量离心机中以 2,000 × g 离心沉淀&#160;20 秒后，吸除上清液，并将沉淀重悬于 60 μl 含 Draq5 的 FACS 缓冲液中。</li>
	<li>在成像流式细胞仪上运行样本，每个实验至少收集10,000个事件，并对原始数据文件进行补偿，方法参照先前已发表的文献13,&#160;并按照所示方法分析结果 图2，使用成像流式细胞仪配套的分析软件。</li>
</ol>

<ol><li>McGrath, K. E., Kingsley, P. D., Koniski, A. D., Porter, R. L., Bushnell, T. P., Palis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enucleation+of+primitive+erythroid+cells+generates+a+transient+population+of+%26%2334%3Bpyrenocytes%26%2334%3B+in+the+mammalian+fetus%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Enucleation of primitive erythroid cells generates a transient population of &#34;pyrenocytes&#34; in the mammalian fetus.</a> Blood. 111, 2409-2417 (2008).</li>
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</ol>

作者声明无竞争性财务利益。

近年来，对红细胞前体脱核的研究日益受到关注&#160;因为这是步骤中的关键环节 体外 最难以高效复制的红细胞生成培养体系，以实现红细胞的大规模成功生产 离体.&#160;直到最近，红细胞前体脱核的研究主要采用荧光显微镜和流式细胞术方法。&#160;荧光显微镜技术尽管有助于鉴定参与的分子，但仍需要&#160;数天的显微镜观察，以鉴定在特定时间点固定的数百个细胞中正在进行脱核的少量嗜碱性晚幼红细胞。&#160;另一方面，流式细胞术在评估培养物中脱核速率以及特定分子的药理学或遗传学操控对该过程的影响方面非常有用，但无法提供这些分子细胞内定位的任何数据。
多光谱成像流式细胞术结合了流式细胞术和免疫荧光显微镜的优点，能够快速获取数千个细胞的流式细胞数据和形态学信息。&#160;在红细胞生成研究中，这一技术相较于传统流式细胞术具有显著优势，因为红系前体细胞分化各阶段（原红细胞、嗜碱性、多色性及正色性红细胞）的界定依赖于形态学标准6。然而，多光谱成像流式细胞术更适用于细胞结构的可视化，而在细胞群体数量的相对定量比较方面则存在局限。&#16...

哺乳动物红细胞谱系中的终末分化以显著的脱核过程告终，正染色性成红细胞在此过程中排出其被膜包裹的细胞核（即染色质小体）1，生成网织红细胞2该过程的确切机制，也是红细胞成功大规模生产中的限速步骤 体外，尚未完全阐明。在脱核红细胞前体中，关键蛋白质和结构的定位依赖于荧光显微镜和电子显微镜技术3-5这一繁琐的过程通常只能鉴定出有限数量的去核事件，且并不总能进行有意义的统计分析。在McGrath先前描述的红系前体细胞鉴定方法基础上进行拓展 等6我们开发了一种利用多光谱成像流式细胞术（一种结合荧光显微镜与流式细胞术的多参数高速细胞成像技术）来鉴定和研究去核事件的新方法7，可提供足够数量的观测值以进行测量并开展统计分析。
此处，我们首先描述前两个 体外 用于同步红细胞前体并提高在评估时捕获脱核事件概率的红细胞生成培养方法。随后，我们详细描述了红细胞前体在固定和透化后的染色步骤，以便通过多光谱成像流式细胞术研究脱核过程中细胞内蛋白质或脂筏的定位。
样本在成像流式细胞仪上运行，对收集的细胞进行适当的门控以鉴定正染色性成红细胞6。随后根据明场成像中测得的长宽比与“Ter119-DNA的X-Y中心偏移差”参数值之间的关系分析正染色性成红细胞，该参数定义为Ter119染色区域中心与DNA染色区域中心之间的距离。长宽比低且Ter119/DNA的X-Y中心偏移差值高的细胞群体中，正在脱核的细胞高度富集。&#160;通过比较野生型（WT）成红细胞与在Rac2-/-背景或Rac2-/-; Rac3-/-双敲除背景下经Mx-Cre介导条件性缺失Rac1的成红细胞，并结合这种新型的多光谱成像流式细胞术分析流程，我们近期证明了脱核过程类似于不对称胞质分裂，且由Rac GTP酶部分调控的肌动球蛋白环的形成对脱核进程至关重要7。

