Name: 沉淀形成的聚乙二醇微凝胶的特性受反应物分子量的控制 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-23T14:15:00.000+00:00
Duration: 11 min 32 s
Description: 了解通过光聚合沉淀反应制备聚乙二醇微凝胶的方法，用于药物递送和组织工程。该方法可调节分子量以控制微凝胶直径和溶胀特性。

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本项目由美国国家科学基金会（NSF）CBET 项目资助，项目编号为1061834。作者感谢CIBA公司提供了光引发剂样品。

1. 微凝胶制备用溶液的配制
<ol>
	<li>开始沉淀反应前，配制所需的溶液并将其预热至 37 °C。所需溶液包括 0.5% 光引发剂、1.5 M Na2SO4、缓冲溶液、200 mg/ml 聚乙二醇二丙烯酸酯（PEG-DA）溶液和 1× 磷酸盐缓冲液（PBS）。注意：根据已发表的方法对所有 PEG 前体进行丙烯酸化处理，并在氩气保护下储存于 -20 °C 直至使用12。</li>
	<li>称取光引发剂，溶于去离子（DI）H2O 中，配制成 0.5 (w/v)% 的溶液。必须避免该溶液暴露于紫外光下。
	<ol>
		<li>待完全溶解后，经 0.22 μm 滤膜过滤。该溶液可预先配制，并避光保存于 4 °C。注意：搅拌过程中将溶液加热至 40 °C 可将搅拌时间缩短至约 1 小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>配制 1× PBS 时，将 1 片 PBS 片剂加入 1 L 去离子 H2O 中，再经 0.22 μm 滤膜过滤。PBS 可预先配制，并储存于 4 °C。</li>
	<li>量取 39.4 ml&#160;磷酸盐缓冲液（PBS，pH = 7.4），加入 612 μl 三乙醇胺（TEOA）和 260 μl&#160;6 M 盐酸（HCl）。注意：TEOA 黏度较高；移液前应先将其预热至 37 °C。
	<ol>
		<li>调节缓冲液 pH 至约 7.7，并经 0.22 μm 滤膜过滤（最终 pH 约为 7.8）。该缓冲溶液可按比例放大配制，预先制备后储存于 37 °C。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>每次开始反应前均需新鲜配制 PEG-DA 溶液；若储存该溶液，其反应活性会下降。称取 PEG-DA，加入 PBS/TEOA/HCl 缓冲液至终浓度为 200 mg/ml。注意：由于 PEG 在溶液中会溶胀，应缓慢加入缓冲液以精确控制 PEG 浓度。 
	注意：该溶液具有高度可定制性。微凝胶的定制选项包括：改变 PEG 的起始分子量以调节微凝胶性能，使用可降解的 PEG 前体制备可降解微凝胶，对所有溶液进行无菌过滤以获得生物学无菌的微凝胶，在层流罩内完成微凝胶的制备过程，以及通过在 PEG 溶液中引入功能基团来实现微凝胶表面的功能化。</li>
	<li>称取 Na2SO4，溶于去离子 H2O 中配制成 1.5 M 溶液。为获得最佳效果，硫酸钠溶液也应在反应开始前现配现用。
	<ol>
		<li>加热并涡旋振荡溶液，直至 Na2SO4 完全溶解。必要时经 0.22 μm 滤膜过滤。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 微凝胶的制备
<ol>
	<li>加入 127.5 μl&#160;PBS/TEOA/HCl 缓冲液，10 μl&#160;0.5% 光引发剂和 25 μl&#160;200 mg/ml&#160;将 PEG 溶液加入将要形成微凝胶的试管中；通常为 2 ml&#160;微量离心管
	<ol>
		<li>将这些试管与 1.5 M Na 一同加热2SO4 溶液升温至 37 °C。</li>
		<li>加热时混匀各管。注意：本微凝胶实验方案&#160;可进行放大。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>要将分子包封到微凝胶中，加入目标分子（例如&#160;将卵清蛋白（ovalbumin）加入 PBS/TEOA/HCl 缓冲液、光引发剂和 PEG 溶液中。交联后，该分子将被固定在微凝胶网络内。</li>
