Name: 去耦力学传递线索的影响制备羟基聚丙烯酰胺水凝胶的 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: 学习使用微接触印刷技术在羟基聚丙烯酰胺水凝胶上固定蛋白质，以独立控制细胞微环境的多种参数。该方法有助于研究细胞机械转导过程中的细胞行为。

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本工作由比利时国家科学研究中心（F.R.S.-FNRS）通过“MIS 共聚焦显微镜”项目、“研究人员启动基金”（Crédit aux Chercheurs）以及“纳米运动性 FRFC 项目”（编号：2.4622.11）提供资助。T.G. 的博士研究生奖学金由农业与工业研究培训基金会（FRIA）支持。作者衷心感谢 Sylvain Desprez 在力学表征方面的贡献，以及 Géraldine Circelli 在共聚焦成像方面的协助。

1. 活化玻璃盖玻片表面
<ol>
	<li>将玻璃圆形盖玻片（直径 25 mm）放入培养皿中，并涂抹 0.1 M NaOH 溶液处理 5 分钟&#160;（建议在化学通风橱中操作）。</li>
	<li>去除 NaOH 溶液，加入无菌 ddH2O 完全浸没盖玻片，在无菌培养罩内轻轻振荡孵育 20 分钟&#160;。</li>
	<li>倒掉无菌 ddH2O，并重复步骤 1.2。</li>
	<li>用无菌镊子取出盖玻片，转移至新的培养皿中，确保活化面朝上放置。</li>
	<li>用高纯度氮气持续吹扫，干燥盖玻片。</li>
	<li>在无菌培养罩内，将一层薄薄的 3-(三甲氧基甲硅烷基)丙基丙烯酸酯（92%）均匀涂抹于盖玻片的活化表面，反应 1&#160;小时。</li>
	<li>用无菌 ddH2O 对玻璃盖玻片进行充分洗涤，共洗涤 3 次，然后将其浸入新培养皿的无菌 ddH2O 中。</li>
	<li>用 Parafilm 封住培养皿，置于摇床上轻柔振荡 10 分钟。</li>
	<li>用尖头无菌镊子从 ddH2O 中取出盖玻片，转移至新的培养皿中，确保活化面朝上。</li>
	<li>在室温下干燥避尘处保存，并用铝箔包裹以防止灰尘附着。</li>
</ol>
2. 羟基-PAAm 水凝胶的制备
<ol>
	<li>在1.5 ml&#160;离心管中称取65 mg的N-羟乙基丙烯酰胺（HEA）。必须现配新鲜的HEA溶液。</li>
	<li>向HEA中加入1 ml&#160;50 mM HEPES缓冲液，使用涡旋振荡器混合，直至HEA完全溶解。</li>
	<li>加入400 µl&#160;40% w/w的丙烯酰胺HEPES溶液，以及所需体积的2% w/w的HEPES双丙烯酰胺溶液（见表1），以达到目标水凝胶刚度。用50 mM HEPES缓冲液定容至终体积5 ml。</li>
	<li>使用涡旋振荡器混匀溶液，并在真空腔中脱气20 min&#160;，以降低溶液中的氧气浓度，防止羟基化聚丙烯酰胺（hydroxy-PAAm）发生聚合。</li>
	<li>在无菌操作台中，使用孔径为0.2 µm的滤器对脱气后的溶液进行过滤，以实现无菌处理。</li>
	<li>将圆形玻璃盖玻片（直径22 mm）置于紫外/臭氧清洗仪中活化7 min。</li>
	<li>配制100 µl&#160;10%过硫酸铵（APS）溶液，即10 mg APS溶于100 µl&#160;ddH2O中。必须现配新鲜的APS溶液。</li>
	<li>向已灭菌的羟基化聚丙烯酰胺（hydroxy-PAAm）溶液（步骤2.5）中加入2.5 µl&#160;四甲基乙二胺（TEMED）和25 µl&#160;APS溶液，以启动聚合反应。在无菌条件下，通过连续三次移液操作混匀溶液，避免引入气泡。</li>
	<li>在无菌操作台中，取25 µl&#160;羟基化聚丙烯酰胺（hydroxy-PAAm）溶液滴加于25 mm盖玻片（来自步骤1.9）上，立即在其上放置已准备好的22 mm玻璃盖玻片（步骤2.6制备），轻压使溶液铺展。使用无菌镊子将22 mm玻璃盖玻片居中，并排除所有气泡。</li>
	<li>在室温下静置15 min，使羟基化聚丙烯酰胺（hydroxy-PAAm）水凝胶完成聚合。手动倒置离心管中剩余的hydroxy-PAAm溶液，以观察聚合进程是否完成。</li>
	<li>将带有水凝胶的盖玻片完全浸入无菌ddH2O中，用刀片边缘小心插入22 mm玻璃盖玻片与羟基化聚丙烯酰胺（hydroxy-PAAm）水凝胶层之间，轻轻分离盖玻片。</li>
	<li>用无菌PBS洗涤羟基化聚丙烯酰胺（hydroxy-PAAm）水凝胶（共更换PBS三次），并将凝胶保持完全浸没在无菌PBS中以维持水合状态。</li>
