监测改变膜极性，膜完整性和细胞内离子浓度肺炎链球菌使用荧光染料

以下实验的总体目标是利用荧光染料监测细菌系统中膜动力学和细胞内离子浓度的变化。这是通过在细菌的生长期首先用感兴趣的荧光孵育细菌，直到它在它们的膜上平衡来实现的。接下来，用所选试剂处理细菌并监测其荧光。

根据观察到的指示染料荧光变化，结果可以显示膜去极化、膜完整性和细胞内离子浓度的变化。与传统的电生理学技术（如真核系统中使用的膜片钳）相比，该技术的主要优点是现在可以使用荧光灯监测细菌中膜动力学和细胞内离子浓度的变化。一般来说，刚接触这种方法的人会很挣扎，因为需要付出一些努力来优化染料浓度。

上样条件和检测设置从细菌细胞开始。仅在洗涤溶液中沉淀，首先将沉淀重悬于至少 1 毫升 PBS 中，每毫升 1 亿 CFU，这足以用于 5 个样品。将 1 毫升洗涤过的细胞转移到微量离心管中，并加入 25 微升的一摩尔过滤器。

然后将灭菌的葡萄糖储备液将细胞在 37 摄氏度的加热块中孵育 15 分钟。添加的葡萄糖可能因实验而异。15 分钟后，加入 5 微升 50 微摩尔的死回水和 10 微升的 PI 溶液。

通过上下吹打数次来彻底混合细胞。然后将该细胞悬液分成透明 96 孔板的 5 个样品孔中。将板加载到预热的读板器套件中，用于检测 Dieback NP

现在通过在 30 到 40 分钟内每分钟测量一次来监测细胞膜上的死回平衡，直到读数稳定到其预处理值。然后弹出板并添加所选的实验试剂。立即将板放回读数仪，并在所需的时间内继续监测死回病和 PI 荧光。

为此过程准备上样缓冲液时，请务必在添加 PBS 和丙磺舒之前短暂涡旋。加入这些溶液后，再次涡旋，并用箔纸包裹成 1 毫升 2 x 细胞悬液。加入 1 毫升 2 x 上样缓冲液。

这足以容纳 10 个样品。将混合物在 37 摄氏度的水浴中孵育 75 分钟，避光贯穿所有这些分析过程。可能需要调整染料浓度和孵育时间，以优化测定和基线荧光检测水平，具体取决于特定的细菌种类和其他实验系统变量。

孵育后，每次洗涤细胞 3 次。将细胞以 2， 400 G 沉淀 10 分钟，然后将它们重悬于含有 1 个 x pronic 的 2 mL PBS 中。洗涤 3 次后，将细胞在 37 摄氏度下再孵育 30 分钟。

这使得细菌内的雌激素能够水解染料的酯基，使染料在细胞内活跃。接下来沉淀，细胞去除 snat 并将它们悬浮在含有 1 x 丙磺舒的两毫升 PBS 中。如果需要，现在可以重新添加葡萄糖以重新激发细菌，将 200 微升细胞加载到每个样品的 96 孔板的一个孔中，然后将板加载到一个样品的预热读数仪中。

首先，以适当的波长和每秒 1 个读数的速率建立基线读数，持续 1 分钟。然后取出板并加入约 5 微升所选处理剂。对那个。

快速上下移液几次以混合处理物，然后立即将板放回阅读器。在所需时间内继续进行测量。要分析数据，请通过将值除以 1 除以值 2 来计算每个时间点的荧光值的比率，并将比率值绘制在图表上。

在制备过程中，制备一系列 pH 值为 6.5 至 8.0 的高钾缓冲液，包括 5 或 6 种高钾缓冲液。与前面的程序一样，使用涡旋从中期对数期培养洗涤液中制备 2 x 上样缓冲液，并浓缩细胞。然后用 2 毫升 BS 替换 SNAT，制成 4 x 细胞悬液。

将 1 mL 的 4 x 细胞悬液与 1 mL 的 2 x 上样缓冲液混合。现在将细胞在 30 摄氏度的水浴中孵育 40 分钟。避光保存。

现在洗涤细胞 3 次。如前所述沉淀细胞。加回 4 毫升含有 2 个 x prop Benin 和 1 毫摩尔葡萄糖的 PBS，并在 3 次洗涤后重复离心。

将细胞在 37 摄氏度下再孵育 5 分钟。要确定背景荧光滤光片，请对约 500 微升带电的细菌悬浮液进行消毒以去除细菌。然后将 200 微升滤液转移到 96 孔板中，并测量该孔的吸收情况一分钟。

为了获得体内校准曲线，将加载和通电的细胞和复苏器的 500 微升 ALI 瓦特旋转。将它们悬浮在一系列不同 pH 值的高钾缓冲液中，向每个样品中加入 20 微摩尔的 risin。这使得细胞的细胞内 pH 值与周围缓冲液的 pH 值保持平衡。

然后将样品在 37 摄氏度下孵育 5 分钟。孵育后，将样品转移到读板器中的 96 孔板中。测量每个样品的荧光几分钟，以确定每个样品的研究读数。井。

要分析此数据，请减去背景荧光值，然后通过除以值来计算荧光值的比率。逐个值 2 绘制每种 pH 缓冲液的比率值，以创建校准曲线以测量细胞内 pH 值的变化。将 200 微升带电细胞样品装入板中，每 5 秒测量一次荧光，持续 5 分钟。

同时，向一个样品中加入 10 微摩尔 CCCP，同时向其他样品中加入目标试剂。CCCP 是一种时间对齐的阳性对照，用于降低细胞内 pH 值。立即将板放回读数仪，并继续每 5 秒测量一次荧光，持续 10 分钟。

作为附加对照，向所有样品中加入 20 微磨牙 NI 加里森，以使细菌的 pH 值与缓冲液的 pH 值再平衡 5 分钟。在探索膜极性时，需要将细菌与回模孵育约 40 分钟，以使染料在膜上平衡。这可以通过荧光的稳定下降来证明。

PI 不需要平衡，但与枯萎一起，它有助于监测膜破裂。同时，细菌的极性、去极化和破裂由两种染料的荧光强度增加表示，持续 2：00 AM，计算两种荧光信号的比率，并且该比率的增加或减少对应于细胞内钙。对于 PBFI am，通过荧光比值测量细胞内钾。

使用 B-C-E-C-F am 的荧光比率测量细胞内氢。添加钙 iono 后，四离子霉素钙流入细胞，导致荧光比增加。添加 valmy 具有相反的作用，导致钾流出细胞，这由荧光比的降低表示。

B-C-E-C-F 允许测量细胞内 pH 值，首先在已知 pH 值的各种缓冲液中制作校准曲线。染料荧光比的降低对应于 pH 值的降低。这可以通过添加力质子 CCCP（黑线）和添加质子动力耗散器后看到蓝线。

第二个箭头显示了 nisin 的添加，它平衡了细胞内和细胞外的氢浓度。观看本视频后，您应该对如何测量细菌细胞中的膜去极化、膜完整性和细胞内离子浓度有很好的了解。您还应该能够使用此方案作为研究其他特性和细菌细胞的起点。