Name: 评估肌反应及血管活性阻力肠系膜动脉使用压力肌动描记 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 48 s
Description: 学习使用压力肌动描记技术评估大鼠肠系膜小动脉的血管活性反应。该方法通过插管、加压和孵育步骤，测量压力诱导的血管收缩，为研究血管功能和心血管疾病机制提供可靠的实验方案。

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Sandeep Khurana 获得美国国立卫生研究院（NIH）（项目编号：K08DKO81479）的支持。Vikrant Rachakonda 获得（项目编号：T32DK067872）的支持。

此处所示示例来自佐治亚州立大学动物护理与使用委员会（IACUC）批准的实验——方案编号：# 2011-0408
1. 试剂的准备
<ol>
	<li>配制解剖液母液：配制500 ml 5倍浓缩的解剖液母液，溶解21.18 g NaCl、0.875 g KCl、0.739 g MgSO₄·7H₂O、1.361 g NaH₂PO₄·H₂O、1.55 g NaHCO₃、1.8 g葡萄糖和0.5 g牛血清白蛋白（BSA）于去离子水中，用去离子水定容至500 ml。使用前用去离子水稀释至1倍工作浓度。4，将1.049 g MOPS和0.019 g EDTA溶于450 ml Milli-Q水中，用1 N NaOH调节pH至7.3–7.4，再用Milli-Q水定容至500 ml。该贮存液可保存7–10天。参见 表1 有关化学品及其供应商的列表，请参见 表2 用于表示浓度单位为 mM。</li>
	<li>配制工作用解剖液：每天新鲜配制工作用解剖液。配制100 ml工作液时，溶解0.091 g葡萄糖、0.016 g NaH2PO4 以及0.022 g丙酮酸钠溶于79.8 ml Milli-Q水中。加入0.2 ml 1 M CaCl₂。2 加入20 ml解剖液原液以定容至100 ml。</li>
	<li>制备生理盐溶液（PSS）：配制1,000 ml PSS，需溶解0.365 g KCl、6.545 g NaCl、0.296 g MgSO₄·7H₂O、0.166 g KH₂PO₄、2.100 g NaHCO₃、5.500 g葡萄糖和0.024 g EDTA于蒸馏水中，用NaOH将pH调节至7.4。4，0.163 g KH2PO4，2.072 g 葡萄糖，2.184 g NaHCO₃3 以及 2.383 g HEPES 溶于 950 ml 去离子水。使用 1 N NaOH 调节 pH 至 7.3–7.4。用去离子水定容至 1,000 ml。取出 2 ml 溶液，替换为 2 ml 1 M CaCl₂。2（新鲜的PSS需每日配制）</li>
	<li>制备钙（Ca2+) 无钙PSS（free PSS）：配制100 ml不含Ca的PSS2+，溶解 0.036 g KCl、0.654 g NaCl、0.029 g MgSO₄4，0.016 g KH2PO4，0.207 g 葡萄糖，0.218 g NaHCO₃3，0.238 g HEPES，0.015 g EGTA 和 0.0026 g 亚硝普钠（SNP）溶于 95 ml Milli-Q 水中。用 1 N NaOH 调节 pH 至 7.3–7.4，再用 Milli-Q 水定容至 100 ml。</li>
</ol>
2. 玻璃毛细管的制备
<ol>
	<li>使用拉针仪按照制造商的说明拉制玻璃移液管，制备尖端直径为 100–150 μm 的套管。</li>
	<li>使用微电极斜面仪对玻璃套管尖端进行斜面处理，进行火焰抛光，并使用加热探针将玻璃套管尖端弯曲约 45°。</li>
	<li>将套管装入微移液管持留器中，并将微移液管持留器安装到灌流室上。</li>
</ol>
3. 灌注室的制备
<ol>
	<li>用 Milli-Q 水冲洗灌流室，每次 5 分钟，随后用解剖液再冲洗 5 分钟。向灌流室中加入 2 ml 解剖液。</li>
	<li>使用 10 ml 注射器通过套管抽吸解剖液，并小心地将整个套管及其连接的管路完全充满液体，避免产生气泡。轻柔抽吸以防止气泡生成。</li>