	<li>将羟基化聚丙烯酰胺（hydroxy-PAAm）水凝胶置于4 °C的无菌PBS中保存，最多可保存3天。</li>
</ol>
3. 聚二甲基硅氧烷（PDMS）微模板的制备
注意：在开始 PDMS 微模版的制备之前，需要先制备硅胶母版。硅胶母版的微加工可通过光刻技术完成，但该技术需要专用设备和专业培训。建议与纳米加工平台合作制备硅胶母版。或者，可联系可根据需求定制微结构硅胶母版的公司。需要注意的是，硅胶母版只需制备一次即可，因为微结构硅胶母版可无限次用于制备弹性印章。
<ol>
	<li>在塑料烧杯中按10:1的比例混合PDMS和固化剂，使用移液管充分搅拌10分钟。</li>
	<li>将PDMS混合物置于真空环境中脱气，以去除步骤3.1中产生的气泡。</li>
	<li>将微结构硅模板放入培养皿中，并在其表面浇铸一层10 mm厚的脱气PDMS混合物，确保不产生气泡。</li>
	<li>在60 °C的烘箱中使PDMS固化2小时。</li>
	<li>在无尘环境中，用手术刀将PDMS层剥离，并切割出1 cm2的微图案印章。</li>
	<li>使用镊子将PDMS微图案印章图案面朝上放置于培养皿中。</li>
</ol>
4. 羟基-PAAm水凝胶的微图形化
<ol>
	<li>将PDMS微图案印章置于乙醇/水（50/50）溶液中，超声处理15分钟。</li>
	<li>用氮气流吹干印模，并将图案面朝上放入紫外/臭氧清洗仪（λ &#60; 200 nm）下孵育 7 分钟。</li>
	<li>在无菌操作台中，放置一个150-µl&#160;目标蛋白溶液的一滴（例如，100 µg/ml&#160;PBS 或 25 µg/ml 的层粘连蛋白&#160;PBS中的纤连蛋白）滴加到1厘米微结构表面2 PDMS印章</li>
	<li>可选：调整蛋白溶液的浓度以调节细胞-配体密度。</li>
	<li>用移液枪的无菌枪头将蛋白溶液从印模中心向各个角落移动，使其均匀覆盖整个印模表面。</li>
	<li>让蛋白质溶液在PDMS印章上吸附60分钟&#160;在无菌操作台内进行操作。关闭灯光以避免蛋白质损伤。</li>
	<li>在无菌操作台中，将羟基-PAAm包被的盖玻片（来自步骤2.13）转移至培养皿中。</li>
	<li>在无菌条件下，用低氮气流吹去羟基化聚丙烯酰胺基底表面多余的 PBS。一旦观察到凝胶表面无残留水分，立即停止操作。此步骤中不应将凝胶完全干燥。</li>
	<li>用高纯度氮气稳定气流小心吹干PDMS印章的结构化表面。</li>
	<li>用无菌敷料镊夹住包被有蛋白的印模，将印模的结构面与干燥的水凝胶表面接触。用镊子尖端在PDMS印模顶部施加短暂的点状压力，以确保印模的微结构与水凝胶表面充分接触。</li>
	<li>在室温下将PDMS印章置于水凝胶表面1小时。</li>
	<li>用敷料镊子轻轻将PDMS印章从羟基-PAAm水凝胶上取下，并按照步骤4.1清洁印章。</li>
	<li>在无菌条件下，用磷酸盐缓冲液（PBS，pH = 7.4）分三次、每次10分钟充分洗涤 stamped 羟基化聚丙烯酰胺水凝胶&#160;每次交换</li>
	<li>可选：可通过执行步骤 4.5 至 4.11，在羟基-PAAm 表面添加其他细胞外基质蛋白的微图案。</li>
	<li>用5 mg/ml的无菌BSA溶液对非打印区域进行封闭&#160;在4 °C下，于摇板上轻轻振荡过夜。</li>
	<li>在无菌条件下，用 PBS（pH = 7.4）洗涤 3 次，每次 10 分钟&#160;每次更换后， stamped 羟基-PAAm 水凝胶可在 4 °C 下保存长达一周。</li>
</ol>
5. 细胞在微图案化羟基-PAAm水凝胶上的沉积
<ol>
	<li>在接种细胞前，将盖玻片置于细胞培养基中孵育 30–45 分钟。</li>
	<li>用 37 °C 的无菌 PBS 洗涤在 75 cm2 培养瓶中培养的贴壁细胞，并加入 3 ml&#160;胰蛋白酶-EDTA 或 accutase，作用 10 分钟以消化细胞。</li>
	<li>将适量预热的、适用于您所用细胞系的完全培养基加入含有已脱落细胞的培养瓶中，然后将细胞悬液在 650 × g 条件下离心 3 分钟&#160;。</li>
	<li>用移液器吸除上清液，并将细胞重悬于完全培养基中，浓度为 15,000–20,000 个细胞/ml。</li>
	<li>取 4 ml&#160;细胞悬液加入微图案化盖玻片（来自步骤 5.1）中，并将接种了细胞的盖玻片置于 37 °C、5% 湿度的培养箱中孵育 1–2 小时。</li>
	<li>轻轻吸除未贴壁的细胞，更换培养基，将已贴壁的细胞重新放回培养箱，使其充分铺展（3–6 小时，具体时间取决于细胞类型）。</li>
</ol>

