Name: 肌成纤维细胞和约束的应用工程纤维蛋白的组织结构和应变诱导细胞和胶原蛋白（RE）组织 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-28T21:45:00.000+00:00
Duration: 12 min 13 s
Description: 了解利用肌成纤维细胞-纤维蛋白凝胶模型研究实时胶原蛋白重组的方法。该技术通过共聚焦显微镜监测细胞与胶原动态变化，为组织工程和纤维化研究提供可调控的实验平台。

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本研究是在生物医学材料（BMM）研究所的研究项目中完成的。BMM 由荷兰经济事务、农业与创新部共同资助。谨此感谢荷兰心脏基金会（Nederlandse Hartstichting）提供的资金支持。

1. 人隐静脉细胞的培养
<ol>
	<li>根据 Schnell 等9 的方案，按照二次使用材料的相关指南，从供体获取的大隐静脉中分离细胞，并将这些细胞储存于液氮中。取自一位供体的大隐静脉组织切成 2 × 2 mm 的小片，接种于六孔板中进行培养，每孔放入 2 块组织。通常可获得足够细胞，冻存约 3 瓶，每瓶含 0.25 × 106 个细胞于液氮中。人静脉平滑肌样细胞（HVSCs）被表征为肌成纤维细胞，表现为表达波形蛋白（vimentin），不表达结蛋白（desmin），且有一亚群表达 α-平滑肌肌动蛋白10。接下来开始从液氮中复苏细胞的实验流程，以扩增细胞数量。</li>
	<li>将一&#160;瓶细胞转移至 T75 组织培养瓶中，加入生长培养基（GM），培养基成分为 Advanced DMEM、50 ml 胎牛血清（FBS）、5 ml 青霉素/链霉素和 5 ml L-谷氨酰胺（L-glutamax）。每 2–3 天更换一次培养基。</li>
	<li>细胞大约在 14 天后达到融合状态。将 0.5 × 106 个细胞分装至一&#160;瓶中，储存于液氮中，记为第 1 代（passage 1）。</li>
</ol>
注意：收获 HVSCs 时无需冷冻细胞，冷冻仅用于储存。
<ol start="4">
	<li>将一个&#160;冻存管中的HVSCs接种至一个T175培养瓶中，并加入生长培养基（GM）。每2-3天更换一次培养基。细胞约7天后达到汇合状态。将3 × 106 个细胞分装至一个&#160;冻存管中，置于液氮中保存，记为第2代。</li>
	<li>将一个&#160;冻存管中的细胞接种至一个旋转培养瓶中，并加入生长培养基（GM）。每2-3天更换一次培养基。细胞约8天后达到汇合状态。一个旋转培养瓶中约含有20-30 × 106 个细胞。细胞培养至第6代为止。请勿使用超过第9代的细胞，因为细胞表型可能发生改变。</li>
</ol>
2. 基于纤维蛋白的组织构建物的构建
<ol>
	<li>通过将弹性体与固化剂按10:1的比例混合来制备硅胶。裁剪7 × 3 mm的矩形魔术贴片。将魔术贴粘附于6孔培养板中带有柔性膜&#160;的位置，呈十字交叉排列，并在魔术贴条之间留出3 mm的方形空间。</li>
</ol>
注意事项：仅使用魔术贴的柔软面，并将此面朝上放置。粘贴魔术贴时，仅在魔术贴上涂抹硅胶，不要将胶水扩散至整个孔内。由于培养板底部为硅胶膜，需在孔板下方放置支撑物以加固柔性的膜，确保能够顺利将魔术贴粘接到板上。
<ol start="2">
	<li>将硅胶在60 °C的烘箱中过夜干燥，以确保胶体完全硬化。通过向孔中加入70%乙醇（EtOH）并孵育30分钟进行灭菌。用PBS冲洗3次，并彻底移除孔内及魔术贴上的所有PBS。置于紫外线下照射30分钟，之后保持无菌状态直至使用。</li>
	<li>制备组织工程培养基（TM），其成分为基础培养基（GM）和130 mg L-抗坏血酸-2-磷酸盐。</li>
	<li>向TM中添加1 mg/ml ε-氨基己酸（ACA）。ACA用于培养的前7天，以防止纤维蛋白降解11。也可选用抑肽酶替代。</li>
	<li>为防止结块形成，在打开前使纤维蛋白原升至室温。无结块时纤维蛋白原更易溶解。将纤维蛋白原溶解于含ACA的TM中，使其实际蛋白浓度达到10 mg/ml7。对纤维蛋白原溶液进行无菌过滤，可能需要使用多个滤器。使用前置于冰上保存。</li>