	<li>使用钝头镊子制备两个带有半结的缝线。由于使用的眼科单丝尼龙缝线（10-0，0.2 公制）所打结的结直径仅为 1–2 mm，可能需要使用解剖显微镜辅助操作。</li>
	<li>在解剖显微镜下观察，用解剖镊将部分闭合的缝线结装载到两个套管上，位置略远离管尖。后续将这些结小心滑至套管插管的动脉末端并完全收紧结扎。</li>
</ol>
4. 采集Sprague-Dawley大鼠肠系膜动脉弓
<ol>
	<li>在开展这些实验之前，须获得当地机构动物护理与使用委员会（IACUC）的批准。将动物饲养在温度和光照受控的动物设施中，并提供自由饮水和商业啮齿类动物饲料。</li>
	<li>通过腹腔注射氯胺酮（80 mg/kg）和赛拉嗪（10 mg/kg）对大鼠进行麻醉。通过夹趾反应确认深度麻醉状态，必要时追加麻醉剂。</li>
	<li>在确认手术麻醉成功后，通过断头法处死动物。动物安乐死应遵循AAALAC指南中规定的方法。</li>
	<li>使用解剖剪和镊子从骨盆至胸骨沿中线进行剖腹手术。该操作分为两个步骤：首先切开皮肤，然后切开下方的肌肉层。操作时需小心，避免损伤腹腔内器官。</li>
	<li>在靠近幽门处切断近端小肠，在靠近回盲部处切断远端小肠。分别结扎两端，以防止食糜和粪便泄漏，避免污染细胞外灌流液。在肠系膜根部靠近供血血管处切开肠系膜。 即，肠系膜上动脉，并将整个小肠肠系膜床转移至含有冰冷解剖液的50 ml烧杯中。</li>
	<li>将收获的组织在冰上冷的解剖液中放置5分钟，并用新鲜的解剖液冲洗以去除血液。</li>
</ol>
5. 4号血管的分离与插管th 肠系膜动脉
<ol>
	<li>将肠管近端固定在右侧涂有硅胶的培养皿中。将剩余肠管沿逆时针方向延展，分段固定以展开肠系膜，暴露血管图1）。注意：我们在室温下分离动脉节段。否则，将含有肠系膜弓的培养皿置于冰上。包括我们机构在内的部分实验室使用冷藏装置在低温下解剖动脉 4 °C.</li>
	<li>在体视变倍显微镜下解剖出3rd 和 4th 小肠系膜动脉（约260 μm）使用小剪刀沿小肠平行方向进行解剖。首先剥离所有覆盖的脂肪组织，随后分离静脉并游离带有V形分支点的动脉。注意避免穿刺所选血管段。从目标节段附近的脂肪组织开始解剖nd 分枝排序并找到通往3的路径rd 或 4th 订购容器。
	<ol>
		<li>注意：动脉和静脉可根据其管壁厚度进行区分——动脉管壁比静脉厚。此外，当轻柔地沿垂直于血管的方向牵拉邻近结缔组织时，静脉易于塌陷，而动脉则不易塌陷。由于管腔直径较小的动脉 &lt;400 μm 是全身血管阻力的主要部位，本方案中我们使用了4个th 二级大鼠肠系膜动脉（管腔直径 &lt;300 μm).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>平行于小肠分离一段 4-5 mm 的动脉。观察所有 5th 将嵌入小肠的分支血管按顺序切断，切点略远离分支起始处，并保留一部分血管段。这些保留的血管段可作为持夹部位（使用解剖镊），用于将动脉节段转移至灌流室，并在后续操作中引导其插管。</li>
	<li>然后在距离5远端处做两个切口，切断动脉节段th 动脉两侧的分支按顺序排列并转移至灌注室（参见 图1C 和图注）。</li>
	<li>将血管的一端套在玻璃微移液管（直径：100-150 μm使用解剖镊夹住动脉节段的末端。将预先穿入且部分闭合的缝合线滑至插管端并固定。注意：可将动脉近端插至与伺服控制压力调节装置相连的玻璃插管上，以模拟 原位 环境</li>
	<li>将装有10 ml分离溶液的注射器连接到与该套管相连的旋塞阀上，使连接套管与旋塞阀的管路中的分离溶液与注射器内的溶液相融合。轻轻抬高注射器，溶液所受重力将使血管内血液从血管开放端排出。排尽动脉内血液后，关闭旋塞阀。 
	注意：或者，可将止水夹连接至压力控制器，打开开关并缓慢将压力增加至5-10 mm Hg，以达到相同效果。</li>
	<li>将血管远端绑在第二根玻璃套管上，操作时需小心地将另一根套管尽可能靠近动脉节段未打结的一端。将先前已穿好且部分闭合的缝线滑至套管插入的末端并固定。务必注意不要牵拉或用力拉扯动脉节段。确保连接在两根套管上的旋塞阀均处于关闭状态。</li>
