皮层小胶质细胞的分离与保存免疫表型和功能从新生儿鼠
2014年1月30日
一键小胶质细胞生物学的研究成功是小胶质细胞免疫功能的体外从中枢神经系统组织分离过程中的保存。通过旋转振动造成的高纯度和immunofunctional细胞培养物中分离的小胶质细胞所评估的荧光成像，免疫细胞化学，ELISA和以下的小胶质细胞活化的促炎性刺激脂多糖（LPS）和Pam 3 CSK 4（PAM）。
该程序的总体目标是从小鼠新生儿中分离皮质小胶质细胞。这是通过首先从 Muren 新生儿解剖皮质脑组织来实现的。第二步是在体外培养混合神经胶质细胞培养物 17 至 21 天。
接下来，从这些混合神经胶质细胞培养物中分离出小胶质细胞。最后一步是将小胶质细胞接种在细胞培养板中以进行进一步实验。最终，免疫荧光显微镜和 Eliza 用于表明该分离方案保留了小胶质细胞免疫表型和功能。
这种方法的视觉演示至关重要，因为显微切割中涉及的 SEP 难以执行。成功执行此过程需要速度和准确性。也就是说，太慢会降低您的细胞产量，而不完全去除脑膜会污染神经胶质培养物并阻碍神经胶质细胞生长。
首先准备小胶质细胞完全培养基，以下简称 MCM。每只幼崽准备一个培养瓶，并孵育至少一小时。这个平衡步骤对于成功至关重要。
接下来，准备等分试样并在冰上冷却。所有必需的培养基每只幼崽分装 6 毫升 MCM，并在解剖前在 37 摄氏度的水浴中加热。用 70% 乙醇擦拭水平气流工作站和解剖显微镜。
接下来，将手术所需的消毒手术工具放入工作区域。准备一个无菌培养皿，里面有用于捕获头部的解剖培养基，另一个用于解剖。将切碎的培养基分配到自己的培养皿中，以便切碎脑组织。
斩首和提取大脑后，将新鲜分离的大脑放在解剖显微镜下以观察礼貌，确保保持背侧向上和干燥。通过将镊子的尖端插入中脑和皮层的交叉处来保护大脑。就位后，完全去除背侧皮质脑膜。
接下来，去除腹侧脑膜以最大限度地提高小胶质细胞的纯度和产量。必须完全去除所有脑膜组织。将大脑皮层与大脑的其余部分分开。
请务必去除皮质腹侧或内侧可能存在的任何残留皮质脑膜。去除脑膜组织后，将皮质放入之前准备好的绞肉盘中。在二级生物安全柜中工作，用剪刀将脑组织切碎。
将切碎的组织转移到 15 毫米的锥形管中。用 1 毫升绞碎介质冲洗剪刀和绞碎盘，以最大限度地提高产量。收集这些冲洗液并将其分配到装有碎纸巾的 15 毫升锥形管中。
将组织悬液保持原样 1 到 2 分钟，让切碎的组织沉淀在试管底部。在此之后，小心取出并丢弃 2 毫升上清液，注意不要破坏沉淀的碎组织。将 3 毫升先前加热的 MCM 加入切碎的组织，然后用力对组织进行三角化。
试验完成后，不应留下任何可辨别的实体组织。使用相同的移液器吸头再添加 3 毫升 MCM，以从吸头收集残留的研磨样品。收集后，离心切碎的组织以沉淀细胞。
完成后，将沉淀的细胞放回生物安全柜中。小心取出并丢弃上清液。轻轻复苏。
用 2 毫升温热的 MCM 悬浮细胞沉淀，然后将细胞复苏悬液添加到之前制备的培养瓶中。将细胞孵育 24 小时。24 小时后，用培养瓶轻轻敲击手掌，以破坏组织碎片。
敲击前后检查细胞，确保碎片被完全清除。接下来，用新鲜的 MCM 更换培养基，并将培养瓶放回培养箱中。每天检查细胞以监测生长和污染。
大约 17 到 21 天后，小胶质细胞将准备好收获以确定细胞是否准备好，在倒置相差显微镜下检查它们。小胶质细胞已准备好收获。当它们达到大约 40% 的共流畅度时，它们表现为小而明亮的球形细胞，在其他细胞之上以单层形式生长。
为了分离，小胶质细胞在实验室工作台上大力敲击烧瓶。由于小胶质细胞的低粘附特性，这种搅动有助于将小胶质细胞与其他神经胶质细胞分离。用封口密封瓶盖，并使用温控非加湿旋转摇床旋转混合胶质细胞培养物 5 小时。
在此之后，目视检查小胶质细胞是否已从培养瓶表面抬起。使用倒置相差显微镜，小胶质细胞是明亮的球形自由漂浮细胞。星形胶质细胞和少突胶质细胞的残留层会粘附在培养瓶的底部。
接下来，将含有小胶质细胞的上清液收集到无菌锥形离心管和上颚中。复苏。将小胶质细胞沉淀悬浮在温暖的小胶质细胞生长培养基中，并使用血细胞计数板测定细胞浓度。塑料或无菌玻璃盖上的 24 孔板形式的细胞在 24 小时后滑落。
用新鲜温暖的 MGM 替换培养基，以去除漂浮的细胞和碎屑。此步骤对细胞存活至关重要，为了维持静止的小胶质细胞，小胶质细胞在此再喂养步骤后立即准备好进行实验，以评估小胶质细胞纯度。对来自内源性表达 GFP 的小胶质细胞的细胞培养物进行巨噬细胞抗原 IBA one 染色，并用 dapi 复染。
为了可视化细胞核，超过 95% 的细胞表现出 GFP IBA one 和 dpi 的共定位。在用 LPS 攻击细胞后，小胶质细胞采用了从小双表型到类似变形虫形状的明显形态变化。P 65 的免疫植物化学染色证明，在正常情况下，P 65 弥漫性地定位于整个细胞质。
而在暴露于 Pam 2 小时后，P 65 免疫反应性显着地将定位转移到细胞核，以确认分离的小胶质细胞保留了其生化免疫功能。暴露于 PAM 或 LPS 后测定促炎细胞因子 TNF α 的分泌。观看此视频后，您应该对如何将皮质小胶质细胞与镜像新生儿分离以获得最佳效果有很好的了解。
保持无菌技术并从解剖的皮质区域彻底去除脑膜组织很重要。
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概述
本文描述了一种从小鼠新生儿中分离皮层小胶质细胞的程序，强调了在整个过程中保持小胶质细胞免疫功能的重要性。分离方法包括显微解剖脑组织、培养混合胶质细胞，然后分离出小胶质细胞进行实验。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 免疫学
背景
- 小胶质细胞在中枢神经系统（CNS）中扮演着至关重要的角色。
- 分离方法可能影响小胶质细胞的功能。
- 保持免疫功能对于获得准确的实验结果至关重要。
- 使用促炎刺激物来评估小胶质细胞的激活。
研究目的
- 开发一种可靠的从小鼠新生儿中分离小胶质细胞的协议。
- 确保分离的小胶质细胞保持其免疫表型和功能。
- 促进进一步的小胶质细胞生物学研究。
使用的方法
- 从小鼠新生儿中显微解剖皮层脑组织。
- 在体外培养混合胶质细胞17到21天。
- 从混合胶质细胞培养中分离出小胶质细胞。
- 使用免疫荧光显微镜和ELISA评估小胶质细胞功能。
主要结果
- 该分离协议产生高度纯化的小胶质细胞培养。
- 小胶质细胞在分离后保持免疫功能特征。
- 使用LPS和Pam 3 CSK 4激活显示功能得以保存。
- 荧光成像和免疫细胞化学验证了结果。
结论
- 所描述的分离方法有效用于获得功能性小胶质细胞。
- 保持免疫功能对于研究小胶质细胞生物学至关重要。
- 该协议可以应用于涉及小胶质细胞的各种实验设置。
常见问题
Executive Industry Relevance
Isolation of functional microglia from murine neonates enables mechanistic de-risking in neuroimmunology target validation by preserving immunophenotype and responsiveness to inflammatory stimuli. This ex vivo model supports predictive confidence in early discovery by maintaining quiescent and activated states relevant to CNS disease pathways. The method provides a disease-relevant system for screening immunomodulatory compounds and assessing target engagement in preclinical workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of microglial activation pathways through LPS and Pam3CSK4 challenge assays.