	<li>一次完成一个微凝胶反应。取第一个试管，加入87.5 μl&#160;1.5 M Na2SO4.</li>
	<li>用移液器吹打混匀3–5次；也可选择静置30秒。混匀后，盐浓度将均匀分布，溶液应呈澄清状态。</li>
	<li>将试管置于紫外光下交联30秒。交联后，溶液表面应出现一层浑浊层，此层含有微凝胶。参见 图1 用于反应方案。</li>
	<li>加入 750 μl&#160;PBS中离心形成沉淀并充分混匀。</li>
	<li>以 4,000 × g 离心 2 分钟，洗涤微凝胶 5 次&#160;g以形成沉淀，并用PBS更换上清液。注意：更换缓冲液时不要扰动微凝胶沉淀，可能无法完全去除所有上清液。</li>
</ol>
3. 微凝胶尺寸与多分散性
<ol>
	<li>从离心后在1 ml&#160;去离子H2O中形成的沉淀中，用移液器吸取30 μl&#160;微凝胶。为获得最佳效果，将微凝胶溶液置于水浴超声仪中处理1小时（50–60 Hz，1.4 A），或剧烈混合以充分悬浮微凝胶。</li>
	<li>用移液器吸取15 μl&#160;微凝胶溶液滴加至洁净的载玻片上，盖上一张#1.5盖玻片。将载玻片和盖玻片翻转，置于实验用纸巾上，轻压载玻片以去除多余液体，并确保微凝胶呈单层分布。</li>
	<li>使用微分干涉差（DIC）100倍油镜采集多个微凝胶图像。通常每份样品采集5张图像，每批次建议检测3份样品，共15张图像。注意：截至目前未观察到批次间差异。</li>
	<li>测量微凝胶尺寸，获得具有代表性的直径数据。</li>
	<li>使用以下基于体积的公式计算多分散系数（PDI），其中N为微凝胶总数，Vi为第i个微凝胶的体积。</li>
</ol>
4. 微凝胶密度
<ol>
	<li>配制 7、6、5、4、3 和 1 (w/v)% 的葡聚糖水溶液（溶剂为去离子水 H2O），用于测定微凝胶密度。这些溶液的密度分别计算为 1.022、1.020、1.018、1.016、1.014 和 1.010 g/cm3。</li>
	<li>向一支 15 ml&#160;离心管中加入 1 ml&#160;7% 葡聚糖溶液。
	<ol>
		<li>缓慢用移液器加入 1 ml&#160;6% 葡聚糖溶液，使其在 7% 葡聚糖溶液上方形成清晰的分层。</li>
		<li>静置 5 分钟后，加入 1 ml&#160;5% 溶液。</li>
		<li>依此类推，直至所有葡聚糖溶液按浓度从高到低顺序完成分层。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>小心地将微凝胶加在 1% 葡聚糖溶液上方。</li>
	<li>将密度梯度在 4,000 x&#160;g、5 °C 条件下离心 10 分钟。离心后微凝胶的位置可用于简便计算其密度13。</li>
</ol>
5. 微凝胶平衡溶胀
<ol>
	<li>为测量微凝胶的溶胀质量（Ms，定义为平衡溶胀后48小时的质量），首先将微凝胶用去离子水（DI H2O）洗涤5次，并在已预先称重的微量离心管中溶胀至少48小时。</li>
	<li>在4,000 × g条件下离心微凝胶10分钟。</li>
	<li>完全移除上清液并记录湿重。采用过滤方法确保去除所有过量水分，以获得更准确的结果。</li>
	<li>将微凝胶在-80 °C下冷冻，随后冻干至恒重，以获得干重（Md）。</li>
	<li>通过公式 Water% = (Ms - Md) / Md × 100 计算微凝胶中的水含量。</li>
	<li>通过公式 Polymer% = 100 - Water%&#160; 计算聚合物含量。</li>
	<li>使用SAS软件对所有数据进行统计分析，采用n因素方差分析（n-way ANOVA）及Tukey事后检验。当p&#60;0.05时认为差异具有统计学意义。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

