Name: 监测改变膜极性，膜完整性和细胞内离子浓度肺炎链球菌使用荧光染料 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-17T22:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 17 s
Description: 了解如何使用荧光染料监测肺炎链球菌的膜极性、膜完整性及细胞内离子浓度变化。该方法克服了传统电生理技术的局限性，可实时观察细菌膜动力学。

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本研究由比尔及梅琳达·盖茨基金会（资助号 53085）、JR Oishei 基金会和美国肺脏协会（资助号 RG-123721-N）资助，项目负责人：APH；同时获得美国国立卫生研究院（NIDCD）F31DC011218 博士后奖学金资助，项目负责人：EAC。

1. 准备细菌&#160;培养物
<ol>
	<li>实验用培养物的培养
	<ol>
		<li>在37 °C的加热块中解冻一管冻存的S. pneumoniae，将内容物加入含有0.5%酵母提取物（THY）的9 ml新鲜预热的Todd-Hewitt肉汤中，总体积为10 ml，置于玻璃培养管中。</li>
		<li>在37 °C静置培养，直至培养物达到对数中期（Abs600nm ≈0.5–0.6）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 检测膜去极化与破裂
<ol>
	<li>准备试剂
	<ol>
		<li>用100% DMSO配制50 µM DiBAC4(3)储备液，用ddH2O配制2 mg/ml PI储备液。DiBAC4(3)储备液在-20 °C下至少可稳定保存6个月。PI储备液在4 °C下至少可稳定保存6个月。</li>
		<li>用铝箔包裹储备液，避免光照。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>加载细菌
	<ol>
		<li>将1.2.2步骤中的细菌细胞在室温下以2,400 x g离心10分钟收集菌体，弃上清，用10 ml 1×磷酸盐缓冲液（PBS）重悬菌体，混匀后再次以2,400 x g离心10分钟，重复此洗涤步骤共两次。</li>
		<li>弃去上清液，将菌体沉淀用PBS重悬至原始体积，使细菌浓度约为每毫升108个菌落形成单位。取1 ml洗涤后的菌液（足够进行5个样品），转移至微量离心管中。</li>
		<li>向上述菌液中加入25 µl 1 M葡萄糖滤菌溶液（用ddH2O配制，并通过0.45 µm滤器过滤），使终浓度为25 mM葡萄糖，然后在37 °C加热模块中孵育15分钟。注：此步骤可为所有ATP依赖性膜通道及细胞组分提供能量，是否需要此步骤取决于具体实验设计。</li>
		<li>加入5 µl 50 µM DiBAC4(3)储备液和10 µl 2 mg/ml PI储备液，使终浓度分别为250 nM和20 µg/ml。用移液器反复吹打数次以充分混匀。将200 µl&#160;该细胞悬液加入透明96孔板的每个样品孔中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>检测荧光
	<ol>
		<li>将96孔板放入已预热至37 °C的荧光检测仪中。</li>
		<li>确保仪器中已安装适用于DiBAC4(3)（激发波长490 nm，发射波长516 nm）和PI（激发波长535 nm，发射波长617 nm）检测的滤光片。</li>
		<li>为允许DiBAC4(3)在膜上达到平衡并同时监测其过程，设置仪器每隔1分钟采集一次荧光信号，持续约30–40分钟，或直至读数稳定；此阶段作为“预处理”读数。</li>
		<li>取出96孔板，加入选定的实验处理剂，立即放回检测仪中，继续监测DiBAC4(3)和PI荧光信号，持续至所需时间。若同时处理多个样品，可使用多通道移液器同时向所有孔中加样，以提高一致性。</li>
		<li>将数据导出至数据分析软件（如Microsoft Excel），绘制荧光强度随时间变化的曲线，以评估细胞膜去极化和破裂情况。DiBAC和PI荧光强度的上升表明膜去极化和破裂正在发生。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 检测细胞内 Ca2+ 或 K+ 浓度的变化
<ol>
	<li>配制试剂与上样缓冲液
	<ol>
		<li>配制以下试剂：5 mM 的离子敏感型荧光染料储备液（Fura-2/AM 或 PBFI/AM；将适量 DMSO 加入含有 50 µg 染料的离心管中），“100倍”丙磺舒溶液（将 1 ml PBS 加入含 77 mg 丙磺舒的西林瓶中）。溶解后的染料可于 -20 °C 冻存一次，溶液中可稳定保存 3 个月；丙磺舒溶液在 -20 °C 下可稳定保存 6 个月。</li>
		<li>按以下方法配制 1 ml 的 2倍上样缓冲液：取一个 15 ml 塑料锥形管，先在管底加入 20 µl&#160;100倍 PowerLoad 浓缩液（2–8 °C 下可稳定保存 6 个月），随后直接向 PowerLoad 中加入 2 µl&#160;5 mM 离子敏感型荧光染料。短暂涡旋混匀。接着加入 960 µl&#160;PBS，再加入 20 µl&#160;100倍丙磺舒溶液。最后再涡旋混匀一次。用铝箔包裹以避光。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将染料加载至细菌中
	<ol>
		<li>按 2.2.1 步骤所述，离心收集并清洗处于对数中期的细菌培养物。弃去上清液，将菌体沉淀重悬于 5 ml PBS 中，制成“2倍”细胞悬液。</li>
		<li>取 1 ml 上述 2倍细胞悬液加入 2倍上样缓冲液中。最终体积为 2 ml，其中 PowerLoad 为 1倍、荧光染料终浓度为 5 µM、丙磺舒为 1倍。注：此悬液总体积足以进行 10 个样品的检测，因每个检测孔需加入 200 µl。</li>