- Operational Value: Yields highly pure cortical microglia with preserved NF-κB p65 nuclear translocation and TNF-α secretion functionality.
- Predictive Value: Supports target hypothesis testing by maintaining immunophenotypic fidelity from quiescent to proinflammatory states.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides a standardized microglial monolayer system for compound screening after 17–21 days of glial culture maturation.
- Operational Value: Allows quantification of microglial purity via IBA-1/GFP colocalization (>95%) and functional readouts like cytokine release.
- Assay Readiness: Isolated microglia exhibit morphological and functional responses to stimuli, enabling reliable dose-response profiling.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Maintains microglial functionality ex vivo, supporting continuity from discovery to preclinical validation of neuroinflammatory targets.
- Mechanistic De-risking: Preserves biochemical functionality (NF-κB signaling, TNF-α release) critical for assessing target-mediated pathway modulation.
- Disease Relevance: Models quiescent and activated microglia states applicable to neurodegenerative and neuroinflammatory disease research.
Pipeline & Workflow Integration
The isolation method fits within the discovery continuum from target validation to lead identification by providing a reproducible microglial platform for mechanism-of-action studies and phenotypic screening in neuroimmunology.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification via NF-κB translocation and cytokine secretion assays following immune challenge.
- Screening: Enables assay standardization through consistent microglial yield, purity, and functional responsiveness after rotary shaker isolation.
- Analytics: Generates quantitative dependent variables including TNF-α secretion levels and p65 nuclear localization for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects ex vivo microglial function to in vivo relevance through preserved immunophenotype and activation kinetics.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable microglial isolation workflow applicable across multiple CNS target validation campaigns.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through preserved microglial immunophenotype and stimulus-responsive functionality.
- Operational Value: Standardized isolation via mechanical agitation yields reproducible microglial cultures with >95% purity and functional integrity.
- Strategic Value: Reduces mechanistic ambiguity in neuroimmunology screening by maintaining ex vivo microglial behavior indicative of in vivo states.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of immunomodulatory targets based on validated target engagement in functional microglial assays.
Implementation Considerations
- Requires expertise in neonatal murine tissue dissection and sterile glial culture techniques.
- Dependent on temperature-controlled rotary shaker and inverted phase contrast microscopy for microglia isolation and verification.
- Necessitates standardization of meninges removal and culture duration (17–21 days) across teams to ensure microglial yield and purity.
- Adaptation to other model systems may require optimization of dissociation timing and microglial adhesion properties.
- Practical limitation: Microglial yield is contingent on complete meningeal tissue removal to prevent glial culture contamination.
