利用肌成纤维细胞构建纤维蛋白基组织工程支架并施加约束与应变以诱导细胞和胶原的重排

本实验的总体目标是构建基于纤维蛋白的结构，用于研究细胞和胶原的重排。首先从供体组织中分离人隐静脉细胞并在培养中扩增，以此实现该目标。第二步是将魔术贴条粘附到柔性膜上。

在六孔板底部，通过在中心区域形成一个方形空间以容纳构建物。接下来，将纤维蛋白原、凝血酶、细胞以及荧光标记的微珠混合物加入到魔术贴条带之间的空间中，并使其聚合形成凝胶。最后一步是通过施加单轴周期性应变或释放静态应变，对细胞进行培养并诱导定向基质的形成。

通过沿单一方向将纤维蛋白凝胶从魔术贴柱上剪下。最终，可通过随时间使用共聚焦显微镜监测构建物，获得描述细胞和胶原重新排列变化的结果。该方法有助于回答胶原重塑领域中的关键问题，例如不同类型细胞形成和重新定向胶原的速度。

首先，根据材料二次使用的相关指南，获取来自大隐静脉的人体供体组织。然后按照 Schnell 等人的方案从组织中分离人静脉大隐静脉细胞（H VSCs），并在液氮中保存。使用时，将一管含有 250,000 个快速复苏的 H VSCs 的细胞悬液接种至含 15 毫升预温培养基的 T75 培养瓶中进行扩增培养。

培养基由440毫升高糖DMEM、50毫升胎牛血清、5毫升100倍青霉素-链霉素溶液和5毫升200毫摩尔L-谷氨酰胺组成。每两到三天更换一次培养液，持续约两周，直至细胞达到汇合状态。

待细胞融合后，使用胰蛋白酶消化并传代培养，最多传至第九代，直至获得计划实验所需的足够数量细胞。每个构建体大约需要150万个细胞。

当细胞生长至足够数量时，在细胞融合度达到90%时收集细胞，然后将细胞重悬于生长培养基中，浓度为每毫升1500万个细胞。将细胞置于冰上保存，直至使用。通过将弹性体与固化剂按10:1的比例混合，制备硅胶胶水。

使用该胶水将从魔术贴软面裁剪下的7毫米×3毫米条带粘附至Flex Cell培养板的柔性膜上。为形成具有开放中心的十字形结构，将硅胶在60摄氏度的烘箱中过夜干燥，以确保胶水充分固化。随后，向每孔加入5毫升70%乙醇，在室温下孵育30分钟，对培养板进行灭菌处理。

用无菌 PBS 清洗孔板三次。然后从孔中移除 PBS 和魔术贴条带。将孔板置于超净台的紫外灯下，不加盖，照射 30 分钟，以对表面进行灭菌。

完成后，盖好培养板，并保持无菌状态直至使用。接下来，在培养的前七天内，通过向500毫升生长培养基中加入130毫克蒜酸二磷酸酯来制备组织工程培养基。同时，添加1毫克/毫升的ε-氨基己酸以防止纤维蛋白降解，并通过轻轻混匀将纤维蛋白原溶解于含氨基己酸的组织工程培养基中，使其实际蛋白浓度达到10毫克/毫升。

然后进行无菌处理。将纤维蛋白原溶液通过0.22微米注射器滤器过滤，并置于冰上保存备用。接着，用组织工程培养基（添加氨基己酸）将储存的凝血酶稀释至终浓度为每毫升10个国际单位，配制凝血酶溶液，并置于冰上保存备用。

接下来，为将要制备的每种组织构建体，取100微升之前制备的细胞悬液，放入微量离心管中。以350 × g离心7分钟，弃去上清液，将细胞重悬于50微升凝血酶溶液中，并加入4微升蓝色荧光聚苯乙烯微球，作为内部参照标记物。接着，用移液枪吸头吸取50微升纤维蛋白原溶液。

将移液器体积调至100微升，然后将50微升纤维蛋白原溶液移入离心管中。将凝血酶与细胞混合物加入后，轻轻吸取100微升混合液，使凝血酶与纤维蛋白原充分混合，以避免产生气泡。溶液充分混匀后，迅速将凝胶混合物滴加至魔术贴条之间，因为纤维蛋白凝胶在混合后的典型凝胶时间约为20秒。将构建物置于37°C、5%二氧化碳、加湿的缓冲培养箱中孵育30分钟，使其充分凝胶化。

然后向每个孔中加入含有氨基己酸的六毫升组织工程培养基，并将培养板放回培养箱中。在最初七天内，每两到三天更换一次培养基。一周后，从培养基中去除氨基己酸添加剂，并继续使用组织工程培养基培养凝胶。

在培养的前五天内，仍需每两到三天更换一次培养液，使构建物在静态应变下收缩并重新排列，由于纤维的限制，形成双轴取向的胶原纤维，从而在静态条件下诱导胶原蛋白向单一方向重排。首先，在第12天将细胞再培养一周，然后沿单一方向将组织构建物从两条魔术贴上剪下。这将导致纤维蛋白收缩时在相反方向产生应变。

或者，对于循环加载，可在第六天将培养板放置在配备有垫圈的 Flexcell 基板上的一组加载柱顶部；这些加载柱将支撑孔内柔性膜，并允许将柱的底部向下牵拉，从而在单一方向上产生应变。接下来，设置软件程序以对构建物施加循环应变。此处显示的程序为模拟正弦波的间歇性应变，以每赫兹的频率在零至5%应变之间对构建物进行三小时加载，随后交替进行三小时休息。

程序准备就绪后，打开真空泵并启动程序。控制器将调节系统内的真空强度，使膜在支撑柱周围受到牵拉，从而根据程序对构建物施加周期性应变。运行程序一周，每两至三天更换一次培养基；在一周的条件培养后，通过将矩形柱旋转90度改变应变方向，再持续三天以诱导胶原蛋白重排。

为了可视化实时的胶原蛋白动态重塑过程，加入细胞追踪染料橙色（cell tracker orange），终浓度为4微摩尔（4 µM），用于染色细胞质；同时加入CNA 35 OG 4 88，终浓度为1微摩尔（1 µM），用于可视化胶原纤维。

这些探针不会影响细胞活力或胶原蛋白的形成。随后将细胞在37摄氏度的培养箱中孵育一小时。孵育结束后，从培养箱中取出培养板，并将其转移至共聚焦激光扫描显微镜，以观察细胞和胶原蛋白。

在凝胶表面以及深入支架约60微米的范围内拍摄图像，以观察这些层次上随时间推移的结构变化。然后将培养板放回培养箱内的机械刺激装置中。每隔几天重复此操作，以追踪细胞在刺激作用下重新组织的进展情况。

聚合前添加到纤维蛋白原混合物中的荧光微球会被困在纤维蛋白网络中，在静态培养条件下可作为良好的参照标记物，用于确保在不同时间点观察同一区域，并附着于全部四个支点。在切断两个纤维支点连接三天后，无法观察到明显的纤维或细胞取向。由收缩引起的单轴应变使绿色显示的胶原纤维排列整齐。

此处显示的是经单向周期性拉伸一周的人体大隐静脉细胞，位于构建物表面及凝胶内60微米深处。当拉伸方向旋转90度后，发现三天后细胞在表面的响应比在组织核心更快。一旦掌握工程技术，这些基于FI的组织构建物可在约两小时内完成。