		<li>避光条件下于 37 °C 水浴中孵育 75 分钟。注：在无糖酵解底物存在、且含丙磺舒的条件下进行染料加载，以最大限度减少染料外排。</li>
		<li>洗涤 1：&#160;在 2,400 × g 条件下离心 10 分钟以收集细胞，弃去上清液，将细胞重悬于含 1倍丙磺舒的 2 ml PBS 中。洗涤 2、3：&#160;重复步骤 3.2.4&#160;两次。于 37 °C 继续孵育 30 分钟。此步骤&#160;可为细菌酯酶提供足够时间，使其水解细胞内荧光染料的 AM 酯基团。</li>
		<li>洗涤 4：在 2,400 × g 条件下离心 10 分钟以收集细胞，弃去上清液，将细胞重悬于含 1倍丙磺舒的 2 ml PBS 中。注：根据实验需要，可在此步骤中重新加入葡萄糖以恢复细菌能量状态。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>荧光检测
	<ol>
		<li>将荧光检测酶标仪预热至 37 °C。</li>
		<li>对每个待测样品，取 200 µl&#160;已加载染料的细胞（来自步骤 3.2.8）加入 96 孔板的孔中。（以下操作应逐孔/逐样品依次完成）。</li>
		<li>为建立某孔的基线读数，将酶标板放入荧光检测酶标仪中，每秒测量一次荧光值，持续 1 分钟（“值 1”为 340 nm 激发 / 510 nm 发射，“值 2”为 380 nm 激发 / 510 nm 发射）。</li>
		<li>取出酶标板，向该孔中加入选定的处理试剂（体积约 5 µl），快速吹打混匀数次，立即放回荧光检测酶标仪中，按所需时长每秒连续读数。（若酶标仪配有自动进样器，也可使用该装置无缝添加处理试剂，无需中断读数或取出酶标板）。</li>
		<li>将读数导出至数据分析软件（如 Microsoft Excel）。通过将“值 1”除以“值 2”计算每个时间点的荧光比值，并将比值绘制成曲线图。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 检测细胞内pH值的变化
<ol>
	<li>配制试剂和校准缓冲液
	<ol>
		<li>配制以下试剂：5 mM BCECF/AM 储液（向含有 50 µg 染料的离心管中加入适量 DMSO。该储液在 -20 °C 下可稳定保存 3 个月）；100 倍普鲁本辛溶液（向含有 77 mg 的试剂瓶中加入 1 ml PBS）；1 mM 尼日里菌素乙醇储液（用于平衡细胞内 pH（pH&#173;i细胞的数量 &#173;至周围缓冲液的pH值。该储备液在-20 °C下可稳定保存6个月）；0.5 mM的羰基氰化物-3-氯苯腙（CCCP）DMSO储备液（用于解偶联质子驱动力的质子载体。该储备液在-20 °C下可稳定保存6个月）</li>
		<li>配制10 ml以下高钾缓冲液：135 mM KH2PO4 / 20 mM NaOH（一元碱）和 110 mM K2HPO4 / 20 mM NaOH（二碱基）。使用0.45 µm滤器过滤除菌。（这些缓冲液可保存在4 °C，直至使用）。</li>
		<li>按所需比例混合高钾缓冲液，配制至少5-6种pH值在6.5至8.0范围内的高钾缓冲液。</li>
		<li>按如下步骤制备1 ml 2×上样缓冲液：在15 ml塑料锥形管底部加入40 µl&#160;100倍&#160;PowerLoad，随后加入 20 µl&#160;将5 mM的离子敏感性染料直接加入PowerLoad中，短暂涡旋混匀。加入900 µl&#160;PBS 后接 40 µl&#160;加入100倍浓度的丙磺舒，最后涡旋混合一次。用铝箔包裹以避光。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用染料标记细菌
	<ol>
		<li>离心收集8 ml对数中期的细菌培养物，并按2.2.1节所述方法洗涤。弃去上清液，将菌体沉淀重悬于2 ml磷酸盐缓冲液（PBS）中，制成“4倍浓度”（4x）的细胞悬液。</li>
		<li>加入 1 ml 的 4x&#160;细胞悬液加入至2x&#160;上样缓冲液。这将提供 2 ml 的终体积，以及 2x 的终浓度&#160;细胞，2x&#160;PowerLoad、50 µM 荧光染料和 2x 丙磺舒。</li>
		<li>在30 °C水浴中避光孵育40分钟。注意：在较低温度（30 °C）且无任何糖酵解底物的条件下，将染料加载至细菌细胞内，以尽量减少染料外排。</li>
		<li>WASH 1：&#160; 通过离心（2,400 × g，10 分钟）沉淀细胞，弃去上清液以去除过量染料，然后将细胞重悬于 4 ml 含 2× 丙磺舒和 1 mM 葡萄糖的 PBS 中（以重新激活细菌）。洗涤 2、3：&#160; 重复步骤 4.2.7 两次，最后重悬于 4 ml 中&#160;PBS（用于配制终浓度为1x）&#160;含2倍丙磺舒和10 mM葡萄糖的细胞。</li>
		<li>在37 °C下孵育5分钟。此步骤可使细胞充分活化，并为细菌酯酶提供足够时间，以切除被内化BCECF上的AM酯基团。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>建立背景荧光 体内 标准曲线
	<ol>
		<li>将荧光检测板式读数仪预热至 37 °C。</li>
		<li>为确定背景荧光，过滤除菌约 500 µl&#160;去除已加载并激活的细菌悬液（来自步骤 4.2.7）中的细菌，并加入 200 µl&#160;将滤液加入96孔板的孔中。</li>
		<li>将培养板放入荧光检测酶标仪中，测量荧光值（“Value 1”为490 nm激发/530 nm发射，“Value 2”为440 nm激发/530 nm发射），持续1分钟。该背景荧光值应在计算标准曲线和实验样品的比值之前予以扣除。</li>
		<li>为了获得一个 体内 标准曲线，洗涤 500 µl&#160;将步骤4.2.7中已加载并激活的细胞等分试样取一次，重悬于不同pH值（范围为6.5–8.0）的高钾缓冲液中。</li>
		<li>加入20 µM 尼日里菌素（nigericin），使细胞内pH与周围缓冲液的pH达到平衡，37 °C孵育5 min。加入200 µl&#160;将不同细菌/pH缓冲液组合加入96孔板的各孔中。</li>