<ol><li>Grevesse, T., Versaevel, M., Circelli, G., Desprez, S., Gabriele, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+route+to+functionalize+polyacrylamide+gels+for+the+independent+tuning+of+mechanotransduction+cues%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">A simple route to functionalize polyacrylamide gels for the independent tuning of mechanotransduction cues.</a> Lab Chip. 13 (5), 777-780 (2013).</li>
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</ol>

未声明任何利益冲突。

现代细胞生物学中的许多体外（in vitro）观察实验通常是在刚性玻璃盖玻片上进行的，这些盖玻片通常涂有一层含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）序列的细胞外基质（ECM）蛋白或合成肽。然而，这类基本培养基质无法重现ECM完整的理化复杂性，因此不能为研究细胞力学转导过程提供准确的模型。为解决这一问题，我们提出一种简单的方法，可在二维水凝胶上以任意数量和种类固定ECM蛋白。该方法可独立调控影响力学转导的关键因素，例如基质刚度、细胞形态与空间限制，以及细胞-配体密度。此外，羟基化聚丙烯酰胺（hydroxy-PAAm）水凝胶克服了现有功能化方法的一个主要局限，即难以固定并控制多种ECM蛋白的空间分布。由于hydroxy-PAAm水凝胶对生物分子具有高亲和力，因此可通过连续微图案化技术，在同一表面上精确调控多种ECM蛋白的空间分布，且该过程不受基质刚度影响，也无需额外设备。
我们提出一种基于在丙烯酰胺水凝胶中引入羟基的新方法，以克服其固有的非黏附特性，同时对成本和专业技术要求极低。与现有的在水凝胶上进行蛋白图案化技术相比，羟基化聚丙烯酰胺（hydroxy-PAAm）方法避...