	<li>将灌流室转移至配备活细胞视频记录系统的倒置显微镜载物台上。</li>
	<li>将连接在动脉节段近端套管上的三通阀连接至伺服控制的压力调节装置，并确保另一套管上连接的三通阀保持关闭，以维持稳定的管腔内压力。</li>
	<li>接下来，将真空管路连接至腔室的吸液口，将灌流管路连接至灌流口。 
	注意：斜面针口用于吸液，钝头针口用于灌注。</li>
	<li>通过单个串联式溶液加热器，开始用温热的PSS灌注血管37 °C，用含5% CO₂的气体混合物平衡2，5% O₂2 并维持90%的氮气以保持中性pH值和充足的氧合17使用蠕动泵以 2 ml/min 的流速进行操作，同时开启真空。将热敏电阻置于腔室内以持续监测温度。</li>
	<li>当腔室内PSS的温度接近~37 °C （通常在5分钟内）缓慢将管腔内压力从20 mmHg升至100 mmHg，并检查血管是否有渗漏。此步骤通过压力调节器的自动压力设置完成。若血管出现渗漏，应予以弃用，并更换另一段血管。有渗漏的血管无法维持设定压力。</li>
	<li>在维持压力为100 mmHg的同时，评估动脉节段是否存在弯曲。使用螺旋杠杆移动套管，以拉直动脉节段。切勿过度拉伸动脉节段；目标是模拟 体内 动脉节段长度</li>
	<li>将压力降低至70 mmHg（以模拟 体内 肠系膜弓内的压力18）并使动脉节段稳定并形成肌源性张力。可根据实验设计和血管床的不同，将动脉加压至不同压力水平（40–70 mmHg）。一篇已发表的综述对来自不同血管床的动脉节段中肌源性张力的差异性提供了详尽的评述。8.</li>
</ol>
6. 动脉直径的测量
<ol>
	<li>在配备黑白视频电荷耦合器件相机的显微镜下，使用10倍物镜观察动脉。利用视频帧采集器和实时边缘检测系统测量管腔直径。所用设备列表如下： 表3.</li>
	<li>持续监测并记录血管直径。</li>
	<li>观察肌源性张力（MT）的形成。注意：我们观察到，在70 mmHg压力下，大鼠肠系膜阻力动脉中MT的形成表现为管径减少约20%。MT因血管床和动物种类不同而有所差异。</li>
	<li>通过评估血管对缩血管和舒血管刺激的反应来确认血管活性 1 μM 去氧肾上腺素（Phe）和 1 μM 乙酰胆碱（ACh）</li>
	<li>每次实验结束时，通过将动脉在无钙溶液中孵育以测定被动直径（PD）2+-free PSS 孵育 20 分钟。</li>
</ol>
7. 血管肌源性反应
<ol>
	<li>将压力降低至20 mm Hg，使血管直径稳定。以逐步递增的方式提高管腔内压力（20、40、60、80 和 100 mm Hg），在每个压力水平下均等待动脉直径达到稳定状态（通常在5分钟内）。</li>
	<li>将管腔内压力降低至20 mmHg，并在含Ca2+含 0.39 mM EGTA 和 0.1 mM SNP 的无钙PSS。使动脉直径稳定（通常为15分钟）。</li>
	<li>重复在 Ca 中的压力阶跃反应2+含 0.39 mM EGTA 和 0.1 mM SNP 的无钙 PSS 溶液</li>
</ol>
8. 结果解读与数据计算
<ol>
	<li>根据以下计算公式，计算在每个压力下含 Ca2+ 与无 Ca2+ PSS 中观察到的血管直径变化百分比，以确定机械张力（MT）： 
	<img alt="静态平衡公式，动脉直径变化分析，比值计算，方程，研究数据" fo:src="/files/ftp_upload/50997/50997eq1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50997/50997eq1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="方程 1"></li>
	<li>对于发生血管运动的动脉，可通过取1分钟平台期的平均值来计算其直径。根据以下关系式将采集的数据表示为最大舒张的百分比（%PD）：%PD = 100 × [ΔD/PD]；其中 ΔD 为加入任何待研究化合物（e.g. Phe）前后直径的差值；PD 为被动直径（即最大直径）。</li>
</ol>