		<li>将培养板放入荧光检测酶标仪中，测量数分钟以获得每个孔的稳定荧光读数。将读数导出至数据分析软件（如 Microsoft Excel）。</li>
		<li>扣除背景荧光值后，将值1除以值2，计算荧光值的比值。将每种pH缓冲液对应的比值绘制成图，以生成校准曲线。（每次使用新一批加载的细胞时均应生成校准曲线，因为每次细菌加载的荧光染料量可能有所不同。）</li>
	</ol>
	</li>
	<li>测量细胞内pH值的变化
	<ol>
		<li>对于每个所需样品，加入 200 µl&#160;将已加载并激活的细胞（来自步骤4.2.7）加入96孔板的孔中。</li>
		<li>将培养板放入荧光检测酶标仪中，每5秒测量一次样品荧光值，持续5分钟。</li>
		<li>取出培养板，向其中一个孔加入10 µM CCCP（作为降低细胞内pH的阳性对照），向其余孔加入目标实验试剂。为准确比较其随时间变化的效应，应使用多通道移液器同时向各孔加入CCCP和所选试剂。</li>
		<li>立即将培养板放回酶标仪中，继续以每5秒一次的频率测量荧光，持续10分钟。作为额外对照，取出培养板并向所有样品中加入20 µM 尼日里菌素（Nigericin），以平衡pH&#173;i 细菌的 &#173;至缓冲液的pH值，并读取5分钟。</li>
		<li>扣除背景荧光值后，计算各样本的荧光比值。通过插值法确定pHi 校准曲线每次读数的相应值。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Hakansson, A., Zhivotovsky, B., Orrenius, S., Sabharwal, H., Svanborg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+induced+by+a+human+milk+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Apoptosis induced by a human milk protein.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92 (17), 8064-8068 (1995).</li>
<li>Hakansson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+folding+variant+of+alpha-lactalbumin+with+bactericidal+activity+against+Streptococcus+pneumoniae%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A folding variant of alpha-lactalbumin with bactericidal activity against Streptococcus pneumoniae.</a> Mol. Microbiol. 35 (3), 589-600 (2000).</li>
<li>Hakansson, A. P., Roche-Hakansson, H., Mossberg, A. K., Svanborg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis-Like+Death+in+Bacteria+Induced+by+HAMLET%2C+a+Human+Milk+Lipid-Protein+Complex%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Apoptosis-Like Death in Bacteria Induced by HAMLET, a Human Milk Lipid-Protein Complex.</a> PLoS One. 6 (3), (2011).</li>
<li>Kohler, C., Gogvadze, V., Hakansson, A., Svanborg, C., Orrenius, S., Zhivotovsky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+folding+variant+of+human+alpha-lactalbumin+induces+mitochondrial+permeability+transition+in+isolated+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A folding variant of human alpha-lactalbumin induces mitochondrial permeability transition in isolated mitochondria.</a> Eur. J. Biochem. 268 (1), 186-191 (2001).</li>
<li>Ly, J. D., Grubb, D. R., Lawen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mitochondrial+membrane+potential+%28%CE%94%CF%88+m%29+in+apoptosis%3B+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22Apoptosis%22%5BJournal%5D)">The mitochondrial membrane potential (Δψ m) in apoptosis; an update.</a> Apoptosis. 8 (2), 115-128 (2003).</li>
