肌成纤维细胞和约束的应用工程纤维蛋白的组织结构和应变诱导细胞和胶原蛋白（RE）组织
October 28th, 2013
这个模型系统开始从填充的成肌纤维细胞的血纤维蛋白凝胶，可用于研究内源性的胶原蛋白（重）非破坏性的方式组织实时。系统的模型是非常可调谐的，因为它可以用不同的细胞来源，培养基添加剂，可以容易地适应具体需要。
该程序的总体目标是创建可用于研究细胞和胶原蛋白重组的基于纤维蛋白的构建体。这是通过首先从供体组织中分离人静脉大隐细胞并在培养物中扩增来实现的。第二步是将 Velcro 条粘在柔性膜上。
在六个孔板的底部，在中心创建一个方形空间，该空间将容纳结构体。接下来，将纤维蛋白原凝血酶细胞和荧光标记珠子的混合物添加到 Velcro 条带之间的空间中，并使其聚合形成凝胶。最后一步是通过对结构体施加单轴循环应变或释放静态应变来调节细胞并诱导定向基质形成。
通过沿单个方向从 Velcro 柱上修剪纤维蛋白凝胶。最终，通过使用共聚焦显微镜监测构建体随时间的变化，可以获得描述细胞和胶原蛋白重组变化的结果。这种方法可以帮助回答胶原蛋白重塑领域中与不同细胞类型的胶原蛋白形成和重新定位速度有关的关键问题。
首先，根据材料的二次使用指南从静脉 saana magna 获取人类供体组织。然后按照 Schnell 等人的方案从组织中分离人静脉隐静脉细胞或 H VSC，并将它们储存在液氮中。需要时，将一个含有 250， 000 个快速解冻 H VSC 的小瓶放入具有 15 mL 预热生长的 T 75 培养瓶中，以扩增细胞。
由 440 毫升高级 DMEM、50 毫升胎牛血清组成的培养基。5 毫升 100 X 笔链球菌和 5 毫升 200 毫摩尔 L glut max。每 2 到 3 天更换一次生长培养基，持续大约两周，直到细胞汇合。
汇合后，收获并分流细胞直至传代。九。使用胰蛋白酶，直到有足够数量的细胞用于计划的实验。每个构建体大约需要 150 万个细胞。
当生长出足够数量的细胞时，以 90% 的共流畅度收获它们，然后以每毫升 1500 万个细胞的速度将细胞悬浮在生长培养基中。将它们放在冰上，直到需要为止。将弹性体和固化剂以 10 比 1 的比例混合，制备硅胶。
使用这种胶水将从 Velcro 的柔软面捕获的 7 毫米 x 3 毫米的条带连接到柔性细胞板的柔性膜上。要形成中心开放的十字形，请将硅胶在 60 摄氏度的烤箱中干燥一夜，以确保胶水硬化。然后向每个孔中加入 5 毫升 70% 乙醇，并在室温下孵育 30 分钟，对板进行消毒。
用无菌 PBS 冲洗孔 3 次。然后从孔和 Velcro 条中取出 PBS。将未覆盖的板放在组织培养罩的紫外线灯下 30 分钟，以对表面进行消毒。
完成后，盖上板并保持无菌直至使用。接下来，在培养的前 7 天，通过在 500 毫升生长培养基中加入 130 毫克大蒜酸、两种磷酸盐来制备组织工程培养基。此外，每毫升 ε 氨基己酸加入 1 毫克，以防止纤维蛋白降解，轻轻混合，将纤维蛋白原溶解至每毫升补充氨基己酸的组织工程培养基中 10 毫克实际蛋白质的浓度。
然后无菌。通过 0.22 微米注射器过滤器过滤纤维蛋白原溶液，并将其储存在冰上直至使用。接下来，通过在补充有氨基己酸的组织工程培养基中将凝血酶储备液稀释至每毫升 10 国际单位的最终浓度来制备凝血酶溶液，并将其储存在冰上直至使用。
接下来，将 100 微升细胞悬液制备到将要制备的每个组织构建体的微量离心管中。将细胞以 350 倍 G 离心 7 分钟，然后弃去上清液，将细胞重悬于 50 μL 凝血酶溶液中，并加入 4 μL（一种蓝色荧光聚苯乙烯微球）用作内部参考标记物。接下来，将 50 微升纤维蛋白原溶液吸入移液器吸头中。
将移液管的体积增加到 100 微升，然后将 50 微升纤维蛋白原溶液移液到离心管中。使用凝血酶和细胞混合物，吸取 100 μL 混合物，将凝血酶和纤维蛋白原轻轻混合在一起，以防止气泡形成。溶液充分混合后，将凝胶混合物移液到魔术贴条中和之间，我们很快就达到了纤维蛋白凝胶的典型凝胶时间，混合后大约需要 20 秒，将构建体在 30 摄氏度下在 37 摄氏度下在加湿的 5% 二氧化碳缓冲培养箱中孵育 37 分钟，让它们凝胶化。
然后向每个孔中加入 6 mL 含氨基己酸的组织工程培养基，并将板放回培养箱中。在前 7 天内，每 2 到 3 天更换一次介质。一周后，从培养基中去除氨基己酸补充剂，并继续用组织工程培养基培养凝胶。
在培养的前五天仍然每两到三天交换一次，允许构建体在静态应变下压实和重组，形成胶原纤维，由于纤维约束，在静态条件下沿单个方向诱导胶原重组。首先，在第 12 天将细胞再培养一周，沿单个方向从两个 Velcro 条上切下松散的组织构建体。当纤维蛋白压实时，这将导致相反方向的应变。
或者，对于循环加载，将板放在柔性单元底板中的一组加载柱的顶部，在第 6 天配备垫圈，加载柱将支撑孔的柔性膜，并允许柱的底部被拉下以产生单一方向的应变。接下来，设置软件方案以将循环应变应用于构建体。此处显示的程序适用于类似于正弦波的间歇性应变，在 1 赫兹下将结构从 0 应变应变到 5% 应变，持续 3 小时，交替休息 3 小时。
准备好程序后，打开真空泵并启动程序。控制器将调节系统中的真空强度，该系统会拉下支撑柱周围的膜，以根据程序对结构施加循环应变。运行该程序一周，注意在调节一周后每两到三天更换一次培养基，通过将矩形柱旋转 90 度以改变应变方向来诱导胶原蛋白重组三天。
要可视化活跃的实时胶原蛋白重塑，请添加 Cell Tracker orange。加入浓度为 4 微摩尔的细胞质和 CNA 35 OG 4 88 染色。添加一微摩尔的浓度以观察胶原纤维。