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</ol>

作者无经济利益冲突。

关键步骤、故障排除与改进方法
在典型的等压血管制备过程中，将动脉置于两根玻璃微管之间，并用温暖的（37 °C）生理盐溶液（PSS）灌流，加压至70 mmHg。经过30–45分钟后，动脉会发展出肌源性张力（MT），表现为管径自发性减小，并在20–30分钟内趋于稳定。来自不同血管床的阻力动脉所发展的MT程度各不相同。例如，大鼠肠系膜阻力动脉的MT约为最大管径（PD）的25%，而提睾肌动脉的MT可达PD的约40%。若动脉在60分钟内未能形成MT，则应予以弃用；该时间阈值可能因血管床和物种不同而有所变化。对苯肾上腺素（Phe）和乙酰胆碱（ACh）反应不足的动脉也应弃用。
PSS 的 pH 值和温度对肌源性张力（MT）的形成具有显著影响。PSS 若长时间未充气，其 pH 值可能升高。此外，在室温下血管通常难以形成肌源性张力。因此，应尽快使用方案部分所述的气体混合物对 PSS 进行充气，并持续监测灌流腔室的温度，利用流体加热器将其维持在约 37 °C。
由于这些实验持续3-5小时，灌流室及...

小阻力动脉是系统性血管阻力（SVR）的主要决定因素，在多种疾病的病理生理过程中发挥重要作用1,2。糖尿病3、妊娠4、缺血-再灌注5、肥胖和高血压6,7等状态常伴有微血管功能的改变。血管肌张力测定不仅可深入揭示各种疾病中微血管功能的变化，还有助于识别治疗靶点并评估血管活性化合物的疗效。血管功能的研究可通过在等长或等压条件下离体培养的小动脉进行8。等长肌张力测定的详细描述见其他文献9。然而，等长与等压制备所获得的数据存在差异10-12。由于加压动脉制备可在接近生理条件下研究微血管功能，所得结果可能更贴近血管床的体内行为8,13。
1902年，Bayliss首次描述了跨壁压对血管直径的影响14。他观察到，在来自兔、猫和狗不同血管床的小阻力动脉中，压力降低会引起血管舒张，而压力升高则会引起血管收缩。这一现象被称为肌源性反应。Bayliss及后续研究者发现，在等压条件下，小阻力动脉会产生持续性收缩，称为肌源性张力（MT）15,16。肌源性反应和MT均可通过压力肌张力测定法（PM）进行评估。PM主要用于测定小动脉、静脉及其他血管的血管活性。除了评估血管活性化合物对血管直径的影响外，PM顾名思义还可用于评估血管内压力介导的血管直径变化。在过去的几十年中，计算机软件的进步提升了视频显微技术和玻璃微管拉制技术，使PM操作变得更加简便。然而，分离出可存活的完整小血管段仍然繁琐且有时具有挑战性。本文中，我们概述了一种详细的操作方案，用于研究从大鼠分离的小肠系膜阻力动脉中的肌源性反应。