<li>Dominguez, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signalling+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Calcium signalling in bacteria.</a> Mol. Microbiol. 54 (2), 291-297 (2004).</li>
<li>Corratge-Faillie, C., Jabnoune, M., Zimmermann, S., Very, A. A., Fizames, C., Sentenac, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potassium+and+sodium+transport+in+non-animal+cells%3A+the+Trk%2FKtr%2FHKT+transporter+family%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol.+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Potassium and sodium transport in non-animal cells: the Trk/Ktr/HKT transporter family.</a> Cell Mol. Life Sci. 67 (15), 2511-2532 (2010).</li>
<li>Szabo, I., Petronilli, V., Zoratti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+patch-clamp+study+of+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">A patch-clamp study of Bacillus subtilis.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1112 (1), 29-38 (1992).</li>
<li>Zoratti, M., Petronilli, V., Szabo, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stretch-activated+composite+ion+channels+in+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Stretch-activated composite ion channels in Bacillus subtilis.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 168 (2), 443-450 (1990).</li>
<li>Novo, D., Perlmutter, N. G., Hunt, R. H., Shapiro, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+flow+cytometric+membrane+potential+measurement+in+bacteria+using+diethyloxacarbocyanine+and+a+ratiometric+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Accurate flow cytometric membrane potential measurement in bacteria using diethyloxacarbocyanine and a ratiometric technique.</a> Cytometry. 35 (1), 55-63 (1999).</li>
<li>Novo, D. J., Perlmutter, N. G., Hunt, R. H., Shapiro, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiparameter+flow+cytometric+analysis+of+antibiotic+effects+on+membrane+potential%2C+membrane+permeability%2C+and+bacterial+counts+of+Staphylococcus+aureus+and+Micrococcus+luteus%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Multiparameter flow cytometric analysis of antibiotic effects on membrane potential, membrane permeability, and bacterial counts of Staphylococcus aureus and Micrococcus luteus.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 44 (4), 827-834 (2000).</li>
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<li>Shapiro, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+analysis+at+the+single-cell+level%3A+tasks+and+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Microbial analysis at the single-cell level: tasks and techniques.</a> J. Microbiol. Methods. 42 (1), 3-16 (2000).</li>
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</ol>