</ol>
注意：溶解纤维蛋白原时应轻柔混匀，以防止产生过多泡沫。
<ol start="6">
	<li>将凝血酶溶解于含ACA的TM7中，使其浓度为10 IU/ml。使用前置于冰上保存。</li>
</ol>
注意：需将凝血酶和纤维蛋白原置于冰上保存，以防止其过早凝胶化。
<ol start="7">
	<li>用胰蛋白酶消化细胞，重悬于生长培养基中并计数。</li>
	<li>使用 15 x 106 细胞/ml，用于接种基于纤维蛋白的组织构建物（浓度依据组织工程心脏瓣膜的方法）7)。单个凝胶包含100 μl凝胶溶液，因此含有1.5 × 106 细胞。加入 1.5 x 106 将细胞分装至多个离心管中，离心管数量与将要制备的凝胶数量相同。</li>
	<li>以 350 × g 离心 7 分钟，弃去上清液。将细胞重悬于 50 μl 凝血酶中。向该悬液中加入 4 μl 蓝色荧光聚苯乙烯微球。取 50 μl 纤维蛋白原置于样品管中。用移液器吸取含细胞的 50 μl 凝血酶溶液，将移液器体积调至 100 μl。将含细胞的 50 μl 凝血酶溶液移入含纤维蛋白原的样品管中，混匀凝血酶与纤维蛋白原后，再将 100 μl 混合液吸回移液器中。</li>
</ol>
注意：荧光聚苯乙烯微球用作图像分析的内部参照标记。混合凝血酶和纤维蛋白原时，应小心移液以避免产生气泡。气泡会导致纤维蛋白凝胶中出现孔洞。
<ol start="10">
	<li>将凝胶混合物用移液器加入魔术贴条之间。纤维蛋白凝胶在各组分混合后的典型凝胶化时间约为20秒。</li>
</ol>
注意事项：应尽快操作，以防止混合物在移液至孔板前发生凝胶化。在使用细胞和微珠前请先进行练习。
<ol start="11">
	<li>将悬浮液在37 °C、含95%空气/5%&#160;CO2的湿润培养箱中孵育30分钟，待凝胶形成后再加入含ACA的培养基TM。</li>
	<li>前7天内每2-3天更换一次含ACA的TM。一周后凝胶已足够稳定，可不再使用ACA继续培养；此后每2-3天更换一次TM，每孔加入6 ml TM。至第12天，细胞已产生足够多的胶原可用于观察。</li>
</ol>
3. 施加应变并诱导应变和约束的变化
<ol>
	<li>由于细胞牵引和收缩，细胞会直接施加静态应变12。为诱导胶原重组，将组织构建体从某一方向上的两条尼龙搭扣带上剪下，从而形成单向约束（图1A）。该操作应在第12天进行，因为此时构建体已足够稳定，且胶原已沉积完成。</li>
	<li>通过Flexcell FX4000T系统对带有柔性膜的培养板底部施加真空，以施加循环应变。将培养板放置在基板上，并置于加载柱（属于循环加载装置的一部分）上方。泵对膜施加真空，从而将膜拉伸至其下方的矩形柱上。由于组织构建体通过尼龙搭扣以十字形方式固定在膜上，且下方存在矩形柱，所施加的循环应变为单轴方向（图1B）。</li>
	<li>最初采用静态培养5天，以获得初步的机械完整性，之后从第6天开始施加循环应变。将循环应变程序设定至真空泵控制器中。例如，可采用先前建立的间歇性单轴循环应变方案13，其参数为：正弦波形式，频率1 Hz，应变幅度从0%至5%，每次持续3小时，随后休息3小时，交替进行。此循环应变方案持续执行7天，以诱导胶原纤维的定向排列。</li>
	<li>通常在12天后，HVSCs已形成定向排列的胶原结构。当胶原达到定向排列后，将单轴循环应变的方向更改为与原始应变方向垂直的方向，可通过将矩形柱旋转90°来实现。</li>
</ol>
4. 细胞与胶原的可视化
<ol>
	<li>为了可视化活性的实时胶原重塑过程，使用不影响细胞活力或胶原形成的探针对样品进行标记。利用探针对细胞质和胶原进行荧光染色。</li>
	<li>或者，可采用共聚焦激光扫描显微镜结合二次谐波生成技术，通过自体荧光14来观察胶原结构，激发波长为 780 nm，检测波长范围为 500–550 nm。</li>
	<li>将培养板从实验装置和培养箱中取出，在周期性拉伸样品的 3 小时静息期间，将其转移至共聚焦激光扫描显微镜，以观察细胞和胶原。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