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;化学&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>乙酰胆碱</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A6625</td><td></td></tr><tr><td>氯化钙（CaCl₂）&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>223506</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-葡萄糖</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G5767</td><td></td></tr><tr><td>乙二醇双(2-氨基乙基醚)-N,N,N&amp;rsquo;，N&amp;rsquo;四乙酸（EGTA）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸（EDTA）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E9884</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3784</td><td></td></tr><tr><td>硫酸镁（MgSO₄）&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M5162</td><td></td></tr><tr><td>去氧肾上腺素</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6126</td><td></td></tr><tr><td>氯化钾（KCl）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>磷酸氢二钾（KH₂PO₄）&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢钠（NaHCO₃）&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt; )</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠（NaCl）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钠（NaOH）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5881</td><td></td></tr><tr><td>硝普钠</td><td>Sigma Aldrich</td><td>13451</td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢钠一水合物（NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>丙酮酸钠</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8574</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;表1.&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;表格 边框=&quot;1&quot;&gt; &lt;tbody&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;&lt;strong&gt;生理盐溶液（1,000 ml）&lt;/strong&gt;&lt;/td&gt; &lt;td&gt;&lt;strong&gt; mM&lt;/strong&gt;&lt;/td&gt; &lt;td&gt;&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;KCl&lt;/td&gt; &lt;td&gt;4.9&lt;/td&gt; &lt;td&gt;0.365 g&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;NaCl&lt;/td&gt; &lt;td&gt;112&lt;/td&gt; &lt;td&gt;6.545 g&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;MgSO₄&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;.7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;/td&gt; &lt;td&gt;1.2&lt;/td&gt; &lt;td&gt;0.296 g&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&lt;/td&gt; &lt;td&gt;1.2&lt;/td&gt; &lt;td&gt;0.163 g&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;葡萄糖&lt;/td&gt; &lt;td&gt;11.5&lt;/td&gt; &lt;td&gt;2.072 g&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;NaHCO₃&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;&lt;/td&gt; &lt;td&gt;26&lt;/td&gt; &lt;td&gt;2.184 g&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;HEPES&lt;/td&gt; &lt;td&gt;10&lt;/td&gt; &lt;td&gt;2.383 g&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&lt;/td&gt; &lt;td&gt;2&lt;/td&gt; &lt;td&gt;2 ml（1 M 原液）&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;去离子水&lt;/td&gt; &lt;td&gt;&lt;/td&gt; &lt;td&gt;998 ml&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;&lt;strong&gt;钙&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; 自由生理盐溶液（100 ml）&lt;/strong&gt;&lt;/td&gt; &lt;td&gt;&lt;strong&gt; mM&lt;/strong&gt;&lt;/td&gt; &lt;td&gt;&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;KCl&lt;/td&gt; &lt;td&gt;4.9&lt;/td&gt; &lt;td&gt;0.036 g&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;NaCl&lt;/td&gt; &lt;td&gt;112&lt;/td&gt; &lt;td&gt;0.645 g&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;MgSO₄&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;.7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;/td&gt; &lt;td&gt;1.2&lt;/td&gt; &lt;td&gt;0.029 g&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&lt;/td&gt; &lt;td&gt;1.2&lt;/td&gt; &lt;td&gt;0.016 g&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;葡萄糖&lt;/td&gt; &lt;td&gt;11.5&lt;/td&gt; &lt;td&gt;0.207 g&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;NaHCO₃&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;&lt;/td&gt; &lt;td&gt;26&lt;/td&gt; &lt;td&gt;0.218 