作者声明无竞争性财务利益。

尽管细菌体积微小，限制了传统电生理学方法在检测细菌膜电位与膜完整性变化以及胞内离子浓度变化方面的应用，但我们已描述了一种利用荧光染料检测S. pneumoniae中这些事件的方法。我们的实验方案是肺炎链球菌中首次报道的同类方法，也是目前针对细菌物种所建立的极少数方法之一。通过使用荧光检测酶标仪，可在体积仅为200 µl&#160;的细菌样品中，对细菌群体随时间变化的荧光信号进行实时监测。荧光强度的动力学变化可用于定性判断细菌膜电位或膜完整性的改变，以及胞内Ca2+、K+或H+水平的变化情况。从定量角度而言，荧光强度数据还可用于计算相对于对照样本的去极化程度、膜破裂程度、钙离子摄取量、钾离子外流水平或pH值变化，从而为相关作用机制提供关键信息。此外，本方案也可作为加载其他乙酰甲酯（AM）类荧光染料的起始参考，有助于在多种细菌物种中研究其他各类细胞事件。我们已成功将部分本方案应用于Staphylococcus aureus21的研究中。
使用 AM 染料时，充分的...

本实验室从人乳中鉴定出一种名为HAMLET（人α-乳清蛋白肿瘤细胞杀伤复合物，Human Alpha-lactalbumin Made LEthal to Tumor cells）的蛋白-脂质复合物，该复合物可诱导肿瘤细胞发生凋亡，同时也能够杀灭多种细菌1,2。研究发现，对HAMLET特别敏感的细菌主要是那些靶向呼吸道的物种，其中肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae，即肺炎球菌）表现出最强的敏感性，并呈现一种类似凋亡的死亡表型2,3。在真核细胞（尤其是线粒体）的凋亡过程中，膜去极化及特定离子转运事件已被广泛研究并被认为是关键步骤；放射性标记的TPP+离子以及JC-1和TMRE等荧光染料已被用于证实线粒体膜的去极化现象3-5。因此，我们着手进一步探究HAMLET对肺炎球菌中这些膜相关特征的影响，旨在深入理解细菌中类似凋亡表型的作用机制，并在此过程中发掘新型抗菌疗法或疫苗候选分子的巨大潜力。
在建立机制研究方案的过程中，我们发现，与真核系统中已有详尽描述的方法相比，有关细菌膜电生理学及离子转运机制的已发表研究极为有限6,7。这主要归因于微生物体积较小及其表面结构特点，尤其是细胞壁的存在，限制了常规真核细胞技术（如膜片钳）对膜的可及性；尽管已有部分研究尝试使用巨型原生质体并取得不同程度的成功8,9。由于巨型原生质体的操作方法要求细菌处于非自然且无生命的异常状态，对于大多数细菌种类而言既不理想也不具备实用性，因此目前已开展的细菌膜电位研究主要依赖流式细胞术，并使用氰染料和氧醇类荧光染料进行检测10-16。
我们选择使用荧光检测酶标仪，而非流式细胞术，来检测96孔板中细菌悬液随时间变化的荧光强度。流式细胞术仅能在单一时间点对单个细菌进行荧光信号采集，而本方法使我们能够以更简便、更高效的方式对细菌群体在多个时间点进行处理，并长时间连续监测整个群体的荧光动力学变化，这是流式细胞术难以实现的。在测试了多种膜电位敏感型荧光染料（包括上述用于线粒体检测的染料）后，我们发现使用双苯并恶唑染料DiBAC4(3)（双-(1,3-二丁基巴比妥酸)三甲川恶唑）在监测极性变化方面取得了最佳的技术效果和操作可行性。
我们还发现，使用碘化丙啶（propidium iodide, PI）同时监测细胞膜完整性的破坏具有重要价值。该染料在结合核酸时会产生荧光，但只有当细菌膜完整性受损时才能进入细胞并结合核酸，因此PI常被用于活-死染色实验中检测死亡细胞。除PI外，SYTOX Green和TO-PRO-1也是作用机制相似的荧光染料，已有少数研究在流式细胞术检测方法中将其用于细菌检测17。我们选择使用PI，是因为其激发波长允许我们在同一样本中同时监测PI与DiBAC的荧光信号。
在我们的研究中观察到，HAMLET 以及另一种具有杀菌活性的相关蛋白-脂质复合物 ELOA 均可诱导肺炎链球菌细胞膜去极化并导致膜破裂，这表现为两种染料在处理肺炎链球菌后荧光信号均增强3,18,26。对于这两种复合物，我们均发现 DiBAC4(3) 的荧光强度增加早于 PI 荧光强度的上升，表明去极化发生在膜破裂之前，因此是这些目标杀菌性蛋白-脂质复合物所特异性诱导的事件。明确这一顺序至关重要，因为膜破裂本身即可引起非特异性的去极化。同时测量并分析 DiBAC4(3) 与 PI 的荧光动力学，使我们能够探究这两种膜事件之间的关系，这也是采用荧光光度法而非流式细胞术的额外优势。
为了监测细菌离子流，此前已有一些使用放射性同位素的成功案例，包括利用45Ca2+测定肺炎链球菌的离子摄取量19,20，我们在最近的研究中也采用了该方法18,21。然而，使用这些放射性离子存在若干缺点：成本高昂、耗时较长、操作繁琐，并且可能使实验操作人员暴露于危害之中，具体风险取决于所使用的同位素种类。此外，该方法难以实时监测离子浓度的快速动态变化。因此，我们转向了一种替代性检测方法，即采用乙酰氧基甲基（AM）酯形式的离子敏感型荧光指示剂染料。指示剂染料本身带电，难以穿过细胞膜；但当引入疏水性酯基团后，该分子变为电中性，因而能够顺利穿过细菌细胞膜。进入细胞内部后，细菌的酯酶会水解酯基团，使染料在细胞内释放并重新带电，从而显著减缓其外排速度，使染料在细胞内逐渐积累。然而，目前仅在少数细菌物种中报道过此类酯类染料的应用，用于检测细胞内Ca2+ 22-24和H+ 16的变化，且在染料加载、检测方法及实验成功率方面存在较大差异。
希望监测细胞内Ca²⁺水平的变化2+ 以及 K+ 和 H+ 水平在 S. pneumoniae 在使用 HAMLET 及其他化合物处理后，我们成功建立了高效将荧光指示染料载入细菌细胞的实验方案。有效载入细菌需要 probenecid 和 PowerLoad 共同作用：probenecid 通过阻断阴离子转运体以增强染料滞留，PowerLoad 是 Life Technologies 公司的一种专有化合物，可提高载入效率。Fura-2/AM（用于检测 Ca2+)，PBFI/AM（用于检测K+），以及 BCECF/AM（用于检测 H+) 成功导入无荚膜和有荚膜的肺炎链球菌菌株中，从而实现了 &#160;添加离子霉素（ionomycin，Ca²⁺）等离子载体后，对产生的荧光模式进行测量2+ 解偶联剂），缬氨霉素（K+ 解偶联剂）和CCCP（H+ 解偶联剂）使用荧光检测酶标仪18,21.