局部细胞微环境的诸多方面（例如，刚度、孔径大小、蛋白质性质或细胞-配体密度）提供了一组协调的调控信号，控制细胞运动、增殖、分化和基因表达等细胞过程。细胞可感知细胞外环境理化性质的改变，并引发不同的生理后果，包括细胞极性变形、迁移和分化。然而，目前尚不清楚细胞如何将细胞外基质（ECM）的改变转化为细胞内的生化信号。因此，构建可控的 体外 能够重现细胞与其微环境之间相互作用的微环境，用于研究机械转导通路。为解决这一问题，我们近期提出了一种新方法1称为羟基-PAAm水凝胶，可轻松制备二维软基质，从而独立调控重要的机械转导信号：基质刚度、细胞形态与限域性、蛋白质种类以及细胞配体密度。
细胞外基质（ECM）通过形态发生素梯度（化学趋向性）、黏附蛋白梯度（黏附趋向性）以及刚度梯度（硬度趋向性）来调控细胞的各种生物学过程。在过去的几十年中，研究人员开发了多种先进的体外（in vitro）研究平台，用以分离这些细胞外信号，从而解析细胞如何将生化和生物物理特征转化为生理活动2-5。人们已开发出电子束光刻6、光刻技术7、光化学固定化8以及等离子体辅助技术9，以引导活细胞在微图案化基底上的生长。尽管这些技术已取得重要成果，但其中大多数方法难以区分不同信号对细胞行为的独立影响，且需要昂贵的技术设备，仅有少数实验室能够负担。在这些技术中，微接触印刷（microcontact printing, µCP）作为一种稳健且易于实施的方法脱颖而出，可用于构建细胞黏附性微岛结构10。近年来，大量研究工作11-14致力于将µCP技术应用于刚度可调的水凝胶上，以模拟活体组织中广泛存在的不同刚度环境。在这些研究中，聚丙烯酰胺（polyacrylamide, PAAm）因其优势而受到广泛关注15，现已成为细胞生物力学实验中最常用的基于聚合物的基质材料之一。
聚丙烯酰胺（PAAm）表面通常使用异双功能交联剂N-磺基琥珀酰亚胺-6-[4'-叠氮-2'-硝基苯胺基]（sulfo-SANPAH）进行功能化，细胞外基质（ECM）蛋白通过紫外光激活sulfo-SANPAH中的硝基苯基叠氮基团而连接到表面16。另一种技术是将肼与经高碘酸盐严重氧化的蛋白质偶联17。Hynd及其同事提出了一种在仿生水凝胶表面图案化蛋白质和多肽的技术，该技术需要在丙烯酰基链霉亲和素单体存在下进行光聚合18。最近，Tseng 等报道了一种新的微图案化方法19，该方法通过光学石英掩模对PAAm进行深紫外照射，并在添加蛋白质前，需将活化的聚丙烯酸（PA）凝胶与1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）水溶液孵育。尽管这些技术能够生成均一且可重复的蛋白质微图案，但大多数方法存在显著局限性：合成过程耗时较长（例如，透析、冷冻干燥等）、化学试剂成本高昂（例如，透明质酸、sulfo-SANPAH）或需要深紫外辐照。此外，这些技术无法独立调控基底刚度、微图案几何形状、ECM蛋白种类以及细胞配体密度。
考虑到这些局限性，我们开发了一种新型且简单的基于丙烯酰胺的方法，可实现多种蛋白质和生物分子在软性水凝胶上的固定，同时允许独立调控机械转导信号，以解析其在细胞功能中的作用。该方法在丙烯酰胺（PAAm）聚合过程中引入一种带有羟基的商用丙烯酰胺单体，避免了使用强腐蚀性化学试剂处理PAAm水凝胶。这一简单操作无需其他技术条件，即可克服PAAm水凝胶固有的抗粘附特性。
羟基的存在使得羟基化聚丙烯酰胺（hydroxy-PAAm）水凝胶对能够形成氢键相互作用的蛋白质和生物分子具有高亲和性。结合微接触印刷技术（µCP），羟基化聚丙烯酰胺水凝胶可快速构建二维细胞培养平台，实现对基质刚性、细胞外基质（ECM）蛋白类型、细胞配体密度以及黏附局限性的独立调控，该平台有望成为研究力传导机制的有力工具。
本实验方案的目的是提供必要的信息，使研究人员无需材料科学领域的专业知识也能轻松制备羟基-PAAm水凝胶。最终目标是为科研人员提供一种手段，以在细胞和组织水平上提出具有生理相关性的问题，从而增进对参与病理生理机制的机械转导通路的理解。