考察了聚合条件变化对PEG微凝胶物理性质的影响。对于该沉淀反应，将缓冲溶液、20%（w/v）&#160;PEG-二丙烯酸酯溶液（分子量分别为3,000、4,600或6,000 Da）以及光引发剂混合后加热至37 °C。加入1.5 M的Na2SO4（一种增强水分子间相互作用的促凝盐），会导致PEG在加入时瞬间沉淀。该效应在高分子量PEG中更为显著8，表明实际的微凝胶形成过程是链增长与沉淀共同作用的结果。微凝胶通过紫外光（UV）引发的光聚合反应获得。UV照射时间分别为30、90、120、300和&#160;600秒。当聚合物达到临界分子量时即发生沉淀，形成缠结且交联的微凝胶。通过在UV照射前将蛋白质分子加入溶液中，可实现其在微凝胶中的包封。随着聚合物链形成交联结构，蛋白质即被截留在聚合物网络中2,4。
采用光学显微镜结合Axiovision软件对微凝胶的粒径和多分散指数（PDI）进行测量。使用基于体积的公式计算PDI，其中PDI为1时表示单一分散。随着聚乙二醇（PEG）分子量的增加，由PEG 3,0...

根据定义，微凝胶是任何形状的水凝胶，其等效直径约为 0.1–100 μm1。由于其尺寸和特性，聚合物微凝胶成为推动药物递送和组织工程系统发展的一种多功能工具。尽管块状水凝胶已被广泛成功地用作组织工程支架和药物递送载体2–4，但近年来向微尺度支架控制的转变，为将微凝胶用作构建支架的基础材料提供了独特机遇。此外，微凝胶具有较高的表面积与体积比，有利于细胞相互作用，且在溶液中黏度较低，非常适合注射使用。最后，微凝胶可通过多种方法利用多种聚合物制备，具体方法取决于所需的微凝胶特性，因此可高度定制化，适用于多种应用场景。
制备微凝胶的技术包括悬浮聚合、乳液聚合、分散聚合或沉淀聚合。乳液聚合和悬浮聚合通常需要使用有机溶剂以及表面活性剂或稳定剂来形成微凝胶。这些方法所得到的微凝胶粒子尺寸分布高度分散5。分散聚合和沉淀反应可生成多分散性较低的粒子6；然而，通过分散聚合形成的粒子仍需使用稳定剂6。沉淀反应形成的微凝胶具有独特性，因其可在无需稳定剂或表面活性剂的情况下形成尺寸和形状均一的粒子。当生长中的聚合物链通过焓驱动或熵驱动的沉淀作用从连续相中发生相分离时，即可实现微凝胶的形成7。沉淀聚合通常在高温下进行，但可通过使用 kosmotropic 盐类降低反应温度，这类盐可降低聚合物在溶剂中的溶解度8。本研究聚焦于在生物相容性条件下，通过光引发沉淀聚合反应制备聚乙二醇（PEG）微凝胶，并通过参数调控改变微凝胶特性，以实现分子包封，用于药物递送应用。
先前关于聚乙二醇（PEG）水凝胶的研究表明，聚合条件会显著影响水凝胶的物理和力学性能，即水凝胶的含水量和压缩模量3,9。这类交联材料备受关注，是因为可利用Flory所描述的结构与物理性能之间的关系10，针对特定应用定制交联水凝胶。这些原理同样适用于微凝胶。已有研究发现，通过沉淀法形成的PEG微凝胶在再生医学领域具有应用潜力11，但尚需进一步研究微凝胶的性能，以拓展其在未来生物医学应用中的用途。本报告描述了通过沉淀反应制备微凝胶的方法，并调控微粒直径、多分散性指数（PDI）、密度和溶胀性等特性，这些特性对于进一步开发用于药物递送或再生医学的材料至关重要。