所述的细胞填充纤维蛋白构建物模型系统在研究细胞和胶原（再）排列方面具有巨大潜力（de Jonge 等15), 例如 用于组织工程目的。通过使用纤维蛋白作为初始的细胞载体，在纤维蛋白降解后，仅由细胞和内源性基质构成的组织得以形成。通过这种方式，可通过施加收缩力，刺激细胞对静态或周期性应变作出响应。16,17，感知边界刚度12或表现出应变回避。
意义： 之前已有研究使用纤维蛋白构建物来观察胶原的（重新）排列18，但无法实现施加周期性应变和/或以延时方式对构建物进行观察，而本方法可同时实现这两种操作。本模型系统中用于提供固定作用的魔术贴条带此前已有应用19，但将该技术与带有柔性膜的培养板结合，可实现长时间施加周期性应变。在此类培养板中进行细胞培养，可方便地添加和更换培养基，并在构建物仍附着且保持无菌的状态下进行实时观察，从而能够以延时或甚至实时方式研究相关的重塑过程。
<...

心血管组织具有显著的承重功能。特别是细胞外基质中胶原纤维的含量和排列方式，对组织的承重性能起着决定性作用，并主导整体组织强度1。在组织工程中，通常采用机械刺激（通常为循环拉伸）对构建物进行力学调控，以增强组织的有序性和力学性能2,3。然而，目前尚未完全理解在复杂组织几何结构中，拉伸如何诱导胶原排列，从而构建具有预设胶原结构的组织。这主要是因为我们对发育过程中胶原重塑的了解仍然有限。现有模型主要基于静态拉伸，仅能提供胶原重塑最终净结果的信息4-6。本文提供了一种高度可调的模型系统，可在三维条件下实时研究静态或循环拉伸影响下的胶原（重）排列过程。该组织构建物基于纤维蛋白，确保其中所有胶原均为内源性产生。通过可视化细胞和胶原在构建物中的排列，并结合内部参照系统，我们能够对细胞和胶原结构进行定位，实现延时分析。在本实验方案中，我们将以人隐静脉细胞（HVSCs）为例说明该模型系统的应用，因为这些细胞具有较强的细胞外基质生成能力以及基质重塑能力，并已在工程化心血管组织中得到广泛应用7，相关工作基于 de Jonge et al.8 的研究。