<table><tbody><tr><td>紫外/臭氧光反应器</td><td>Ultra-Violet Products</td><td>型号 PR-100</td><td></td></tr><tr><td>摇床</td><td>IKAcWerke</td><td>型号 KS 130 Basic</td><td></td></tr><tr><td>涡旋振荡器</td><td>Scientific Industries</td><td>型号 Vortex Genie2</td><td></td></tr><tr><td>真空脱气室</td><td>Applied Vacuum Engineering</td><td>DP- 8-KIT</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm 封口膜</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7793-1EA</td><td></td></tr><tr><td>细尖不锈钢镊子</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z225304-1EA</td><td></td></tr><tr><td>敷料组织镊</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4392-1EA</td><td></td></tr><tr><td>聚苯乙烯培养皿</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5731-500EA</td><td></td></tr><tr><td>铝箔，厚度 0.5&amp;nbsp;mm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>266574-3.4G</td><td></td></tr><tr><td>Isopore 膜滤器（孔径 0.2 &amp;micro;m）</td><td>Millipore</td><td>GTTP 滤器编号</td><td></td></tr><tr><td>圆形玻璃盖玻片（直径 22 mm）</td><td>Neuvitro</td><td>GG-22</td><td></td></tr><tr><td>圆形玻璃盖玻片（直径 25 mm）</td><td>Neuvitro</td><td>GG-25</td><td></td></tr><tr><td>可调体积微量移液器</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z114820</td><td></td></tr><tr><td>蛋白微量离心管</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z666505-100EA</td><td></td></tr><tr><td>手术刀柄</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2896-1EA</td><td></td></tr><tr><td>手术刀片</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2771-100EA</td><td></td></tr><tr><td>细胞培养瓶（75 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS430641</td><td></td></tr><tr><td>超声波清洗槽，实心（不锈钢）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z613983-1EA</td><td></td></tr><tr><td>聚二甲基硅氧烷&amp;nbsp;</td><td>Dow Corning</td><td>Sylgard 184 硅橡胶弹性体试剂盒</td><td></td></tr><tr><td>丙烯酰胺（粉末）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3553</td><td></td></tr><tr><td>N,N&amp;rsquo;-亚甲基双丙烯酰胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>146072</td><td></td></tr><tr><td>N-羟乙基丙烯酰胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>697931</td><td></td></tr><tr><td>N,N,N&amp;rsquo;,N&amp;rsquo;-四甲基乙二胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>过硫酸铵（APS）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>3-(三甲氧基甲硅烷基)丙基丙烯酸酯</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1805</td><td></td></tr><tr><td>人血浆纤连蛋白</td><td>Millipore</td><td>FC010</td><td></td></tr><tr><td>来自 EHS 的层粘连蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221465-25G</td><td></td></tr><tr><td>双蒸水（ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>内皮细胞生长培养基</td><td>Cells Applications</td><td>211K-500</td><td></td></tr><tr><td>人脐静脉内皮细胞（HUVEC）</td><td>Invitrogen</td><td>C-003-5C</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>PAA laboratories</td><td>L11-007</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 缓冲液，1 M 水溶液（H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>83264-500ML-F</td><td></td></tr><tr><td>抗生素-抗真菌剂</td><td>PAA laboratories</td><td>P11-002</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>PAA laboratories</td><td>H15-002</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 标记鬼笔环肽</td><td>Molecular Probes</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>小鼠来源的抗连环蛋白抗体</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V9131</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗小鼠抗体-四甲基罗丹明</td><td>Molecular Probes</td><td>T-2762</td><td></td></tr><tr><td>抗纤连蛋白抗体（兔源）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F3648</td><td></td></tr><tr><td>链霉亲和素&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>41469</td><td></td></tr><tr><td>抗层粘连蛋白抗体（兔源）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L9393</td><td></td></tr><tr><td>抗兔 IgG-FITC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7512</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA 溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3924-100ML</td><td></td></tr><tr><td>无水乙醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>459844-2.5L</td><td></td></tr></tbody></table>