<table><tbody><tr><td>Todd-Hewitt 肉汤</td><td>Bacto, BD 诊断</td><td>249240</td><td></td></tr><tr><td>酵母提取物</td><td>Bacto, BD 诊断</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液 (PBS; pH 7.2)</td><td>Invitrogen (GIBCO)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5879</td><td>DMSO</td></tr><tr><td>DiBAC&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;(3) (双-(1,3-二丁基巴比妥酸)三甲川氧杂吲哚)</td><td>Molecular Probes</td><td>B-438</td><td></td></tr><tr><td>碘化丙啶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4170</td><td>用去离子水配制</td></tr><tr><td>D-(+)-葡萄糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PowerLoad</td><td>Molecular Probes</td><td>P10020</td><td>100 倍浓缩液</td></tr><tr><td>丙磺舒</td><td>Molecular Probes</td><td>P36400</td><td>向一支 77 mg 的小瓶中加入 1 ml PBS 配制成 100 倍储备液</td></tr><tr><td>Fura-2/AM</td><td>Molecular Probes</td><td>F1221</td><td>特殊包装 (50 &amp;micro;g 分装)</td></tr><tr><td>PBFI/AM</td><td>Molecular Probes</td><td>P1267</td><td>特殊包装 (50 &amp;micro;g 分装)</td></tr><tr><td>尼日尔菌素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N7143</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>JT Baker</td><td>3246-01</td><td>一碱式</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>JT Baker</td><td>5565-01</td><td></td></tr><tr><td>K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>JT Baker</td><td>4012-01</td><td>二碱式</td></tr><tr><td>BCECF/AM</td><td>Molecular Probes</td><td>B1170</td><td>特殊包装 (50 &amp;micro;g 分装)</td></tr><tr><td>CCCP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>质子载体，可导致 H&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; 进入细胞质，消散膜电位和 H&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; 梯度</td></tr><tr><td>培养管&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>53283-802</td><td>适用于 Spectronic 分光光度计；硼硅酸盐玻璃</td></tr><tr><td>分光光度计</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Spectronic 20D+</td></tr><tr><td>15 ml 塑料锥形管</td><td>Corning</td><td>430790</td><td></td></tr><tr><td>透明 96 孔聚苯乙烯微孔板</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565-501</td><td></td></tr><tr><td>酶标仪</td><td>BioTek</td><td>Synergy 2 多功能</td><td></td></tr><tr><td>Gen5 软件</td><td>BioTek</td><td>Gen5&amp;trade; 软件</td><td></td></tr></tbody></table>

使用荧光染料监测streptococcus pneumoniae中的膜电位变化、膜完整性及细胞内离子浓度

Monitoring Changes in Membrane Polarity, Membrane Integrity, and Intracellular Ion Concentrations in Streptococcus pneumoniae Using Fluorescent Dyes

膜去极化与离子流是生物系统中被广泛研究的事件，因其能够深刻影响细胞功能，包括能量代谢和信号转导。尽管已有成熟的荧光和电生理方法（包括电极使用和膜片钳技术）用于检测真核细胞中的这些事件，但由于微生物体积微小，且细菌膜外具有更复杂的表面结构对细胞膜形成屏蔽，使得在微生物中检测类似事件的方法开发更具挑战性。在我们对死亡启动过程的研究中 肺炎链球菌 （肺炎链球菌），我们希望阐明膜事件的作用，包括膜电位、膜完整性和细胞内离子浓度的变化。查阅文献后发现，相关研究极为有限。其他研究者曾通过监测放射性同位素的摄取或平衡状态来测量离子流和膜电位，少数研究（主要集中在革兰氏阴性菌）曾成功使用羰花青类（carbocyanine）或氧杂醇类（oxonol）荧光染料检测膜电位，或利用细胞通透性的乙酰氧甲基（AM）酯形式的离子敏感性荧光指示剂染料对细菌进行负载。因此，我们建立并优化了用于革兰氏阳性菌中膜电位、膜破裂及离子转运检测的实验方案 S. pneumoniae 我们开发了使用双氧杂醇染料DiBAC的实验方案4(3) 以及细胞非渗透性染料碘化丙啶，分别用于检测膜去极化和膜破裂，同时包括优化肺炎链球菌负载Fura-2、PBFI和BCECF的乙酰甲氧基酯（AM酯）染料的方法，以检测细胞内Ca²⁺、K⁺和pH的变化2+，K+，和 H+分别使用荧光检测酶标仪进行检测。这些方案是针对肺炎球菌的首类方法，且其中大多数染料尚未在其他任何细菌物种中使用过。尽管我们的方案已针对 S. pneumoniae我们相信，这些方法应为其他细菌物种的类似研究提供一个极佳的起点。

