反应物分子量调控聚乙二醇沉淀微凝胶的特性

本实验的总体目标是通过光引发沉淀反应制备聚乙二醇微凝胶，用于药物递送载体和组织工程支架。首先准备试剂，包括光引发剂、缓冲液、三乙胺和 PEG DL 溶液，并将其预热至 37 摄氏度。第二步是将试剂加入微型离心管中，在保持 37 摄氏度的条件下涡旋混匀。

接下来加入硫酸钠并混合，将溶液置于紫外光下交联30秒。交联完成后，溶液上层会形成一层浑浊的液体，其中含有微凝胶。最后一步是向混合物中加入PBS，并离心形成沉淀。

最终，通过显微镜和动态光散射来测定微凝胶的尺寸，利用葡聚糖密度梯度测定其密度。此外，通过测量微凝胶的湿重和干重来计算其溶胀程度。该方法相较于乳液法、悬浮法和分散法等其他方法的主要优势在于：通过沉淀反应形成的微凝胶具有较低的多分散性指数，且无需使用有机溶剂或稳定剂；沉淀反应条件温和，微凝胶的性质可定制，且具有低黏度，适合用于NVivo应用。

该方法有助于解答组织工程与再生医学领域中的关键问题，例如制备具有均匀尺寸且低多分散指数的支架。该技术的应用还可延伸至药物递送治疗，因为药物中的生长因子可被轻松包封。首先，称取500毫克光引发剂，加入100毫升去离子水中，配制成0.5%的溶液。

将溶液避光并加热至40摄氏度，同时持续搅拌约一小时，以完全溶解光引发剂。待光引发剂完全溶解后，使用0.22微米滤膜对溶液进行无菌过滤，并在避光条件下于4摄氏度保存，直至使用。接下来，将三乙胺预热至37摄氏度，以降低其黏度。

然后取612微升该溶液，与260微升6摩尔/升的盐酸一同加入39.4毫升的PBS中，并将pH值调节至7.8（无菌条件）。将最终溶液通过0.22微米滤膜过滤，于37摄氏度保存，直至使用。根据Sony等在Acro Lte的研究，按照已发表的方法制备PEG前体，并将最终产物在氩气环境中于-20摄氏度保存。在即将使用前，取200毫克PEG二丙烯酸酯，缓慢加入0.8毫升含有三乙醇胺和盐酸的PBS溶液，配制成1毫升浓度为200毫克/毫升的PEG二丙烯酸酯溶液。

此外，在实验开始前，称取 213 毫克硫酸钠，溶于 1 毫升去离子水中。为配制 1.5 摩尔的溶液，将溶液在 37 摄氏度下加热 20 分钟，然后涡旋振荡至完全溶解。溶解后，在 37 摄氏度条件下，将最终的硫酸钠溶液和 PEG 二丙烯酸酯溶液分别通过 0.22 微米滤器过滤。

将127.5 µL PBS与三乙胺和盐酸、10 µL 0.5%光引发剂以及25 µL 200 mg/mL的PEG二丙烯酸酯溶液加入1.6 mL微量离心管中，混匀。然后加入任何需要包封的分子。

将这些试管连同1.5摩尔的硫酸钠溶液一起加热至37摄氏度。然后向PEG溶液的第一支试管中加入87.5微升预热的1.5摩尔硫酸钠溶液，并通过移液器吹打溶液三到五次以混匀试管。混匀后，盐浓度将均匀分布，溶液应变得澄清。

将离心管置于紫外灯下，交联后照射30秒。此时溶液表面应出现一层浑浊的微凝胶层。随后，向离心管中加入750 µL PBS，通过涡旋充分混匀溶液。

然后以4,000 × g离心力离心混合物2分钟，以形成沉淀。沉淀形成后，小心移除上清液，注意不要扰动沉淀，并将微凝胶重悬于新鲜的PBS中。用新鲜PBS总共洗涤微凝胶五次，每次之间均需离心沉淀。

最后一次洗涤后，弃去上清液，并从沉淀中吸取30微升微凝胶至1毫升去离子水中。随后将微凝胶溶液置于水浴超声仪中，在50至60赫兹、1.4安培功率条件下超声处理1小时。接着将15微升微凝胶溶液滴加到一块洁净的酸蚀刻玻璃载玻片上，并在其上覆盖一张1.5号酸蚀刻盖玻片。

将载玻片翻转至实验用纸巾上，轻轻按压载玻片以去除多余溶液，并确保微凝胶呈单层分布。随后使用光学显微镜，采用微分干涉（DIC）100倍油镜拍摄多张微凝胶图像。测量微凝胶以获得具有代表性的直径数据。

使用基于体积的方程计算多分散性指数，其中 N 为微凝胶的总数，VI 为单个微凝胶的体积。为测量微凝胶的平均密度，首先配制浓度分别为 7%、6%、5%、4%、3% 和 1% 的葡聚糖水溶液（溶剂为去离子水），这些葡聚糖溶液的密度如图所示。接着，将 2 毫升 7% 的葡聚糖溶液加入一支 15 毫升离心管中。

然后缓慢吸取两毫升6%的糊精溶液，加入至7%糊精溶液上方，形成清晰的分层。五分钟后，加入两毫升下一层5%糊精溶液，并以此方式继续操作，直至按糊精浓度由高到低的顺序完成所有浓度梯度的分层。随后，小心地将微凝胶加在1%糊精溶液上方，在5°C条件下以4,000 × g离心10分钟。

然后观察微凝胶的位置，并根据其在各层之间的分布计算微凝胶的密度。为测定微凝胶的溶胀质量，首先预先称量一支微量离心管，然后加入1 mL微凝胶。每次洗涤后用去离子水清洗微凝胶，共洗涤五次。

最后一次洗涤后，将样品在4,000 × g条件下离心10分钟，以沉淀微凝胶。用去离子水重悬微凝胶，并使其溶胀至少48小时。48小时后，将溶胀后的微凝胶在4,000 × g条件下离心10分钟，然后完全移除上清液。

然后称量样品并记录其湿重。在获得准确的湿重后，将微凝胶置于零下80摄氏度冷冻，再通过冷冻干燥去除水分，得到干重。当所有水分完全升华后，利用此处所示公式计算微凝胶中的水和聚合物含量，其中MS为微凝胶的湿重，MD为干重。

此处展示了使用不同分子量的20% PEG形成的PEG微凝胶的平均直径。增加紫外光照射时间也会影响微凝胶的直径。随着紫外光照射时间的延长，此处所示三种配方的微凝胶直径均随之增大。

通过葡聚糖梯度测得的密度随着前体聚乙二醇分子分子量的增加而降低。这一点也在含水量百分比图中得到证实，其中较高分子量的聚乙二醇每克聚合物含有更多的水。最后，为了证明微凝胶能够负载荧光标记的蛋白质，在聚合前将一种白蛋白加入混合物中，该白蛋白随后被包埋在微球内部。

荧光标记蛋白的浓度增加导致微球的多分散指数升高，但平均粒径保持不变。在进行该操作时，需注意将所有溶液加热至37摄氏度，并在洗涤及制备成像载玻片过程中充分涡旋振荡和微离心凝胶，以打散可能存在的聚集体。完成该步骤后，可进一步采用其他方法进行药物包封，以探究药物释放效应的相关问题。

观看本视频后，您应充分了解如何通过沉淀反应在温和条件下制备 peg DA 微凝胶。