用于解耦机械转导信号影响的羟基-paam水凝胶的制备

Preparation of Hydroxy-PAAm Hydrogels for Decoupling the Effects of Mechanotransduction Cues

目前已有充分证据表明，许多细胞功能受到细胞与其细胞外基质（ECM）环境的理化和力学信号相互作用的调控。真核细胞通过细胞表面的机械感受器持续感知其局部微环境，将ECM的物理变化转化为生化信号，并整合这些信号以实现特定的基因表达改变。有趣的是，ECM的理化参数与力学参数可相互耦合，共同调控细胞命运。因此，理解机械转导机制的关键在于解析ECM信号对细胞功能的相对贡献，即实现各种ECM线索的解耦。
本文介绍了一种详细的实验方案，可快速、简便地制备具有生物学相关性的水凝胶，用于独立调控机械转导信号 体外我们通过在聚合过程中引入带有羟基官能团的丙烯酰胺单体，对聚丙烯酰胺水凝胶（PAAm）进行化学修饰，从而克服其固有的非黏附性。由此获得了一种新型PAAm水凝胶，称为羟基化-PAAm（hydroxy-PAAm），可实现任意所需类型细胞外基质（ECM）蛋白的固定化。将羟基化-PAAm水凝胶与微接触印刷技术相结合，能够独立调控单细胞形态、基质刚度、ECM蛋白的种类及其密度。我们提供了一种简单且快速的方法，可在任何生物学实验室中建立，用于研究 体外 细胞机械转导过程。我们通过在内皮细胞上进行实验，验证了这一新型二维平台，实验结果证明了细胞外基质刚度与细胞核之间存在机械耦合。

图1A 展示了丙烯酰胺（AAm）和双丙烯酰胺（bis-AAm）与含有伯羟基的N-羟乙基丙烯酰胺（HEA）单体通过随机自由基共聚反应，形成带有嵌入式羟基的亲水性聚丙烯酰胺网络（羟基化PAAm）。在本实验方案中，需将65 mg的HEA溶解于1 ml HEPES缓冲液中。由于HEA的密度约为1，我们假设最终工作体积为1,065 µl（HEA + HEPES）。如表1所示，将1,065 µl的上述溶液加入400 µl AAm和50 µl bisAAm中，总体积为1,515 µl。因此，需加入3,485 µl的HEPES缓冲液，以将溶液总体积调节至5 ml。如步骤2.6所述，22 mm玻璃盖玻片表面需在紫外/臭氧（UV/Ozone）中活化7分钟，以便在不损伤水凝胶表面的前提下将其去除。事实上，经过UV/Ozone处理后，玻璃表面亲水性增强，因此可通过将整个体系浸入水中实现轻松分离。此外，UV/Ozone处理还可防止与水凝胶表面直接接触的22 mm盖玻片发生化学污染。该技术可获得固定于25 mm直径玻璃盖玻片上的平整圆形聚丙烯酰胺表面（直径22 mm）。
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我们介绍一种新型聚丙烯酰胺水凝胶，称为羟基-PAAm，可实现细胞外基质蛋白的直接结合，且成本低廉、操作简便。将羟基-PAAm水凝胶与微接触印刷技术结合，可独立调控天然细胞微环境中的多种信号，从而用于研究细胞力学转导。