<table><tbody><tr><td>&amp;alpha;MEM 培养基</td><td>CellGro</td><td>15-012-CV</td><td></td></tr><tr><td>IMDM 培养基</td><td>Hyclone (Thermo Scientific)</td><td>SH30228.01</td><td></td></tr><tr><td>Stempro-34 无血清培养基（SFM）</td><td>GIBCO (Life Tech)</td><td>10640</td><td></td></tr><tr><td>Stempro-34 营养补充剂</td><td>GIBCO (Life Tech)</td><td>10641-025</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>512450</td><td></td></tr><tr><td>BIT9500</td><td>Stemcell Technologies</td><td>09500</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP-1600-100</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Hyclone (Thermo Scientific)</td><td>SH30028.02</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Hyclone (Thermo Scientific)</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Hyclone (Thermo Scientific)</td><td>SH30590.01</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷（Isoflurane）</td><td>Butler-Schein</td><td>029405</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque 1.083 mg/ml</td><td>Sigma</td><td>10831</td><td></td></tr><tr><td>BD Pharmlyse（红细胞裂解缓冲液）</td><td>BD Biosciences</td><td>555899</td><td></td></tr><tr><td>丙酮</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>534064</td><td></td></tr><tr><td>甲醛</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP 531-500</td><td></td></tr><tr><td>氢化可的松</td><td>Sigma</td><td>H4001</td><td></td></tr><tr><td>干细胞因子（SCF）</td><td>Peprotech</td><td>250-03</td><td></td></tr><tr><td>白细胞介素-3（IL-3）</td><td>Peprotech</td><td>213-13</td><td></td></tr><tr><td>EPOGEN Epoetin Alfa（促红细胞生成素，EPO）</td><td>AMGEN</td><td>药房可获取</td><td></td></tr><tr><td>CD44-FITC 抗体</td><td>BD Pharmingen</td><td>553133</td><td></td></tr><tr><td>CD71-FITC 抗体</td><td>BD Pharmingen</td><td>553266</td><td></td></tr><tr><td>Ter119-PECy7 抗体</td><td>BD Pharmingen</td><td>557853</td><td></td></tr><tr><td>鬼笔环肽-AF488</td><td>Invitrogen (Life Technologies)</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-微管蛋白-AF488 抗体</td><td>Cell Signaling</td><td>#3623</td><td></td></tr><tr><td>抗兔 AF488 二抗</td><td>Invitrogen (Life Technologies)</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>抗兔 AF555 二抗</td><td>Invitrogen (Life Technologies)</td><td>A21428</td><td></td></tr><tr><td>AF594-霍乱毒素 B 亚基</td><td>Invitrogen (Life Technologies)</td><td>C34777</td><td></td></tr><tr><td>pMRLC（Ser19）抗体</td><td>Cell Signaling</td><td>#3671</td><td></td></tr><tr><td>&amp;gamma;-微管蛋白抗体</td><td>Sigma</td><td>T-3559</td><td></td></tr><tr><td>Syto16</td><td>Invitrogen (Life Technologies)</td><td>S7578</td><td></td></tr><tr><td>Draq5</td><td>Biostatus</td><td>DR50200</td><td></td></tr><tr><td>硫酸亚铁</td><td>Sigma</td><td>F7002</td><td></td></tr><tr><td>硝酸铁</td><td>Sigma</td><td>F3002</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP120500</td><td></td></tr><tr><td>15 ml 离心管</td><td>BD Falcon</td><td>352099</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 离心管</td><td>BD Falcon</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>6 孔板</td><td>BD Falcon</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>24 孔板</td><td>BD Falcon</td><td>351147</td><td></td></tr><tr><td>流式管</td><td>BD Falcon</td><td>352008</td><td></td></tr><tr><td>结核菌素注射器</td><td>BD</td><td>309602</td><td></td></tr><tr><td>胰岛素注射器</td><td>BD</td><td>329461</td><td></td></tr><tr><td>25-G 5/8 注射针头</td><td>BD</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>带盖流式管</td><td>BD</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>40-&amp;mu;m 细胞筛</td><td>BD Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>手术刀（一次性）</td><td>Feather</td><td>2975#21</td><td></td></tr><tr><td>FACS Canto 流式细胞仪</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImagestreamX Mark II 成像流式细胞仪</td><td>AMNIS (EMD Millipore)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>图像数据探索与分析软件（IDEAS）4.0 及以上版本</td><td>AMNIS (EMD Millipore)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hemavet 950 细胞计数仪</td><td>Drew Scientific</td><td>CDC-9950-002</td><td></td></tr><tr><td>NAPCO 系列 8000WJ 培养箱</td><td>Thermo scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Allegra X-15R 离心机</td><td>Beckman Coulter</td><td>392932</td><td></td></tr><tr><td>Mini Mouse Bench 离心机</td><td>Denville</td><td>C0801</td><td></td></tr></tbody></table>