<table><tbody><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>MP Biomedical</td><td>2810305</td><td></td></tr><tr><td>三乙醇胺（TEOA）</td><td>J.T. Baker</td><td>9468-01</td><td>移液前预热至 37 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>盐酸（HCl）</td><td>BDH Aristar</td><td>BDH3028</td><td></td></tr><tr><td>硫酸钠</td><td>J.T. Baker</td><td>3891-01</td><td></td></tr><tr><td>Irgacure 2959</td><td>Ciba</td><td>029891301PS04</td><td></td></tr><tr><td>卵白蛋白（OVA）</td><td>Invitrogen</td><td>34782</td><td></td></tr><tr><td>PEG 1,500</td><td>Alfa Aesar</td><td>A16241</td><td></td></tr><tr><td>PEG 3,000</td><td>Fluka</td><td>03997-1KG</td><td></td></tr><tr><td>PEG 4,000</td><td>Alfa Aesar</td><td>A16151</td><td></td></tr><tr><td>PEG 4,600</td><td>Sigma</td><td>373001-250G</td><td></td></tr><tr><td>PEG 6,000</td><td>Fluka</td><td>03394-1KG</td><td></td></tr><tr><td>PEG 10,000</td><td>Alfa Aesar</td><td>B21955</td><td></td></tr><tr><td>葡聚糖 70</td><td>TCI</td><td>D1449</td><td></td></tr></tbody></table>

反应物分子量调控聚乙二醇沉淀微凝胶的特性

Characteristics of Precipitation-formed Polyethylene Glycol Microgels Are Controlled by Molecular Weight of Reactants

本研究描述了通过光聚合沉淀反应制备聚乙二醇（PEG）微凝胶的方法。与传统的微球制备技术相比，沉淀反应具有多项优势。与乳液法、悬浮法和分散法不同，通过沉淀反应形成的微凝胶具有均一的形态和尺寸， 即&#160;低多分散性指数，且无需使用有机溶剂或稳定剂。该沉淀反应条件温和，微凝胶性质可调，并具有低黏度以适用于注射，因此可应用于 体内 目的。与其他制造技术不同，可通过改变起始聚合物的分子量来调节微凝胶的特性。提高起始聚乙二醇（PEG）的分子量可增加微凝胶的直径和溶胀比。建议进一步改进，例如在微凝胶交联过程中包封分子。本文探讨了对PEG微凝胶构建单元进行简单改造的可能性，以推动微凝胶在未来作为药物递送载体和组织工程支架的应用。

微凝胶的尺寸取决于聚合条件。图2A展示了微凝胶直径随聚乙二醇（PEG）起始分子量和交联时间的增加而增大的趋势。用于测定不同分子量及交联30秒后微凝胶尺寸的代表性图像如图2C-G所示。对于分子量为3,000 Da的PEG，当紫外光照射时间从30秒增加至600秒时，微凝胶的平均直径从1.65±0.26增长至2.20±0.54 μm（图2B）。在保持紫外光照射时间恒定为30秒的条件下，随着PEG分子量从3,000 Da增至10,000 Da，微凝胶直径从1.65±0.26 μm增至2.17±0.33 μm（图2A）。在分子量为3,000、4,000和4,600 Da的条件下，未观察到显著差异。与沉淀形成的微凝胶之间具有统计学显著差异的详细结果见表1和表2。较长的聚合时间可促进更多的交联反应，使多条聚合物链之间发生交联并沉淀。延长紫外光照射时间可使部分具有更长聚合物链长度的链参与微凝胶形成，从而导致尺寸分布更加不均一，表现为微凝胶直径分布范围扩...

本研究描述了通过光聚合沉淀反应制备聚乙二醇（PEG）微凝胶的方法。增加PEG的分子量可提高微凝胶的直径和溶胀比。本文探讨了对PEG微凝胶沉淀反应的简单改进，以拓展其在未来作为药物递送载体和组织工程支架中的应用。