用于解耦机械转导信号影响的羟基-PAAm水凝胶的制备

现已充分证实，细胞的许多功能受到其与所处微环境中的理化和力学信号相互作用的调控。

本实验的总体目标是建立一种简单高效的策略，将任意目标蛋白固定在聚丙烯酰胺水凝胶上，从而独立调控细胞微环境的多种参数。该方法首先将蛋白溶液均匀涂布于PDMS印章表面，第二步是使用高纯度氮气稳定气流，小心干燥PDMS印章的结构化表面。接下来，将蛋白质包被的印模以其结构化表面接触已干燥的水凝胶表面，并在PDMS印模顶部施加短暂的压力点，以确保印模的微结构特征与水凝胶表面充分接触。最后一步是轻柔地将PDMS印模从水凝胶表面取下，并在非打印区域去除后清洗印模。通过BSA处理，细胞可附着于微图案化的水凝胶表面。最终，使用倒置荧光显微镜观察蛋白质微结构特征。该方法有助于解答机械转导领域中的关键问题，例如细胞外基质特性（如刚度、细胞配体密度或蛋白质性质）的相对贡献。在进行该实验操作时，建议在化学通风橱中进行。首先将直径为25毫米的圆形玻璃盖玻片放入培养皿中，并在其表面涂抹0.1摩尔的氢氧化钠溶液，持续五分钟。移除氢氧化钠溶液，将盖玻片完全浸入无菌双蒸水（DD H₂O）中，在摇床上轻轻摇动 20 分钟。倒掉无菌 DDH₂O，加入新的无菌 DDH₂O 以完全浸没盖玻片，再轻轻摇动 20 分钟。用无菌镊子取出盖玻片，放入新的培养皿中。将活化面向上，用稳定气流的高纯度氮气吹干盖玻片。待盖玻片干燥后，将其放回无菌培养罩中，并在每张盖玻片的活化面上均匀涂布一层薄薄的三甲基丙基丙烯酸酯。放置一小时后，再孵育一小时。随后用无菌去离子水充分清洗玻璃盖玻片。然后将盖玻片浸入一个新的培养皿中的无菌 DD H₂O 中。用封口膜密封培养皿，并置于摇床上轻轻振荡 10 分钟。最后，使用带有精细尖端的无菌镊子将盖玻片从 DDH₂O 中转移至另一个新的培养皿中。将活化面朝上，用铝箔覆盖培养皿，以防止灰尘附着在盖玻片上，并在室温下的干燥处保存。开始此操作前，准备5毫升无菌的羟基聚丙烯酰胺水凝胶溶液和100微升新鲜的10%过硫酸铵溶液。如实验方案文本所述，向羟基聚丙烯酰胺水凝胶溶液中加入 2.5 µL 四甲基乙二胺以及 25 µL 过硫酸铵溶液。为启动聚合反应，在生物安全柜内无菌条件下，通过连续三次移液操作混匀溶液，避免引入气泡；取 25 µL 羟基聚丙烯酰胺水凝胶溶液滴加于一片 25 mm 圆形盖玻片上，立即在其液滴上方覆盖一片 22 mm 圆形玻璃盖玻片，以压平羟基聚丙烯酰胺水凝胶溶液。该 22 mm 玻璃盖玻片此前已通过在紫外臭氧清洗仪中照射 7 分钟进行活化处理。用无菌镊子将玻璃盖玻片居中放置，并排除所有气泡。将羟基聚丙烯酰胺水凝胶在室温下静置聚合15分钟。手动倒置试管中剩余的羟基聚丙烯酰胺水凝胶溶液。为监测聚合反应的完成情况，将盖玻片完全浸入无菌的 ddH₂O 中。用剃刀刀片插入 22 毫米玻璃盖玻片与羟基聚丙烯酰胺水凝胶层之间，小心分离二者。用无菌 PBS 缓冲液洗涤羟基聚丙烯酰胺水凝胶三次，并将凝胶完全浸没于无菌 PBS 中以维持其水合状态。本实验中所用的聚二甲基硅氧烷（PDMS）微印章按照文中的实验方案制备。将PDMS微印章置于50%乙醇水溶液中，超声处理15分钟。