通过多光谱成像流式细胞术鉴定富含排核事件的小鼠成红细胞亚群

Identification of a Murine Erythroblast Subpopulation  Enriched in Enucleating Events by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

哺乳动物的红细胞生成以显著的脱核过程结束，最终形成网织红细胞。目前脱核的机制尚未完全阐明。在通过显微镜研究脱核成红细胞中关键蛋白和结构的定位时，常遇到的一个问题是难以观察到足够数量的正在脱核的细胞。&#160;我们开发了一种新的分析方案，利用流动中的多参数高速细胞成像技术（多光谱成像流式细胞术），该方法结合了免疫荧光显微镜与流式细胞术，能够高效地识别大量脱核事件，从而获取测量数据并进行统计分析。
我们首先在此描述两种 体外 用于同步小鼠成红细胞并提高在评估时捕获脱核事件概率的红细胞生成培养方法。&#160;然后，我们详细描述红细胞前体在固定和透化后的染色步骤，以便通过多光谱成像流式细胞术研究细胞核排出过程中细胞内蛋白质或脂筏的定位。&#160;除了用于鉴定正染色性成红细胞的细胞大小和DNA/Ter119染色外，我们还利用明场通道中的细胞“长宽比”参数，以帮助识别拉长的细胞；同时使用“Ter119/Draq5的XY质心偏移”参数，用于识别Ter119染色信号（新生网织红细胞）的中心与Draq5染色信号（正在脱核的细胞核）的中心相距较远的细胞事件，从而指示即将脱核的细胞。&#160;高delta重心值且低长宽比的正色性成红细胞亚群中，去核细胞高度富集。

首先，根据细胞的明场长宽比（短轴与长轴长度之比）和明场面积（反映细胞大小）对其进行分析。明场面积值低于20和高于200的事件分别主要为碎片和细胞聚集体，均被排除在分析之外。图2A）。随后根据单个细胞（门控“R1”）的梯度均方根（Gradient RMS）参数值进行分析，该参数反映图像的清晰度。设置门控“R2”，包含梯度均方根值高于50的细胞th 百分位数，以选择清晰对焦的图像（图2B）。然后根据细胞的明场面积（Brightfield Area）测量值对其大小进行设门，并结合通过Ter119荧光染色-平均像素强度（Mean Pixel）参数测定的红系标志物Ter119的阳性表达情况进行设门（设门标记为“Ter119阳性” 图2C）。Ter119 表达极低或极高的细胞分别为非红系细胞或残留的细胞聚集体，均在分析中予以排除。下一步，根据细胞的 Draq5 形状比强度（细胞核短轴与长轴荧光强度之比）和 Draq5 强度对细胞进行筛选。图 2D)。Draq5 阴性细胞（主要为去核细胞，如网织...