<table><tbody><tr><td>培养用塑料器皿</td><td>Greiner</td><td></td><td>包括培养瓶和移液管</td></tr><tr><td>高级DMEM培养基</td><td>Gibco</td><td>12491</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Greiner</td><td>758075</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Gibco</td><td>10378016</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax</td><td>Gibco</td><td>35050-079</td><td></td></tr><tr><td>弹性体及固化剂</td><td>Dow Corning Corporation</td><td>3097358-1004</td><td>Silastic MDX 4-4210#</td></tr><tr><td>魔术贴</td><td>普通商店</td><td></td><td>可在普通商店购买，仅使用柔软面</td></tr><tr><td>Bioflex培养板</td><td>Flexcell Int</td><td>BF-3001U</td><td>未处理</td></tr><tr><td>L-抗坏血酸-2-磷酸</td><td>Sigma</td><td>A8960</td><td></td></tr><tr><td>&amp;epsilon;-氨基己酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D7754</td><td></td></tr><tr><td>牛凝血酶</td><td>Sigma</td><td>T4648</td><td></td></tr><tr><td>牛纤维蛋白原</td><td>Sigma</td><td>F8630</td><td></td></tr><tr><td>0.45 微米注射器滤器</td><td>Whatmann (Schleicher and Scheul)</td><td>10462100</td><td></td></tr><tr><td>聚苯乙烯微球</td><td>Invitrogen</td><td>F-8829</td><td>蓝色荧光，直径10 &amp;mu;m</td></tr><tr><td>Flexcell FX-4000T</td><td>Flexcell Int</td><td></td><td>包括矩形加载柱</td></tr><tr><td>细胞追踪橙</td><td>Invitrogen Molecular Probes</td><td>C2927</td><td></td></tr><tr><td>CNA35-OG488</td><td></td><td></td><td>由中国台湾埃因霍温理工大学生物医学工程系大分子与有机化学实验室友情提供</td></tr><tr><td>共聚焦激光扫描显微镜</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>LSM 510 Meta激光扫描显微镜及双光子-LSM模式</td></tr><tr><td>两性霉素</td><td>Gibco</td><td>15290-018</td><td>细胞分离所需</td></tr></tbody></table>

利用肌成纤维细胞构建纤维蛋白基组织工程支架并施加约束与应变以诱导细胞和胶原的重排

Engineering Fibrin-based Tissue Constructs from Myofibroblasts and Application of Constraints and Strain to Induce Cell and Collagen Reorganization

发育中的胶原组织内，胶原含量及其排列可能受到局部组织应变和组织约束的影响。组织工程研究人员希望利用这些原理来构建具有预设胶原结构的组织。然而，目前对控制最终组织结构的胶原重塑具体机制仍缺乏全面理解。特别是，关于胶原纤维如何响应组织力学加载条件变化而发生的（重）定向过程，所知甚少。我们开发了一种in&#160;vitro模型系统，该系统由接种肌成纤维细胞并施加双向约束的纤维蛋白构建体组成，旨在进一步阐明胶原（重）定向行为：i）将双向静态加载转变为单轴静态加载条件下的响应；ii）在加载方向改变前后，利用Flexcell FX4000T加载装置对施加双向约束的构建体进行单轴循环加载。采用延时共聚焦成像技术以非破坏性方式可视化观察胶原（重）定向过程。
可实时观察构建物中的细胞和胶原组织，内部参考系统使我们能够对细胞和胶原结构进行定位，以便进行延时分析。该模型系统的多个方面均可调整，例如细胞来源或使用健康与病变细胞。可通过添加添加剂进一步阐明胶原重塑的潜在机制，例如添加基质金属蛋白酶（MMPs）或阻断整合素。构建物的形状和大小可轻松根据特定需求进行调整，从而形成一个高度可调的模型系统，用于研究细胞和胶原的（再）组织过程。

该模型系统可用于培养接种了肌成纤维细胞的纤维蛋白凝胶。图1A显示了在静态双轴约束条件下首先进行的组织培养。通过切断纤维蛋白凝胶的两个约束点，释放组织约束，形成单轴静态约束，随后组织发生收缩和重塑（图1A）。对于周期性应变，组织同样在静态双轴约束条件下培养。5天后可施加周期性单轴应变（图1B）。为了诱导胶原重新取向，可将单轴应变方向改为垂直方向（图1B）。与凝胶混合物共同接种的微球呈现出随机分布模式，可用于在延时成像中重新定位预定义的位置（图2）。图2A和2C展示了细胞、胶原和微球的图像。相同的图像分别在3天后（图2B）和2天后（图2D）再次扫描。细胞和胶原的排列模式已发生变化，但微球的分布模式被用于重新定位细胞和胶原。培养样本12天后，可产生足够量的内源性胶原，能够通过共聚焦显微镜进行可视化观察（图3和...