用氮气流吹干印章，并将其图案面朝上放入紫外臭氧清洗仪中处理7分钟。在无菌操作台中，将150 µL所需蛋白溶液滴加至A-P-D-M-S的微结构表面。本演示中使用Stamp FI nin。用无菌移液枪头从中心向印章的每个角落移动，使蛋白溶液均匀覆盖整个印章表面。将蛋白溶液在PDMS印章上孵育60分钟。在此无菌操作台内，关闭光源以避免蛋白质受损。随后，将涂有羟基聚丙烯酰胺水凝胶的盖玻片转移至新的培养皿中。在无菌条件下，使用低氮气流去除羟基聚丙烯酰胺水凝胶基质表面多余的 PBS。当观察到凝胶表面无可见残留液体时，停止操作。此时凝胶不应完全干燥。使用稳定气流的高纯度氮气小心吹干PDMS印章的结构化表面。用敷料镊子夹住已包被蛋白的印章，将结构化表面与干燥的水凝胶表面接触。使用镊子尖端在PDMS印章顶部施加短暂的压力点，以确保印章的微结构与水凝胶表面充分接触。室温下将PDMS印章留在水凝胶表面一小时后，用敷料镊子轻轻将PDMS印章从羟基聚丙烯酰胺水凝胶上取下，并将印章在乙醇水溶液中振荡清洗15分钟。在无菌条件下，通过三次更换PBS溶液对印迹后的羟基聚丙烯酰胺水凝胶进行充分洗涤，每次更换间隔10分钟。最后一次 PBS 洗涤后，加入无菌的 BSA 溶液，在摇板上于 4 摄氏度下轻轻振荡孵育过夜。这将在次日封闭非打印区域。在无菌条件下，通过三次更换 PBS 对印迹的羟基聚丙烯酰胺水凝胶进行充分洗涤，每次更换 PBS 洗涤 10 分钟。带有微图案的羟基聚丙烯酰胺水凝胶可在 4 摄氏度下保存长达一周。结果表明，羟基聚丙烯酰胺水凝胶的刚度演变与双丙烯酰胺交联剂用量之间存在线性关系。在三种不同刚度的羟基聚丙烯酰胺水凝胶上沉积的层压矩形微图案的共聚焦荧光图像，展示了微图案几何形状与基质刚度的独立调控。通过调整用于孵育 PDMS 印模的蛋白溶液浓度，可调节细胞配体密度。图中显示了两次连续的微接触印刷产生的两幅荧光图像。红色为纤维连接蛋白条带，绿色为层粘连蛋白条带，二者以90度交叉排列，并在25千帕的羟基聚丙烯酰胺水凝胶基底上依次微印刷了纤维蛋白-层粘连蛋白和胶原蛋白条带。当原代细胞接种于均匀包被和微图案化的羟基聚丙烯酰胺水凝胶表面时，细胞活力在接种后三天内至少保持80%。还观察到，与软基质相比，细胞在较硬的基质上增殖更明显。当接种于三种不同硬度的羟基聚丙烯酰胺水凝胶上、经矩形纤连蛋白包被的微图案时，原代内皮细胞在软基质上表现出较低的肌动蛋白纤维密度和圆形的细胞核。在较硬的基质上，肌动蛋白纤维更直且更粗，细胞核在其发育后也发生形变。该技术为机械转导领域的研究人员探索细胞微环境参数在多种细胞系统（如原代细胞或干细胞、组织水平、模式生物、时尚、人口统计学或器官系统）中的独立作用奠定了基础。

preparation-hydroxy-paam-hydrogels-for-decoupling-effects

Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

去耦力学传递线索的影响制备羟基聚丙烯酰胺水凝胶的

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