本方案描述了一种利用多光谱成像流式细胞术鉴定正在脱核的晚幼红细胞群体的新方法，可实现对红细胞脱核过程的可视化观察。

哺乳动物的红细胞生成在脱核这一显著过程中结束，最终形成网织红细胞。目前脱核的机制尚未完全阐明……

本实验的总体目标是促进在晚期红细胞亚群中识别去核事件。第一步是建立一个富含有核红细胞的细胞群体。这可以通过体外红细胞生成培养来实现，培养方式包括长期培养，即从非应激小鼠的股骨、胫骨和盆骨中分离出的低密度骨髓细胞开始培养，或短期培养。从先前接受过放血处理以诱导应激性红细胞生成的小鼠脾脏中分离出脾细胞。在培养的最后阶段，将培养的细胞进行固定、透化，并用目标荧光标记物染色。随后将这些细胞上机进行成像流式细胞术检测并分析，以鉴定正在脱核的细胞群体，进而识别调控和介导脱核过程的信号通路及细胞骨架组分。与现有方法（如荧光显微镜）相比，该技术的主要优势在于能够在短时间内观察和分析数量显著更多的成核细胞。该方法有助于回答红细胞生成领域中的关键科学问题，例如红细胞前体细胞成核过程中涉及哪些分子机制。为了从低密度骨髓细胞中分化红系细胞，首先向无菌流式细胞术管中加入一毫升培养基。然后，将一根25号、五分之八英寸长的针头连接到结核菌素注射器上，轻轻将新鲜培养基反复冲洗已收获的股骨和胫骨数次，冲洗液收集至流式细胞术管中。用IMDM培养基将细胞悬液调整至5毫升后，小心地将其叠加于15毫升离心管中预先加入的5毫升密度为1.083克/毫升的密度梯度细胞分离介质上。将下层液体转移至另一新的15毫升离心管中，直至液面降至2毫升刻度线处，收集白膜层，并用新鲜培养基洗涤。随后将细胞用3毫升红细胞裂解缓冲液在室温下裂解红细胞5分钟。洗涤细胞并用培养基重悬沉淀后，将细胞接种至6孔细胞培养板中，每孔细胞浓度为5 × 10⁵个细胞，终体积为2.5毫升生长培养基，于37°C孵育，接种后第五天进行培养。计数原始培养板中每个孔的成红血球细胞数量，然后将每个孔的细胞转移至相应的15毫升锥形管中。离心细胞后，吸除上清液，并将沉淀重悬于仅含促红细胞生成素的新鲜培养基中，细胞浓度为每毫升2 × 10⁵个细胞。随后吸除MS5细胞培养板中的上清液，并将红系细胞加入各孔中。两天后，将上清液更换为不含细胞因子的新鲜生长培养基，以培养来自低密度 PLE 细胞的成红细胞。使用5毫升注射器的推杆通过40微米细胞筛网将脾脏研磨至50毫升离心管中。用生长培养基清洗细胞筛网，并将细胞悬液的最终体积调整至5毫升。随后，按照上述方法通过密度梯度分离细胞层，裂解红细胞，并用7毫升培养基洗涤细胞。然后将细胞沉淀重悬于添加了细胞因子的生长培养基中，每孔以1×10⁶至5×10⁶个细胞、终体积1毫升的条件，接种于24孔细胞培养板中，于37°C、5%二氧化碳环境中过夜培养。次日。将细胞转移至先前已接种并贴壁的MS5细胞孔中，6至8小时后进行分析，从培养孔中收集成红血细胞，并加入500 µL含3.7%甲醛的PBS重悬，轻轻吹打使沉淀重悬。室温固定15分钟后，在微量离心机中以2000 ×g离心20秒，吸除上清液，再用500 µL PBS重悬细胞沉淀。