所有实验中，每个孔内均含有一个样本和一组特定条件。因此，每条曲线代表随时间变化的整个细菌群体的荧光强度。结果应易于解读，处理样本与未处理对照样本的荧光信号之间应有明显区别。所观察到的荧光变化的动力学特征及其程度，可为被监测事件的可能机制和影响范围提供信息。
在研究膜电位时，需要将细菌与DiBAC共同孵育约40分钟，以使染料在膜上达到平衡，这一点可由处理前图1A中荧光信号持续下降并随后趋于平稳的现象表明。如图1B所示，PI不需要平衡过程，因其荧光信号在前40分钟孵育期间保持稳定；但PI与DiBAC同时使用有助于在监测膜电位的同时实时观察膜破裂情况。两种染料荧光强度的升高表明细菌发生了去极化和膜破裂。其他能够引起去极化和膜破裂的试剂，如去垢剂（脱氧胆酸钠18）、解偶联剂或离子载体（CCCP），也可加入以利用该方法演示这些事件。
对于 Fura-2/AM、PBFI/AM 和 BCECF/AM，计算两种荧光信号的比值，该比值的升...

与真核生物不同，目前关于细菌膜去极化及离子浓度变化的研究较少，这主要是由于细菌体积微小，使得传统的测量方法难以实施。本文详细介绍了利用荧光技术监测重要革兰氏阳性病原菌Streptococcus pneumoniae中此类事件的实验方案。