g&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;HEPES&lt;/td&gt; &lt;td&gt;10&lt;/td&gt; &lt;td&gt;0.238 g&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;EGTA &lt;/td&gt; &lt;td&gt;0.39&lt;/td&gt; &lt;td&gt;0.015 g&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;硝普钠 &lt;/td&gt; &lt;td&gt;0.1&lt;/td&gt; &lt;td&gt;0.0026 g&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;去离子水&lt;/td&gt; &lt;td&gt;&lt;/td&gt; &lt;td&gt;100 ml&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;&lt;strong&gt;解剖液，储备液（500 ml）&lt;/strong&gt;&lt;/td&gt; &lt;td&gt;&lt;strong&gt; mM&lt;/strong&gt;&lt;/td&gt; &lt;td&gt;&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;NaCl&lt;/td&gt; &lt;td&gt;145&lt;/td&gt; &lt;td&gt;21.18 g&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;KCl&lt;/td&gt; &lt;td&gt;4.7&lt;/td&gt; &lt;td&gt;0.875 g&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;MgSO₄&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&lt;/td&gt; &lt;td&gt;1.2&lt;/td&gt; &lt;td&gt;0.739 g&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;MOPS&lt;/td&gt; &lt;td&gt;2&lt;/td&gt; &lt;td&gt;1.049 g&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;EDTA&lt;/td&gt; &lt;td&gt;0.02&lt;/td&gt; &lt;td&gt;0.019 g&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;去离子水&lt;/td&gt; &lt;td&gt;&lt;/td&gt; &lt;td&gt;500 ml&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;&lt;strong&gt;工作解剖液（100 ml）&lt;/strong&gt;&lt;/td&gt; &lt;td&gt;&lt;strong&gt; mM&lt;/strong&gt;&lt;/td&gt; &lt;td&gt;&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;解剖液原液&lt;/td&gt; &lt;td&gt;20 ml&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;葡萄糖&lt;/td&gt; &lt;td&gt;1.2&lt;/td&gt; &lt;td&gt;0.091 g&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&lt;/td&gt; &lt;td&gt;5&lt;/td&gt; &lt;td&gt;0.016 g&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;丙酮酸钠&lt;/td&gt; &lt;td&gt;2&lt;/td&gt; &lt;td&gt;0.022 g&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&lt;/td&gt; &lt;td&gt;2&lt;/td&gt; &lt;td&gt;0.2 ml（1 M 储液）&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;去离子水&lt;/td&gt; &lt;td&gt;&lt;/td&gt; &lt;td&gt;79.8 ml&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;/tbody&gt; &lt;/table&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;表2.&lt;/strong&gt; 实验溶液的组成</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;设备&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>CCD 黑白相机</td><td>成像源</td><td>DMK 21AU04</td><td></td></tr><tr><td>单通道 inline 溶液加热器</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0102</td><td></td></tr><tr><td>热敏电阻器</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0108</td><td></td></tr><tr><td>双自动温度控制器</td><td>Warner Instruments</td><td>TC-344B</td><td></td></tr><tr><td>Flaming/Brown 微电极拉制仪</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>荧光系统接口</td><td>IonOptix</td><td>model FSI-700</td><td></td></tr><tr><td>镊子和剪刀 </td><td>World Precision Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>离子向导核心与分析</td><td>IonOptix</td><td>Ion Wizard 6.0</td><td></td></tr><tr><td>实验室管路</td><td>硅胶</td><td>508-005</td><td></td></tr><tr><td>雄性 &lt;em&gt;斯普拉格-道利&lt;/em&gt; 大鼠</td><td>Harlan Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Master flex 控制台驱动器</td><td>Cole-parmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q Plus 超纯水系统</td><td>Millipore</td><td>ZD5211584</td><td></td></tr><tr><td>眼科单丝尼龙缝合线 </td><td>Ethicon</td><td>9007G</td><td></td></tr><tr><td>测光与尺寸测量显微镜</td><td>Motic</td><td>AE31</td><td></td></tr><tr><td>带蠕动泵和压力传感器的压力伺服控制器</td><td>活体系统仪器</td><td>PS-200</td><td></td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>尼康仪器公司</td><td>SMZ660</td><td></td></tr><tr><td>血管腔室</td><td>活体系统仪器</td><td>CH-1</td><td></td></tr><tr><td>解剖皿</td><td>活体系统仪器</td><td>DD-90-S</td><td></td></tr><tr><td>薄壁玻璃毛细管</td><td>世界精密仪器公司</td><td>TW120-6</td><td></td></tr><tr><td>显微操作仪</td><td>斯托尔廷</td><td>51550</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;表3.&lt;/strong&gt;</td></tr></tbody></table>