再次在微量离心机中离心后，吸除上清液，将细胞置于冰上至少15分钟。将 -20 °C 保存的丙酮溶液置于冰上。随后，在 Fax 缓冲液洗涤后，按照指示进行一系列丙酮洗涤，迅速重悬细胞并离心。接着，将细胞沉淀在 100 µL 适当的抗体混合液中于室温孵育 30 分钟。再次用 Fax 缓冲液洗涤细胞后，将沉淀重悬于含 Drac Five 的 60 µL Fax 缓冲液中，并在成像流式细胞仪上运行样品，每个实验样品至少收集 10,000 个事件。然后通过选择细胞的明场长宽比（短轴与长轴长度之比）及其明场面积（反映细胞大小）来开始分析。明场面积值低于20和高于200的事件分别主要为碎片和细胞聚集体，应从分析中排除。随后根据单个细胞的梯度均方根（gradient RMS）参数值进行分析，该参数反映图像的清晰度；创建第二个门控，包含梯度均方根值大于第50百分位的细胞，以筛选出聚焦良好的图像。下一步门控基于细胞的大小（通过明场面积测量）以及红系标志物TER-119的阳性情况（通过TER-119荧光染色的平均像素参数测量）进行。TER-119信号极低或极高的细胞分别被视为非红系细胞或残留的细胞聚集体，将在下一步分析中被排除。随后根据DR5的长宽比强度（即细胞核短轴与长轴之比）以及DR5表达强度对细胞进行筛选。DR5阴性细胞主要为去核细胞，如网织红细胞和红细胞，以及DR5长宽比低的细胞。分析步态时通常排除双联体细胞。拖尾的五个DNA阳性细胞在此阶段主要为成红细胞。随后根据这些成红细胞的TER-19面积（反映细胞大小）以及TER-19平均像素面积或TER-19表达密度（反映TER-19染色的亮度）进行分析。正染色性成红细胞被识别为体积较小、TER19高表达的细胞。最后，正染色性成红细胞的一个亚群以其较低的明场长宽比和较高的delta sentu XY TUR19 DR5为特征，其中TUR19 DR5定义为：使用抗Her19抗体和DNA染料DRAQ5染色后，新生的TUR19阳性网织红细胞中心与DR5阳性细胞核中心之间的距离。通常还对细胞进行染色，以确定红细胞生成过程中F肌动蛋白的定位以及脱核情况。值得注意的是，脱核过程可以通过细胞的长宽比逐渐减小来观察，即细胞变得越来越细长，并且随着ΔOID xy TUR one 19 drag five的增加而被观察到。F肌动蛋白在核排出过程中的分裂沟处聚集，随后在细胞核被挤出后逐渐消散。其他感兴趣的蛋白质和结构也可通过相应的抗体或荧光标记进行染色，以观察其在去核过程中的作用。例如，在野生型正染色性成红细胞中，可在去核发生前观察到极性微管的形成，但在经秋水仙素处理的成红细胞中则无法观察到。秋水仙素通过抑制微管蛋白聚合，减弱细胞极化，这一点可通过测量明场通道中细胞体中心与DR5染色所得细胞核中心之间的delta OID XYB FDR5参数来证明。完成此步骤后，可进一步采用其他方法（如荧光显微镜）来研究参与红细胞生成的不同细胞类型之间的相互作用，例如在成红细胞岛中观察到的现象。观看本视频后，您应能够充分理解如何在富含成红细胞的群体中观察细胞核排出事件。

