从新生小鼠中分离保留免疫表型和功能的皮层小胶质细胞

本实验的总体目标是从新生小鼠中分离皮层小胶质细胞。首先从新生小鼠中显微解剖获取皮层脑组织，然后在体外培养混合胶质细胞 17 至 21 天，以完成该过程。

接下来，从这些混合胶质细胞培养物中分离小胶质细胞。最后一步是将小胶质细胞接种到细胞培养板中，以进行后续实验。最终通过免疫荧光显微镜和ELISA检测，证明该分离方案能够保持小胶质细胞的免疫表型和功能特性。

该方法的可视化演示至关重要，因为显微解剖过程中涉及的步骤难以操作。成功实施该操作既需要速度，也需要准确性：操作过慢会降低细胞得率，而脑膜去除不完全则会污染胶质细胞培养物并阻碍胶质细胞生长。

首先制备小胶质细胞完全培养基（以下简称 MCM）。每只幼鼠准备一个烧瓶，并至少孵育一小时。此平衡步骤对成功至关重要。

接下来，准备分装并置于冰上冷却。每个幼鼠所需的所有培养基分装六毫升 MCM，并在解剖前于 37°C 水浴中预热。用 70% 乙醇擦拭水平气流工作台和解剖显微镜。

接下来，将手术所需的已灭菌外科器械放入工作区域。准备一个盛有解剖介质的无菌培养皿用于获取头部，另备一个用于解剖。将剪切介质分装至单独的培养皿中，用于剪切脑组织。

断头并取出脑组织后，将新鲜分离的脑置于解剖显微镜下观察脑膜，注意保持背侧朝上且干燥。用镊子尖插入中脑与皮层交界处固定脑组织。固定后，彻底去除背侧皮层的脑膜。

接下来，去除脑腹侧的脑膜，以最大限度提高小胶质细胞的纯度和得率。必须彻底清除所有脑膜组织。将大脑皮层与其他脑组织分离。

务必去除皮层腹侧或内侧可能残留的任何皮质脑膜。去除脑膜组织后，将皮层组织放入先前准备好的剪切皿中。在二级生物安全柜中操作，使用剪刀剪碎脑组织。

将剪碎的组织转移至一个15毫米的锥形管中。分别用一毫升消化液冲洗剪刀和剪碎组织用的培养皿，以最大限度提高收获量。收集冲洗液，并将其加入含有剪碎组织的15毫升锥形管中。

将组织悬液静置一到两分钟，使剪碎的组织沉降至管底。静置后，小心移除并弃去上清液2 mL，注意不要扰动已沉淀的组织碎片。向组织碎片中加入3 mL 预先预热的MCM，然后用力振荡混匀组织。

三棱针操作完成后，不应有明显的固体组织残留。使用同一移液枪头再加入三毫升MCM，以收集枪头内的残留匀浆样本。收集完毕后，离心剪碎的组织以沉淀细胞。

当离心完成后，将沉淀的细胞放回生物安全柜中。小心移除并弃去上清液。轻柔地重悬。

用两毫升预热的MCM重悬细胞沉淀，然后将重悬的细胞悬液加入先前准备好的培养瓶中。将细胞培养24小时。24小时后，轻轻将培养瓶叩击手掌，以分散组织碎片。

轻敲前后均需检查细胞，确保碎片已完全去除。随后，更换为新鲜的MCM培养基，并将培养瓶放回培养箱。每日观察细胞，以监测其生长状况和污染情况。

大约 17 到 21 天后，小胶质细胞将准备收获。为确定细胞是否已准备好，需在倒置相差显微镜下观察。当小胶质细胞达到约 40% 的汇合度时，即可进行收获。此时，它们呈现为微小、明亮的球形细胞，以单层形式生长于其他细胞之上。

为分离小胶质细胞，用力将培养瓶在实验台面上轻敲。这种震荡利用小胶质细胞黏附性较低的特性，有助于将其与其他胶质细胞分离。用多聚甲醛密封培养瓶瓶盖，将混合胶质细胞培养物置于温度可控、无加湿的旋转摇床中旋转5小时。

此后，需肉眼观察小胶质细胞是否已从培养瓶表面脱落。在倒置相差显微镜下，小胶质细胞呈明亮的球形悬浮细胞。培养瓶底部会残留一层星形胶质细胞和少突胶质细胞。

接下来，将含有小胶质细胞的上清液收集到无菌的锥形离心管中，并重悬。用温热的小胶质细胞生长培养基重悬小胶质细胞沉淀，并使用血细胞计数板测定细胞浓度。24小时后，在24孔板中的塑料或无菌玻璃盖玻片上接种细胞。

更换为新鲜的温热MGM培养基，以去除悬浮细胞和碎片。此步骤对细胞存活以及维持小胶质细胞的静息状态至关重要；完成换液后，小胶质细胞可立即用于实验，以评估小胶质细胞纯度。来源于内源性表达GFP的小胶质细胞的细胞培养物，使用IBA1抗体进行巨噬细胞抗原染色，并用DAPI复染。

为了观察细胞核，超过95%的细胞表现出GFP IBA1与dpi的共定位。在用LPS刺激细胞后，小胶质细胞从较小的双突起表型转变为类似阿米巴样的形态。P65的免疫荧光染色结果表明，在正常条件下，P65在细胞质中呈弥散分布。

然而，在经过两小时的Pam P处理后，P65免疫反应性显著转移至细胞核，从而证实分离得到的微胶质细胞保留了其生化免疫功能。在暴露于PAM或LPS后，检测了促炎性细胞因子TNFα的分泌情况。观看本视频后，您应能充分理解如何从新生小鼠中分离皮层微胶质细胞，以获得最佳实验结果。

保持无菌操作技术并彻底清除解剖皮层区域中的脑膜组织至关重要。