利用压力肌动图评估肠系膜阻力动脉的肌源性反应和血管活性

Assessing Myogenic Response and Vasoactivity In Resistance Mesenteric Arteries Using Pressure Myography

小阻力动脉分别在管腔内压力升高或降低时发生收缩和舒张；这种现象称为肌源性反应，是局部血流的关键调节机制。在等压条件下，小阻力动脉会产生持续性收缩，称为肌源性张力（MT），这是全身血管阻力（SVR）的主要决定因素之一。因此，ex vivo&#160;加压的小阻力动脉制备物是研究微血管功能在接近生理状态下的重要工具。为实现这一目标，将一段新分离的完整小阻力动脉（直径约260 μm）套在两根细玻璃套管上并进行加压。这些动脉制备物保留了大部分in vivo的特性，可实现实时评估血管张力。本文提供了一种详细方案，用于评估大鼠加压状态下小阻力肠系膜动脉的血管活性；当压力维持在70 mmHg时，这些动脉会发展出持续的血管收缩——约为最大直径的25%。这些动脉制备物可用于研究实验性化合物对动脉内压力与血管活性之间关系的影响，并确定多种疾病动物模型中微血管功能的变化。

典型的压力肌动图装置示意图如图1所示。血管两端分别用玻璃微移液管插管，并在两侧用缝线固定。通过导管和一个开放的旋塞阀，其中一个插管连接至伺服控制的压力调节器；另一个插管则连接至一个封闭的旋塞阀。腔室用PSS灌流，通过连接了CCD相机的倒置显微镜观察血管直径的变化。
在70 mmHg压力下固定的动脉节段被孵育于新鲜配制的温热PSS中，PSS以2–4 ml/min的流速流经动脉腔室并被吸出。通过显微录像和边缘检测软件监测并记录动脉直径。约40分钟后，动脉节段自发收缩至初始直径的20–40%（图2A）。在本实验室条件下，小鼠小阻力动脉通常收缩25–30%（平均值因实验条件、操作者及动脉床的不同而有所变化）。随后，通过乙酰胆碱（ACh，1 μM）和苯肾上腺素（Phe，1 μM）引起的舒血管和缩血管反应评估动脉的功能活性（图2A）。尽管可使用其他舒血管药物，但ACh可诱导内皮依赖性舒张，因此可用于同时评估内皮细胞和血管平滑肌的功能活性。随后将动脉节段重新置于PSS中孵育，待直径稳定后即可用于...

压力肌动描记法用于评估小动脉在加压时产生持续性收缩的血管活性。本文提供了一项详细方案，用于评估从大鼠分离的小肠系膜动脉节段的血管活性，以及管腔内压力对血管直径的影响。

小阻力动脉分别在管腔内压力升高或降低时发生收缩和舒张；这种现象称为肌源性反应，是局部血流的关键调节机制。在等压条件下，小阻力动脉会产生持续性收缩，称为肌源性张力（MT），这是全身血管阻力（SVR）的主要决定因素。因此，离体加压的小阻力动脉制备是研究微血管功能在接近生理状态下的重要工具。为实现这一目标，将新鲜分离的完整小阻力动脉段（直径约260 μm）套在两根细玻璃插管上并进行加压。这些动脉制备物保留了大部分体内特性，可实现实时评估血管张力。本文提供了一种详细方案，用于评估大鼠肠系膜小阻力动脉在加压条件下的血管活性；当压力维持在70 mmHg时，这些动脉会产生持续性血管收缩，收缩程度约为最大直径的25%。这些动脉制备物可用于研究实验化合物对动脉内压力与血管活性之间关系的影响，并确定多种疾病动物模型中微血管功能的变化。