这些探针不会干扰细胞活力或胶原蛋白的形成。然后将细胞在 37 摄氏度的培养箱中孵育 1 小时。孵育后，从培养箱中取出培养板并将其运输到共聚焦激光扫描显微镜中，以观察细胞和胶原蛋白。
在支架表面和高达 60 微米的凝胶中拍摄图像，以查看这些水平的组织随时间的变化。然后将板放回培养箱内的机械调节装置中。每隔几天重复此过程，以跟踪响应刺激的细胞重组进度。
在聚合之前添加到纤维蛋白原混合物中的荧光微球被包埋在纤维蛋白网络中，并作为参考标记物很好地工作，以确保在静态条件下培养时在不同时间点观察同一区域并连接到所有四个柱上。修剪两个光纤柱连接三天后，看不到真正的纤维或蜂窝方向。收缩引起的单轴应变使胶原纤维对齐，显示为绿色。
已沿单个方向循环应变一周的人静脉大隐细胞在此处显示在构建体表面和 60 微米凝胶中。当应变方向旋转 90 度时，发现三天后细胞反应在表面比在组织核心更快。一旦掌握了工程设计，这些基于 FI 的组织构建可以在大约两个小时内完成。
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概述
本研究提出了一种模型系统，利用含有肌成纤维细胞的纤维蛋白凝胶以非破坏性方式研究实时胶原重组。该系统具有适应性，允许在细胞来源和培养基添加剂方面进行变化，以满足特定的研究需求。
关键研究组成部分
科学领域
- 细胞生物学
- 组织工程
- 胶原重塑
背景
- 基于纤维蛋白的构建物对于研究细胞和胶原相互作用非常有价值。
- 了解胶原重组对于深入了解组织修复和纤维化至关重要。
- 肌成纤维细胞在胶原重塑中扮演着重要角色。
- 实时监测技术增强了对动态生物过程的研究。
研究目的
- 开发一种创建纤维蛋白构建物的方法，以便研究胶原重组。
- 研究不同细胞类型对胶原形成和定向的影响。
- 提供一个平台，用于实时观察细胞和胶原动力学。
使用的方法
- 人静脉伏状细胞的分离和培养。
- 使用凝血酶和纤维蛋白原制备纤维蛋白凝胶。
- 应用周期性或静态应变以诱导胶原重组。
- 使用共聚焦显微镜随时间监测变化。
主要结果
- 该方法成功创建了纤维蛋白构建物，允许研究胶原动力学。
- 实时成像揭示了胶原定向和细胞行为的显著变化。
- 不同细胞类型对胶原重组速度表现出不同的效果。
- 该系统展示了基于特定研究问题进行定制实验的潜力。
结论
- 该模型系统是研究胶原重塑的多功能工具。
- 研究结果有助于深入理解组织工程和修复机制。
- 该方法可以适应细胞生物学领域的各种实验需求。
常见问题
Executive Industry Relevance
This model system enables biopharma researchers to study collagen reorganization under controlled mechanical loading, supporting target validation in fibrosis and tissue repair. Real-time imaging of cellular and matrix dynamics provides quantitative readouts for mechanistic de-risking of anti-fibrotic candidates. The tunable platform facilitates assay development for screening compounds that modulate myofibroblast activity and collagen architecture.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses on collagen remodeling pathways in fibrotic diseases.
- Operational Value: Enables biological de-risking by visualizing target engagement effects on matrix reorganization.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by correlating compound effects with collagen alignment metrics.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Provides standardized fibrin constructs for reproducible compound testing.
- Quantitative Outputs: Generates measurable collagen reorganization endpoints via time-lapse confocal imaging.
- Scalability: Adaptable construct size and strain parameters support medium-to-high throughput screening.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models human venous saphenous myofibroblast responses to mechanical strain, relevant to vascular fibrosis.