使用荧光染料监测Streptococcus pneumoniae中的膜电位变化、膜完整性及细胞内离子浓度

膜去极化与离子流是生物系统中被广泛研究的事件，因其能够显著影响……

以下实验的总体目标是利用荧光染料监测细菌系统中膜动力学和细胞内离子浓度的变化。该方法首先在细菌生长阶段将其与目标荧光染料共同孵育，直至染料在其膜两侧达到平衡。随后，用选定的处理剂对细菌进行处理，并监测其荧光信号的变化。结果可以显示膜去极化、膜完整性和细胞内离子浓度的变化，这些是基于指示染料荧光变化的观察得出的。与用于真核系统的传统电生理技术（如膜片钳）相比，该技术的主要优势在于现在可以利用荧光方法在细菌中监测膜动力学和细胞内离子浓度的变化。通常，初次接触该方法的研究人员会遇到困难，因为优化染料浓度需要一定的努力。上样条件与检测设置：首先从细菌细胞开始。将菌体沉淀先用洗涤液重悬，至少加入一毫升磷酸盐缓冲液（PBS），使菌液浓度达到每毫升一亿个菌落形成单位（CFU），此浓度足以进行五个样品的检测。取一毫升洗涤后的菌液转移至微量离心管中，加入25微升一摩尔的滤膜过滤溶液。将灭菌的葡萄糖储备液加入后，在37摄氏度的加热块中孵育细胞15分钟。所加入的葡萄糖量可根据实验需要进行调整。孵育15分钟后，加入5微升50微摩尔的死细胞染料（dieback）以及10微升PI溶液。用移液器将细胞上下吹打数次，充分混匀。然后将该细胞悬液分装至透明96孔板的五个样品孔中。将96孔板放入已预热、并设置为检测NADH磷酸二激酶（dieback NP）的酶标仪中。随后，每隔一分钟进行一次测量，持续 30 至 40 分钟，监测细胞膜上死细胞信号的平衡过程，直至读数稳定至处理前的水平。然后取出培养板，加入选定的实验处理试剂。立即将培养板放回检测仪，并继续监测死细胞信号和碘化丙啶（PI）荧光，持续所需的时间长度。在此实验步骤中配制上样缓冲液时，务必在加入 PBS 和丙磺舒前短暂涡旋混匀。加入这些溶液后，再次涡旋混匀，并用铝箔包裹，然后向一毫升两倍浓度的细胞悬液中加入一毫升两倍浓度的上样缓冲液。此用量适用于10个样品。将混合物置于37°C水浴中避光孵育75分钟，在所有这些检测中均需避光。染料浓度和孵育时间可能需要根据特定的细菌种类及其他实验体系变量进行调整，以优化检测效果和基础荧光检测水平。孵育结束后，每次洗涤均需清洗细胞三次。在2,400 ×g条件下离心10分钟收集细胞，并将其重悬于2毫升含1×普罗宁的PBS中。三次洗涤后，将细胞在37摄氏度下继续孵育30分钟。这使得细菌内部的酯酶能够水解染料的酯基，从而使染料在细胞内被激活。接下来，离心收集细胞，去除上清液，并将细胞重悬于含有1×丙磺舒的2毫升PBS中。如有需要，可重新加入葡萄糖以恢复细菌的能量状态。每份样品取200微升细胞悬液加入96孔板的一个孔中，并将该板放入预热好的酶标仪中进行单个样品检测。首先，在适当的波长下，以每秒一次的频率进行一分钟的基线读数测定。然后取出培养板，加入约五微升（5 µL）选定的处理试剂。迅速用移液器上下吹打数次以混匀处理液，立即放回检测仪中。继续按所需时间进行检测。数据分析时，将每个时间点的荧光值相除（值一除以值二）计算比值，并将比值绘制成图表。准备过程中，配制一系列含高浓度钾的缓冲液，共五到六种，pH 值范围为 6.5 至 8.0。与之前步骤相同，使用涡旋振荡器处理来自对数中期培养物洗涤后的样品，并浓缩细胞。随后用 2 毫升 BS 替换 SNAT，以制成 4 倍浓度的细胞悬液。将1毫升四倍细胞悬液与1毫升两倍上样缓冲液混合。随后将细胞置于30°C水浴中孵育40分钟。避光操作。现在将细胞洗涤三次。按照之前所示方法离心收集细胞。加入含有2×丙苯（prop Benin）和1毫摩尔葡萄糖的4毫升PBS缓冲液，三次洗涤后再次进行离心。将细胞在37摄氏度下继续孵育五分钟。为确定背景荧光滤光片，对约500微升活化后的细菌悬液进行灭菌处理以去除细菌。然后将200微升滤液转移至96孔板中，并对该孔的吸光度进行一分钟的测定。为了获得体内校准曲线，将500微升已加载并激活的ALI watts细胞离心，重新悬浮于一系列不同pH值的高钾缓冲液中。向每个样品加入20微摩尔的红霉素，使细胞内pH值与周围缓冲液的pH值达到平衡。然后将样品在 37 摄氏度下孵育 5 分钟。孵育结束后，将样品转移至酶标仪中的 96 孔板。对每个样品的荧光值测量数分钟，以建立每个孔的基准读数。分析数据时，首先减去背景荧光值，然后通过将“值一”除以“值二”来计算荧光值的比值。将每个pH缓冲液对应的比值绘制成图，以生成校准曲线，用于测量细胞内pH的变化。将200微升的活化细胞样品加入到孔板中，每5秒测量一次荧光，持续5分钟。同时，向一个样本中加入10微摩尔的CCCP，而向其他样本中加入感兴趣的试剂。CCCP作为降低细胞内pH的时间同步阳性对照。立即将培养板放回检测仪，并继续每5秒检测一次荧光，持续10分钟。作为额外对照，向所有样品中加入 20 微摩尔的 NI garrison，使细菌的 pH 值与缓冲液平衡，持续五分钟。在研究膜电位时，需将细菌与染料避光孵育约 40 分钟，以使染料在膜上达到平衡。这一过程表现为荧光信号持续稳定下降直至趋于平稳。PI 不需要平衡，但与退缩现象一起，可用于监测膜破裂。细菌的极性丧失、去极化及破裂表现为两种染料的荧光强度上升，持续时间少于凌晨2:00，通过计算两种荧光信号的比值，该比值的升高或降低对应于细胞内钙离子浓度的变化。PBFI 则通过荧光比值法测定细胞内钾离子浓度。使用B-C-E-C-F am的荧光比值来测量细胞内氢离子浓度。加入钙离子载体离子霉素后，钙离子流入细胞，导致荧光比值升高。加入缬氨霉素则产生相反效应，引起钾离子流出细胞，表现为荧光比值下降。B-C-E-C-F 可用于测量细胞内 pH 值，首先需在已知 pH 值的不同缓冲液中绘制校准曲线。染料的荧光比值降低表明 pH 值下降。如图中黑色曲线所示，在加入质子载体 CCCP 后可观察到该现象；加入质子动力势解偶联剂后，如蓝色曲线所示，同样出现该变化。第二个箭头表示添加尼辛，这会平衡细胞内外的氢离子浓度。观看本视频后，您应能充分理解如何测量细菌细胞的膜去极化、膜完整性和细胞内离子浓度。您还应能够利用本方案作为起点，研究其他细菌特性。

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