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科研

JoVE Journal

Biology

生物学

一个小鼠红细胞亚群富集去核活动由多光谱成像流式细胞仪鉴定

一种通过流式细胞术直接在新鲜分离的小鼠骨髓、脾脏或胎肝中鉴定和分析分化阶段特异性小鼠红系祖细胞和前体细胞的分子方法。该检测基于细胞表面标志物CD71、Ter119以及细胞大小。...

利用CD71/TER119流式细胞术检测鉴定与分析小鼠红系祖细胞

在分化中的胚胎干细胞（ESCs）中调控基因的时间特异性表达，可利用诱导型基因系统实现。然而，构建此类细胞系成本较高且耗时较长。本实验方案可实现外源基因在分化中的ES来源细胞中的快速表达，并进一步分析其下游的造血分化过程。...

逆转录病毒感染小鼠胚胎干细胞衍生的拟胚体细胞以分析造血分化

造血干细胞和祖细胞（HSPC）在发育过程中来源于特化的（生血性）内皮细胞，但关于部分内皮细胞如何特化为造血细胞的过程仍知之甚少。我们展示了一种基于流式细胞术的方法，可从鼠胚组织中同时分离生血性内皮细胞和HSPC。...

小鼠胚胎造血性内皮细胞的分离

尽管浸润性巨噬细胞持续从循环前体细胞招募至成体组织，但组织驻留巨噬细胞在发育过程中定植于组织，并在无前体细胞进一步输入的情况下长期维持。近期，组织驻留巨噬细胞的前体细胞已被鉴定。本文介绍了对组织驻留巨噬细胞前体细胞进行遗传谱系示踪的方法。...

通过流式细胞术鉴定小鼠胚胎中的红髓系祖细胞及其子代

本文介绍了光谱流式细胞术，这是一种流式细胞术的新方法，利用发射光谱的形状来区分荧光染料。该方法采用一种算法替代补偿，并可将自发荧光作为一个独立参数进行处理。这种新方法使得对从实体器官中分离的细胞进行准确分析成为可能。...

通过光谱流式细胞术分析从实体组织中分离的细胞悬液

本实验方案的目的是利用已描述的标记物鉴定肝脏内的淋巴管内皮细胞群体。我们采用胶原酶IV和DNase对组织进行轻柔剪切，并结合流式细胞术，以鉴定出一群独特的淋巴管内皮细胞。...

小鼠肝脏消化用于淋巴管内皮细胞的流式细胞术分析

体外微核试验是一种评估遗传毒性和细胞毒性的成熟方法，但使用手动显微镜计数该试验费时费力，且存在主观性及不同评分者之间的变异性。本文描述了一种利用多光谱成像流式细胞术实现该试验完全自动化的操作方案。...

一种利用多光谱成像流式细胞术进行体外微核试验的自动化方法

本文介绍了一种通过流式细胞术对小鼠腹膜、脾脏和骨髓组织中免疫B细胞区室异质性的简单分析方法。该方案可适用于并扩展至其他小鼠组织。...

小鼠B细胞发育的流式细胞术表征

本文介绍了一种简单的小鼠骨髓细胞分离与染色方案，用于表征造血干细胞和祖细胞，以及支持性微环境中的内皮细胞和间充质干细胞。方案中还包括一种富集位于骨内膜区和骨髓中央区域细胞的方法。...

小鼠骨髓造血干细胞与祖细胞及基质微环境细胞的流式细胞术分析

本文介绍一种新型的流式细胞术方法，可直接从新鲜的小鼠骨髓和脾脏中前瞻性分离早期红系爆式集落形成单位（BFU-e）和红系集落形成单位（CFU-e）前体细胞。该实验方案基于单细胞转录组数据开发，是首个能够以高纯度分离出全部组织中红系前体细胞的方法。...

通过流式细胞术从小鼠组织中鉴定与分离红系爆式形成单位和集落形成单位祖细胞

本文介绍了一种基于磁珠分离小鼠皮肤淋巴毛细血管内皮细胞的方法。所分离的淋巴内皮细胞可用于后续实验 体外 实验和蛋白质表达分析...

小鼠皮肤淋巴管内皮细胞的分离

了解利用多光谱成像流式细胞术鉴定小鼠红细胞亚群去核活动的方法。该技术可实时可视化去核过程，识别关键信号通路和细胞骨架成分，为研究红细胞生成机制提供可靠手段。

通过多光谱成像流式细胞术鉴定富含排核事件的小鼠成红细胞亚群

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