该模型系统始于含有肌成纤维细胞的纤维蛋白凝胶，可用于以非破坏性方式实时研究内源性胶原蛋白的（再）组织过程。该模型系统具有高度可调性，可结合不同细胞来源和培养基添加剂使用，并能轻松适应特定研究需求。

胶原含量及其在发育中胶原组织内的排列可受局部组织应变和组织约束的影响。组织工程学研究人员旨在……

本实验的总体目标是构建基于纤维蛋白的结构，用于研究细胞和胶原的重排。首先从供体组织中分离人隐静脉细胞并在培养中扩增，以此实现该目标。第二步是将魔术贴条粘附到柔性膜上。在六孔板底部，通过在中心区域形成一个方形空间来固定构建物。接下来，将纤维蛋白原、凝血酶、细胞以及荧光标记的微珠混合物加入到Velcro条带之间的空间中，并使其聚合形成凝胶。最后一步是通过施加单轴循环应变或释放静态应变，对细胞进行培养并诱导其形成定向基质。通过单向修剪纤维蛋白凝胶与尼龙搭扣柱之间的连接。最终，可通过随时间监测构建物的共聚焦显微镜观察，获得描述细胞和胶原重新排列变化的结果。该方法有助于解答胶原重塑领域中的关键问题，例如不同类型细胞形成和重新定向胶原的速度。首先，根据人体材料二次使用的相关指南，获取来自大隐静脉的人体供体组织。随后，按照 Schnell 等人的方案从组织中分离人源大隐静脉细胞（H VSCs），并在液氮中保存。使用时，将一管含有 250,000 个快速复苏的 H VSCs 细胞接种至含 15 毫升预温培养基的 T75 培养瓶中，进行细胞扩增。培养基由440毫升高糖DMEM、50毫升胎牛血清、5毫升100倍青霉素-链霉素溶液以及5毫升200毫摩尔L-谷氨酰胺组成。每两到三天更换一次培养液，持续约两周，直至细胞达到汇合状态。待细胞融合后，使用胰蛋白酶消化并传代培养，最多可传至第九代，直至获得计划实验所需的足够数量细胞。每个构建体大约需要150万个细胞。当细胞生长至足够数量时，在细胞融合度达到90%时收集细胞，然后将细胞重悬于生长培养基中，浓度为每毫升1500万个细胞。将细胞置于冰上，待用。通过按10:1的比例混合弹性体和固化剂来配制硅胶胶水。使用该胶水将从魔术贴软面获取的7毫米×3毫米条带粘附到Flex Cell培养板的柔性膜上。为形成具有开放中心的十字形结构，将硅胶在60摄氏度的烘箱中过夜干燥，以确保胶水充分固化。然后，向每孔加入5毫升70%乙醇，在室温下孵育30分钟，对培养板进行灭菌。用无菌 PBS 清洗孔板三次。然后从孔中移除 PBS 和魔术贴条。将孔板置于超净台的紫外灯下，不加盖，照射 30 分钟，以对表面进行灭菌。完成后，盖上培养板，并保持无菌状态直至使用。接下来，在培养的前七天内，通过向500毫升生长培养基中加入130毫克蒜氨酸和两份磷酸盐来配制组织工程培养基。同时，添加1毫克/毫升的ε-氨基己酸以防止纤维蛋白降解，并轻轻混匀，将纤维蛋白原溶解于含氨基己酸的组织工程培养基中，使其实际蛋白浓度达到10毫克/毫升。然后进行无菌处理。将纤维蛋白原溶液通过0.22微米注射器滤器过滤，并置于冰上保存备用。接着，用组织工程培养基将储存的凝血酶稀释至终浓度为每毫升10个国际单位，该培养基需添加氨基己酸，配制后置于冰上保存备用。接下来，为每个将要制备的组织构建体，取100微升之前