本研究描述了通过光聚合沉淀反应形成聚乙二醇（PEG）微凝胶的方法。沉淀反应提供了一种……

本实验的总体目标是通过光引发沉淀反应制备聚乙二醇微凝胶，用于药物递送载体和组织工程支架。首先准备试剂，包括光引发剂、缓冲液、三乙胺和 PEG DL 溶液，并将其预热至 37 摄氏度。第二步是将试剂加入微型离心管中，在保持 37 摄氏度的条件下涡旋混匀。接下来加入硫酸钠并混合，将溶液置于紫外光下交联30秒。交联完成后，溶液上层会形成一层浑浊的液体，其中含有微凝胶。最后一步是向混合物中加入PBS，并离心形成沉淀。最终，通过显微镜和动态光散射来测定微凝胶的尺寸，利用葡聚糖密度梯度测定其密度。此外，通过测量微凝胶的湿重和干重来计算其溶胀程度。该方法相较于乳液法、悬浮法和分散法等其他方法的主要优势在于：通过沉淀反应形成的微凝胶具有较低的多分散性指数，且无需使用有机溶剂或稳定剂；沉淀反应条件温和，微凝胶的性质可定制，且具有低黏度，适合用于NVivo应用。该方法有助于解答组织工程与再生医学领域中的关键问题，例如制备具有均匀尺寸且低多分散指数的支架。该技术的应用还可延伸至药物递送治疗，因为药物中的生长因子可被轻松包封。首先，称取500毫克光引发剂，加入100毫升去离子水中，配制成0.5%的溶液。将溶液避光并加热至40摄氏度，同时持续搅拌约一小时，以完全溶解光引发剂。待光引发剂完全溶解后，使用0.22微米滤膜对溶液进行无菌过滤，并在避光条件下于4摄氏度保存，直至使用。接下来，将三乙胺预热至37摄氏度，以降低其黏度。然后取612微升该溶液，与260微升6摩尔/升的盐酸一同加入39.4毫升的PBS中，并将pH值调节至7.8（无菌条件）。将最终溶液通过0.22微米滤膜过滤，于37摄氏度保存，直至使用。根据Sony等在Acro Lte的研究，按照已发表的方法制备PEG前体，并将最终产物在氩气环境中于-20摄氏度保存。在即将使用前，取200毫克PEG二丙烯酸酯，缓慢加入0.8毫升含有三乙醇胺和盐酸的PBS溶液，配制成1毫升浓度为200毫克/毫升的PEG二丙烯酸酯溶液。此外，在实验开始前，称取 213 毫克硫酸钠，溶于 1 毫升去离子水中。为配制 1.5 摩尔的溶液，将溶液在 37 摄氏度下加热 20 分钟，然后涡旋振荡至完全溶解。溶解后，在 37 摄氏度条件下，将最终的硫酸钠溶液和 PEG 二丙烯酸酯溶液分别通过 0.22 微米滤器过滤。将127.5 µL PBS与三乙胺和盐酸、10 µL 0.5%光引发剂以及25 µL 200 mg/mL的PEG二丙烯酸酯溶液加入1.6 mL微量离心管中，混匀。然后加入任何需要包封的分子。将这些试管连同1.5摩尔的硫酸钠溶液一起加热至37摄氏度。然后向PEG溶液的第一支试管中加入87.5微升预热的1.5摩尔硫酸钠溶液，并通过移液器吹打溶液三到五次以混匀试管。混匀后，盐浓度将均匀分布，溶液应变得澄清。将离心管置于紫外灯下，交联后照射30秒。此时溶液表面应出现一层浑浊的微凝胶层。随后，向离心管中加入750 µL PBS，通过涡旋充分混匀溶液。然后以4,000 × g离心力离心混合物2分钟，以形成沉淀。沉淀形成后，小心移除上清液，注意不要扰动沉淀，并将微凝胶重悬于新鲜的PBS中。用新鲜PBS总共洗涤微凝胶五次，每次之间均需离心沉淀。最后一次洗涤后，弃去上清液，并从沉淀中吸取30微升微凝胶至1毫升去离子水中。随后将微凝胶溶液置于水浴超声仪中，在50至60赫兹、1.4安培功率条件下超声处理1小时。接着将15微升微凝胶溶液滴加到一块洁净的酸蚀刻玻璃载玻片上，并在其上覆盖一张1.5号酸蚀刻盖玻片。将载玻片翻转至实验用纸巾上，轻轻按压载玻片以去除多余溶液，并确保微凝胶呈单层分布。随后使用光学显微镜，采用微分干涉（DIC）100倍油镜拍摄多张微凝胶图像。测量微凝胶以获得具有代表性的直径数据。