本实验的总体目标是确定药理学试剂或疾病状态对小阻力肠系膜动脉中压力诱导的血管张力的影响。首先从一种小鼠模型中分离出肠系膜动脉弓，以完成第一步。第二步是解剖第四级小阻力动脉。接下来的步骤包括动脉标本的插管、加压和孵育。在PSS中，最后一步是评估动脉标本的生理完整性，表现为血管张力的自发形成，以及对血管收缩剂和血管扩张剂产生适当且可逆的反应。最终，可测量压力诱导的血管收缩。该技术的应用可拓展至高血压、低血压或血管功能障碍的治疗或诊断。由于该技术能够识别血管张力在压力作用下发生变化的关键机制，而血管张力是决定血管阻力、灌注及血压的关键因素。本实验操作将由本实验室的博士后研究员 Dr.Jja 演示。开始此操作时，先将玻璃毛细管插入微移液管支架中，并将微移液管支架连接至灌流室，以完成灌流室的准备。依次用 Milli-Q 水和解剖液各冲洗五分钟。然后向灌流室中加入两毫升解剖液。接下来，仔细填充整个导管及其连接的管路，确保不产生任何气泡。在解剖显微镜下，使用钝头镊子制备两根各带半个结的缝合线。用解剖镊子将两根导管的缝合线结部分轻轻夹住，使结略微远离导管尖端并保持半闭合状态。接下来，对一只麻醉后的大鼠进行正中剖腹手术，切口从骨盆至胸骨，首先切开皮肤，随后切开下方的肌层。操作时需小心，避免损伤腹腔内器官。为防止食糜和粪便泄漏，污染细胞外灌流液，应分别结扎两端。随后，靠近肛门处切断肠管的近端，靠近回盲部切断远端。然后，在肠系膜根部靠近供血血管的位置做一切口。接着，将整个小肠肠系膜床转移至含有冰冻解剖液的50毫升烧杯中，孵育5分钟。然后用新鲜的解剖液冲洗以去除血液。现在将肠管近端固定在右侧的Sylgard包被培养皿中，将剩余的肠管沿逆时针方向延展。在体视变倍显微镜下，将肠段固定以展开肠系膜，并暴露其下的血管。沿小肠平行分离出第三级和第四级小肠系膜动脉，首先去除二级分支附近的所有覆盖脂肪组织。然后分离出静脉，并分离出具有V形分支点的动脉。注意避免穿刺所选的血管段。接下来，分离出一段与小肠平行的动脉，长度为4至5毫米。将嵌入小肠的所有第五级分支在其分支起点稍远处切断，并保留一段血管。这些保留的血管段将用作将动脉片段转移至灌流室的持夹部位，并为后续的插管操作提供引导。然后在动脉两侧第五级分支远端各做两个切口，切断动脉节段，并将其转移至灌流室。用解剖镊夹住动脉节段的末端，将其一端套在玻璃微移液管上进行插管。将预先穿好并部分收紧的缝线沿插管端滑入，并加以固定。随后，将装有10毫升灌注液的注射器连接至与该导管相连的三通阀。轻轻抬高注射器，溶液的重力作用将使血管内的血液从血管开放端排出。移除动脉内血液后，关闭止血夹。现在将血管的远端结扎到第二根玻璃套管上，操作时需小心地将另一根套管尽可能靠近动脉段未结扎的一端。将之前已穿入但部分闭合的缝线滑至套管插入端，并加以固定。操作时需注意不要牵拉动脉节段，并确保连接在两根套管上的止流阀均处于关闭状态。将灌流室转移至配备实时视频记录系统的倒置显微镜载物台上。随后，将结扎在动脉节段近端套管上的止流阀连接至伺服控制的压力调节装置。确保连接至另一根套管的旋塞保持关闭，以维持稳定的管腔内压力。接下来，将真空管路连接至灌流管路，并将吸引口连接至灌流室的灌流口。通过串联式在线溶液加热器，以每分钟2毫升的速度向血管内灌注预热的PSS溶液。使用蠕动泵，开启真空装置，同时使腔室中生理盐溶液（PSS）的温度接近37摄氏度。将管腔内压力从20毫米汞柱缓慢升高至100毫米汞柱。通过压力调节器的自动压力设定检查血管是否存在泄漏。随后，在维持压力为100毫米汞柱的条件下，评估动脉节段是否存在弯曲。使用螺旋杠杆移动套管，以拉直动脉节段，注意不要过度拉伸动脉节段。然后将压力降至70毫米汞柱，以模拟肠系膜弓内的体内压力，并使动脉节段稳定并产生肌源性张力。在此操作中，使用配备单色视频电荷耦合装置相机的显微镜，以10倍物镜观察血管。利用视频帧采集器和实时边缘检测系统测量管腔直径。然后记录血管直径，并监测肌源性张力的发展情况。之后将压力降低至20毫米汞柱，并使直径稳定。随后以20、40、60、80和100毫米汞柱的递增梯度逐步升高管腔内压力，并在每一压力水平下等待动脉直径达到稳定状态。下一步，按照示踪曲线所示，在无钙PSS中重复压力阶跃反应，该PSS含有0.39毫摩尔EGTA和0.1毫摩尔硝普钠；当将大鼠肠系膜小动脉加压至70毫米汞柱时，其直径会自发减小；加入1微摩尔乙酰胆碱后，动脉直径恢复至接近初始水平。向组织浴液中加入1微摩尔去氧肾上腺素可使动脉直径减小，该图显示将肠系膜小动脉在无钙PSS中孵育可增加动脉直径。本表展示了单个加压动脉节段在不同灌注压力下的直径变化。在此过程中，持续记录动脉直径，同时在含有PSS和无钙PSS的条件下逐步增加管腔内压力。此处显示了在每个压力梯度下获得的动脉直径变化曲线，以及在每个压力梯度下测得的肌源性张力的柱状图。观看本视频后，您应能够充分理解如何评估小阻力动脉的肌源性反应特性。采用该技术后，可进一步进行内皮破坏和动脉灌注等附加操作。这些操作有助于回答有关内皮和钙离子在小阻力动脉血管张力调节中作用的更多问题。

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医学

评估肌反应及血管活性阻力肠系膜动脉使用压力肌动描记

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从小牛肠系膜动脉和静脉分离血管段并用作生物测定法检测小肠血管活性

关键词：小牛，肠系膜动脉，肠系膜静脉，血管活性，生物测定，小肠

学习使用压力肌动描记技术评估大鼠肠系膜小动脉的血管活性反应。该方法通过插管、加压和孵育步骤，测量压力诱导的血管收缩，为研究血管功能和心血管疾病机制提供可靠的实验方案。

利用压力肌动图评估肠系膜阻力动脉的肌源性反应和血管活性

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