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Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

肌成纤维细胞和约束的应用工程纤维蛋白的​​组织结构和应变诱导细胞和胶原蛋白（RE）组织

在此，我们演示了包含骨骼肌成肌细胞的胶原基组织工程构建物的制备方法。这些三维工程化构建物可用于组织的替代或修复 体内为实现这一目的，我们设计了房室电传导通路，用于完全性心脏传导阻滞的修复[1].

肌源性工程组织构建物的制备

我们描述了新生大鼠心肌细胞的分离方法，以及将细胞包封于纤维蛋白水凝胶支架中用于组织工程的制备步骤。我们还介绍了培养结束后对组织工程心肌组织的分析方法，包括电刺激下产生的主动收缩力、细胞活力检测以及免疫组织化学染色。...

用于心脏组织工程的纤维蛋白水凝胶包封心肌细胞

本实验方案重点利用干细胞固有的能力，即响应其周围细胞外基质的信号，进而被诱导分化为多种表型。本方法学论文扩展了我们对一种双层水凝胶模型的描述与表征，该模型由聚乙二醇-纤维蛋白（PEG-fibrin）和胶原蛋白组成，可同时共诱导脂肪来源的干细胞分化1。...

构建双层水凝胶以调控ASC分化

采用延时显微镜和图像处理技术，在环境可控的生物反应器中对成纤维细胞介导的凝胶收缩及纤维蛋白纤维重排进行为期48小时的观察与分析 时期。...

观察与定量成纤维细胞介导的纤维蛋白凝胶收缩

本研究介绍了一种通过直接培养胶原蛋白、平滑肌细胞和内皮细胞来快速制备活体血管组织的技术。此外，还描述了一种用于工程化血管组织力学表征的新方案。...

用于血管组织再生的三维细胞化胶原凝胶的构建

我们提出了一种韧带组织模型，其中三维构建物经人运动后条件化血清处理，并对其胶原含量、功能及细胞生化特性进行分析。...

利用运动训练后血清处理韧带类组织：一种可转化的组织工程模型

本文提出了一种针对暴露于电场（EF）的纤维导电材料构建有限元模型的策略。这些模型可用于估算接种在该类材料中的细胞所接收到的电学输入，并评估改变支架的组成材料特性、结构或取向所产生的影响。...

细胞电微环境的有限元建模

本文介绍了一种用于在具有双极的多孔板中平行培养48个组织的工程化结缔组织的制备方案，适用于机制研究、疾病建模和筛选应用。该方案适用于来自不同器官和物种的成纤维细胞，并以人原代心肌成纤维细胞为例进行了演示。...

用于筛选应用的成纤维细胞来源人源化工程化结缔组织

以下方案介绍了一种基于剪切的挤出方法，用于制备具有纳米级图案化纤维的胶原蛋白水凝胶，该方法可广泛应用于多种组织工程领域。...

用于组织工程的纳米纤维图案化胶原蛋白的制备

本文介绍了一种可重复的方法，通过结合熔融电纺写入（MEW）法制备的聚己内酯（PCL）支架、纤维蛋白水凝胶以及人诱导多能干细胞来源的心肌细胞和成纤维细胞，生成三维心肌组织。该技术可精确控制支架结构，适用于临床前药物筛选和心脏疾病建模。...

利用聚己内酯支架的熔融静电纺丝书写技术与人诱导多能干细胞来源的心脏细胞生成三维人心肌组织

了解利用肌成纤维细胞-纤维蛋白凝胶模型研究实时胶原蛋白重组的方法。该技术通过共聚焦显微镜监测细胞与胶原动态变化，为组织工程和纤维化研究提供可调控的实验平台。

利用肌成纤维细胞构建纤维蛋白基组织工程支架并施加约束与应变以诱导细胞和胶原的重排

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