使用基于体积的方程计算多分散性指数，其中 N 为微凝胶的总数，VI 为单个微凝胶的体积。为测量微凝胶的平均密度，首先配制浓度分别为 7%、6%、5%、4%、3% 和 1% 的葡聚糖水溶液（溶剂为去离子水），这些葡聚糖溶液的密度如图所示。接着，将 2 毫升 7% 的葡聚糖溶液加入一支 15 毫升离心管中。然后缓慢吸取两毫升6%的糊精溶液，加入至7%糊精溶液上方，形成清晰的分层。五分钟后，加入两毫升下一层5%糊精溶液，并以此方式继续操作，直至按糊精浓度由高到低的顺序完成所有浓度梯度的分层。随后，小心地将微凝胶加在1%糊精溶液上方，在5°C条件下以4,000 × g离心10分钟。然后观察微凝胶的位置，并根据其在各层之间的分布计算微凝胶的密度。为测定微凝胶的溶胀质量，首先预先称量一支微量离心管，然后加入1 mL微凝胶。每次洗涤后用去离子水清洗微凝胶，共洗涤五次。最后一次洗涤后，将样品在4,000 × g条件下离心10分钟，以沉淀微凝胶。用去离子水重悬微凝胶，并使其溶胀至少48小时。48小时后，将溶胀后的微凝胶在4,000 × g条件下离心10分钟，然后完全移除上清液。然后称量样品并记录其湿重。在获得准确的湿重后，将微凝胶置于零下80摄氏度冷冻，再通过冷冻干燥去除水分，得到干重。当所有水分完全升华后，利用此处所示公式计算微凝胶中的水和聚合物含量，其中MS为微凝胶的湿重，MD为干重。此处展示了使用不同分子量的20% PEG形成的PEG微凝胶的平均直径。增加紫外光照射时间也会影响微凝胶的直径。随着紫外光照射时间的延长，此处所示三种配方的微凝胶直径均随之增大。通过葡聚糖梯度测得的密度随着前体聚乙二醇分子分子量的增加而降低。这一点也在含水量百分比图中得到证实，其中较高分子量的聚乙二醇每克聚合物含有更多的水。最后，为了证明微凝胶能够负载荧光标记的蛋白质，在聚合前将一种白蛋白加入混合物中，该白蛋白随后被包埋在微球内部。荧光标记蛋白的浓度增加导致微球的多分散指数升高，但平均粒径保持不变。在进行该操作时，需注意将所有溶液加热至37摄氏度，并在洗涤及制备成像载玻片过程中充分涡旋振荡和微离心凝胶，以打散可能存在的聚集体。完成该步骤后，可进一步采用其他方法进行药物包封，以探究药物释放效应的相关问题。观看本视频后，您应充分了解如何通过沉淀反应在温和条件下制备 peg DA 微凝胶。

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沉淀形成的聚乙二醇微凝胶的特性由反应物的分子量控制

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微波辅助聚乙二醇和树脂上肽的功能化及其在链式聚合和水凝胶形成中的应用

我们提出一种制备完全由同一种基础材料——聚（N-异丙基丙烯酰胺）（PNIPAAm）构成的Janus微凝胶的方案，其结构具有明显的区室化特征，基于过饱和NIPAAm单体溶液的相分离形成。所合成的Janus微凝胶表现出独特的性质，如各向异性的热响应性以及亲油/亲水性负载能力。...

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非搅拌沉淀聚合法提供了一种快速、可重复的原型制备方法，可用于合成粒径分布窄且对刺激敏感的聚（N-异丙基丙烯酰胺）微凝胶。本实验方案展示了在此类微凝胶合成过程中，利用宽场显微镜系统进行光散射表征及单颗粒荧光追踪的方法。...

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介孔二氧化硅薄膜富集低分子量蛋白质用于生物标志物发现

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