- Translational Continuity: Bridges discovery mechanisms to preclinical validation of anti-remodeling therapies.
- Risk-Adjusted Decisions: Informs go/no-go criteria based on dose-dependent collagen alignment changes.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery to preclinical workflows, enabling hypothesis testing, assay readiness, and data-driven advancement decisions.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification by linking mechanical stimuli to collagen reorganization dynamics.
- Screening: Delivers assay standardization and reproducible quantitative matrix readouts for compound evaluation.
- Analytics: Provides time-resolved collagen orientation and cellular tracking data for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects in vitro remodeling observations to preclinical fibrosis models through conserved cellular mechanisms.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for studying mechanosensitive targets across fibrosis indications.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in collagen remodeling.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through constrained gel geometry and internal reference markers.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early go/no-go decisions based on matrix-level phenotypes.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of compounds demonstrating dose-dependent collagen reorganization inhibition.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary cell isolation, fibrin gel preparation, and confocal microscopy.
- Needs access to Flexcell FX4000T strain application equipment and time-lapse imaging systems.
- Demands cross-team standardization for strain protocols, media conditions, and image analysis pipelines.
- Involves adaptation considerations when translating findings from venous saphenous cells to other fibrosis-relevant myofibroblast sources.
- Practical limitations include gel compaction variability and the need for careful strain calibration to avoid construct detachment.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:40
Culture of Human Vena Saphena Cells
3:18
Engineering of Fibrin-based Tissue Constructs
7:23
Applying Strain and Inducing Changes in Stain and Constraints
9:25
Visualizing Cells and Collagen
10:43
Results: Changes in Cellular and Matrix Alignment Due to Controlled Strain
11:55
Conclusion
