通过多光谱成像流式细胞术鉴定富含排核事件的小鼠成红细胞亚群

本实验的总体目标是促进识别有核红细胞亚群中的去核事件。第一步是建立一个富含核事件的细胞群体。这可以通过体外红细胞生成培养来实现，培养方式可采用长期培养，即从非应激小鼠的股骨、胫骨和盆骨中分离出的低密度骨髓细胞开始培养；也可采用短期培养。

从先前接受放血处理以诱导应激性红细胞生成的小鼠脾脏中分离出脾细胞。在培养的最后阶段，将培养的细胞进行固定、透化，并用感兴趣的荧光标记物染色。这些细胞随后上机进行成像流式细胞术分析，以鉴定正在脱核的细胞群体，进而识别调控和介导脱核过程的信号通路及细胞骨架组分。

与现有方法（如荧光显微镜）相比，该技术的主要优势在于能够在短时间内观察和分析数量显著更多的成核细胞。该方法有助于回答红细胞生成领域中的关键问题，例如红细胞前体细胞成核过程中涉及哪些分子机制。为了从低密度骨髓细胞中分化红系细胞，首先向无菌流式细胞术管中加入一毫升培养基。

然后将一根25号、5/8英寸长的针头连接到结核菌素注射器上，用新鲜的培养基轻轻冲洗已收获的股骨和胫骨数次，将冲洗液收集至流式细胞术管中。用IMDM培养基将细胞悬液调整至5毫升后，小心地将其铺加到15毫升离心管中预先加入的5毫升密度为1.083克/毫升的密度梯度细胞分离介质上。将下层液体转移至另一新的15毫升离心管中，直至液面降至2毫升刻度处，收集白膜层，并用新鲜培养基洗涤。在用培养基洗涤细胞并重悬沉淀后，将细胞以每孔5 × 10⁵个细胞的浓度接种于6孔细胞培养板中，每孔终体积为2.5毫升培养基，置于37°C培养。接种后第五天进行培养孵育。

计数原始培养板中每个孔的成红细胞数量，然后将各孔细胞分别转移至对应的15毫升锥形管中。离心细胞后，吸除上清液，并将沉淀重悬于仅含促红细胞生成素的新鲜生长培养基中，细胞浓度调整为每毫升2×10⁵个细胞。随后，吸除MS5细胞培养板中的上清液，将红系细胞加入各孔中。

两天后，将上清液更换为不含细胞因子的新鲜生长培养基，以培养来自低密度 PLE 细胞的成红血细胞。使用5毫升注射器的推杆通过40微米细胞筛网将脾脏研磨至50毫升离心管中。用生长培养基清洗细胞筛网，并将细胞悬液的最终体积调整至5毫升。

随后，按照上述方法通过密度梯度分离细胞层，裂解红细胞，并用7毫升培养基洗涤细胞。然后将细胞沉淀重悬于添加了细胞因子的生长培养基中，每孔最终体积为1毫升，按每孔1×10⁶至5×10⁶个细胞的密度接种于24孔细胞培养板中，在37°C、5%二氧化碳条件下过夜培养。次日。

将细胞转移至含有已贴壁的MS5细胞的孔中，如前所述进行培养，并在6至8小时后进行分析。从培养孔中收集成红血细胞，加入500 µL含3.7%多聚甲醛的PBS缓冲液重悬细胞沉淀，轻轻吹打混匀。室温固定15分钟后，在微型离心机中以2000 ×g离心20秒，吸除上清液，再用500 µL PBS重悬细胞沉淀。再次离心后，吸除上清液，将细胞置于冰上静置至少15分钟。

将保存在负20摄氏度的丙酮溶液置于冰上。随后，在Fax缓冲液洗涤后，按照指示通过一系列丙酮洗涤快速重悬细胞并离心收集细胞。接着，将细胞沉淀在100微升相应的抗体混合液中于室温孵育30分钟。再次用Fax缓冲液洗涤细胞后，将所得沉淀重悬于60微升含有Drac Five的Fax缓冲液中，并在成像流式细胞仪上运行样品，每个实验样品至少收集10,000个事件。

然后通过明场下的长宽比（短轴与长轴长度之比）以及明场面积（反映细胞大小）来选择细胞，从而开始分析。明场面积小于20和大于200的事件分别主要为碎片和细胞聚集体，应从分析中排除。接着根据单个细胞的梯度均方根（gradient RMS）参数值进行分析，该参数反映图像的清晰度；创建第二个门控，包含梯度均方根值高于第50百分位的细胞，以筛选出聚焦良好的图像。

下一步门控，根据细胞的明场面积所反映的细胞大小，以及通过 TER-119 荧光染色的平均像素参数所反映的红系标志物 TER-119 的阳性程度进行筛选。TER-119 信号极低或极高的细胞分别为非红系细胞或残留的细胞聚集体，在下一步分析中被排除。随后根据细胞的 DR5 形态比强度（即细胞核短轴与长轴之比）及其 DR5 表达强度进行细胞筛选。DR5 阴性细胞主要为去核细胞，例如网织红细胞和红细胞，以及 DR5 形态比较低的细胞。

分析步态时通常排除双联体。拖取五个DNA阳性细胞，这些细胞在此阶段主要是成红血细胞。随后根据这些成红血细胞的TER-19面积（反映细胞大小）以及TER-19平均像素面积或TER-19表达密度（反映TER-19染色的亮度）进行分析。

正染色性成红细胞被识别为体积较小、TER19高表达的细胞。最后，正染色性成红细胞的一个亚群以其较低的明场长宽比和较高的delta中心XY TUR19、DR5为特征，其中TUR19阳性网织红细胞中心与DR5阳性细胞核中心之间的距离通过抗HER19抗体及DNA染料DRAAK5进行定义。

通常还对细胞进行染色，以确定红细胞生成过程中 F 肌动蛋白的定位以及脱核现象。值得注意的是，脱核过程的进展可通过细胞的长宽比逐渐减小来观察，即细胞变得越来越细长，并且随着 delta OID xy TUR 19 拖拽 5 的增加而被观察到。

F-肌动蛋白在核排出过程中的收缩环处富集，待细胞核排出后即消散。其他感兴趣的蛋白质和结构也可通过相应的抗体或荧光标记进行染色，以观察其在去核过程中的作用。例如，在野生型正染色嗜碱性成红细胞中，可在去核前观察到极性微管的形成，但在经秋水仙素处理的成红细胞中则无法观察到。

秋水仙素通过抑制微管蛋白聚合，减弱细胞极化，这一点可通过测量明场通道中细胞体中心与DR5染色所得细胞核中心之间的delta OID XYB FDR5参数来证明。在此步骤之后，可采用其他方法（如荧光显微镜）进一步探究参与红细胞生成的不同细胞类型之间的相互作用，例如在成红细胞岛中观察到的现象。观看本视频后，您应能够充分理解如何在富含成红细胞的群体中观察细胞核排出事件。