从食虫植物组织中分离具有活性的多细胞腺体 猪笼草

本方法的目的是从新鲜植物组织中获取单一且纯净的腺体，用于分子分析。首先从猪笼草植物上采集一个捕虫笼，随后立即将组织固定在冰上的微型取样平台上，以保持组织的新鲜状态。

在微量取样过程中，以精确方式分离腺体，并将其转移至PCR管中，随后对采集的材料进行定量PCR分析。最终，利用机械式微量取样技术，从猪笼草植物中获取单一且纯净的腺体，从而快速、微创地为后续分子分析提供特定组织。食虫植物在植物界中属于特化类群，因其能够消化动物蛋白。

我们对这一过程在分子层面的作用机制仍知之甚少。一个研究该问题的良好模型是天才阑尾的图像融合，因为它具有结构分明的器官和产生腺体的图像，这些腺体参与消化过程。在阑尾中。

这些腺体位于底部图片的内部。为了进行分子分析，有必要直接从新鲜组织中分离出这些宽而扁平的结构，其直径约为 100 至 200 微米。更为困难的是，这些腺体被一个保护性的罩状结构所覆盖。

由于该结构类似于车棚，需要在取样过程中进行三维观察，同时还需要一种能够以精细方式在三维空间中移动的工具。我们发现，现有的显微解剖技术并不适用于解决我们的问题。例如，激光因植物组织含水量过高而失败。

因此，我们决定采用一种名为aika的新型机械显微解剖技术，用于分离三维结构中的组织部分甚至单个细胞。该技术包含一台体视或立体显微镜，其中集成有三维显微操作器，其结构设计可轻松触及非常扁平或非常高耸的物体。显微镜可连同作为支柱的装置一同移动，以对样品进行操作。在植物样本上，我们经常使用微毛细管。

然而，对于阑尾玻璃样本，我们发现由PTO驱动的微型镊子在我们的操作中更为有效。针对阑尾样本，平台已进行了改进。稍小的VXY载物台用于支撑一个盛有冰的容器，该容器足够大，可同时容纳组织样本及其支架，以及将要放置腺体的位置。

冰能确保组织内的梯度过程被极大减缓，从而有可能识别出组织的原始分子状态。以下操作步骤源自图像的下部区域：切下一枚约一至二平方厘米的组织片，随后将其展平。

然后使用双面胶带将组织固定在载玻片上。该组织样本用无RNA酶的水覆盖，并在取样过程中保持湿润。随后将样本放置妥当，使腺体及其保护罩朝向操作者一侧。

需要调整样品与工具之间的角度，使腺体平放。使用万能台时，可在两个轴向上调节倾斜度，并可在显微镜下轻松校正。金属台可使样品在显微镜下保持低温。

腺体界限清晰。荧光有助于轻松识别腺体及其保护罩的轮廓。通过FSE滤光片观察样品以分离腺体。

进行RNA提取时，需使用紫外滤光片。显微镊子的精确定位对于腺体分离至关重要。建议在低速模式下操作工具。

使用显微镊子，通过操纵杆将镊臂置于腺体边缘，轻柔闭合显微镊。随后将腺体从周围组织中抬起。在精确分离后，可观察到完整的腺体腔，其下方为血管组织。

随后将分离的腺体转移至PCR管中，并放入已准备好的缓冲液内。为验证该方法，检测了分泌到液体中的原子腿蛋白短型（TAP）的基因表达，该基因可直接从腺体中扩增，无需预先提取基因组DNA，只需将PCR反应混合物加入分离的组织中即可。

该系列实验涉及经不同处理的猪笼草植株的腺体，以及来自其周围表皮组织的样品。每次实验均提取总RNA。所获得的mRNA通过逆转录转化为相应的cDNA，并用于后续的PCR反应。

为了扩增目的基因序列，采用实时PCR比较了猪笼草属（nepenthes）腺体和表皮组织中TLP的表达水平。结果显示，在猪笼草属的allotta和miis两个物种中，与表皮组织相比，分泌腺中的TLP转录水平更高，这通过表皮组织与腺体组织比值小于一得以可视化。为检测猎物接触是否可诱导基因表达，比较了捕获猎物后TLP的转录水平以及未经处理的图片与喂食黑腹果蝇（drosophila melanogaster）后的图片。

表皮组织在此处表现出较高的TLP表达。比较了猪笼草miis的腺体和表皮组织中TLP转录水平及其处理后的图片。两种组织中TLP表达的上调表明，捕虫笼液蛋白的产生确实可由猎物诱导。

PCR 结果表明，进食能有效改变两种组织类型中 TLP 的表达，并可改变腺体与表皮之间表达水平的比例。我们建立了一种高效的方法，用于从阑尾 FA 组织中收集清洁样本，并分离出足量的 mRNA 以开展基因表达实验。借助这一新方法，不仅能够研究阑尾腺体的转录组学，还能够进一步开展代谢组学以及蛋白质组学研究。