去耦力学传递线索的影响制备羟基聚丙烯酰胺水凝胶的
2014年8月28日
我们提出了一个新的聚丙烯酰胺水凝胶，称为羟基聚丙烯酰胺，它允许直接结合ECM蛋白以最小的成本或专业知识。羟基聚丙烯酰胺的结合水凝胶与微接触印刷有利于学习的蜂窝mechanostransduction独立控制的自然细胞微环境的许多线索。
该程序的总体目标是开发一种简单有效的策略，用于将任何感兴趣的蛋白质固定在聚丙烯酰胺水凝胶上，以便独立控制细胞微环境的各种参数。这是通过首先将蛋白质溶液铺展在 PDMS 邮票表面来实现的。第二步是用稳定流动的高纯度氮气小心地干燥 PDMS 印章的结构表面。
接下来，将蛋白质包被的邮票放置在与干燥的水凝胶表面接触的结构化表面，并在 PDMS 邮票的顶部施加简短的压力点，以确保邮票微特征和水凝胶表面之间的良好接触，最后一步是轻轻地从水凝胶表面去除 PDMS 邮票，并在非印刷区后清洁邮票。使用 BSA，细胞可以位于微图案水凝胶表面上。最终，使用倒置荧光显微镜观察蛋白质的微观特征。
该方法可以帮助回答机械转导领域的关键问题，例如细胞外基质特性的相对贡献，例如刚度、细胞连接子密度或蛋白质性质。在 ano 交易过程中，建议在化学通风橱中执行此程序。首先将直径为 25 毫米的圆形玻璃盖玻片放入培养皿中，将 0.1 摩尔氢氧化钠溶液涂抹在载玻片上 5 分钟。
取出氢氧化钠溶液，将盖玻片完全浸入无菌 DD H2O 中，在摇板上轻轻摇动 20 分钟，沥干无菌 DDH 2 O，加入更多无菌 DDH 2 O 以完全浸入盖玻片，再轻轻摇动 20 分钟。用无菌镊子取下盖玻片，并将它们放入新的培养皿中。活化面朝上干燥，盖子在稳定流出高纯度氮气的情况下滑落。
盖玻片干燥后，将它们带回无菌培养罩中，在每个盖的活化面上涂抹一层薄薄的三甲基丙基 acr。一小时后滑动一小时。用无菌 DD H 2 O 广泛清洗玻璃盖玻片。
然后将盖玻片浸入无菌 DD H 2 O 中的新培养皿中。用封口膜密封培养皿，并将其放在摇板上，轻轻搅拌 10 分钟。最后，使用带有细尖的无菌镊子将盖玻片从 DDH 两个 O 转移到新的培养皿中。
激活的面朝上。用铝箔盖住培养皿，以免灰尘粘在盖玻片上，并在室温下存放在干燥的地方。要开始此程序，每个硫酸盐溶液制备 5 毫升无菌羟基聚丙烯酰胺水凝胶溶液和 100 微升新鲜的 10% 铵。
如方案文本中所述，向羟基聚丙烯酰胺水凝胶溶液中加入 2.5 微升四亚甲基二胺和每个硫酸盐溶液中 25 微升铵。为了开始聚合，在无菌罩下通过三次连续移液混合溶液，在无菌条件下不引入气泡，将 25 微升羟基聚丙烯酰胺水凝胶溶液滴在 25 毫米圆形盖玻片上，并立即将 22 毫米圆形玻璃盖玻片放在液滴顶部以挤压羟基聚丙烯酰胺水凝胶溶液。22 毫米玻璃盖玻片之前通过在紫外线臭氧清洁剂中暴露 7 分钟来激活。
用无菌镊子将玻璃盖玻片居中，并抚平任何气泡。让羟基聚丙烯酰胺水凝胶在室温下聚合 15 分钟。手动倒置管中剩余的羟基聚丙烯酰胺水凝胶溶液。
为了完成聚合过程，将盖玻片与无菌 D DH 2 o 完全浸入。通过将剃须刀片的边缘插入 22 毫米玻璃盖玻片和羟基聚丙烯酰胺水凝胶层之间，小心地分离 22 毫米玻璃盖玻片。用无菌 PBS 洗涤羟基聚丙烯酰胺水凝胶 3 次，然后将凝胶完全浸入无菌 PBS 中以保持水合作用。
该程序中使用的聚二甲基酯或 PDMS 微邮票是按照文本协议中的描述制造的。将 PDMS 微图章放入 50 至 50 乙醇水溶液中，超声处理 15 分钟。用氮气流蒸汽干燥邮票，然后将它们模型放入紫外线臭氧清洁剂中 7 分钟。
在无菌罩下，将 150 微升所需蛋白质溶液滴到 A-P-D-M-S 的微结构表面上。本演示中使用了 Stamp FI nin。用无菌移液器吸头将蛋白质溶液移向印章的每个角落，将蛋白质溶液涂抹在印章表面。
将蛋白质溶液在 PDMS 标记上吸收 60 分钟。在这个无菌罩下，关掉灯以避免蛋白质损伤。接下来，将羟基聚丙烯酰胺水凝胶涂层的盖玻片转移到新的培养皿中。
在无菌条件下，用低氮流从羟基聚丙烯酰胺水凝胶底物表面去除多余的 PBS。停止该过程。一旦没有观察到凝胶表面有积水的迹象。
在此阶段，凝胶不应彻底干燥。用稳定流动的高纯度氮气小心干燥 PDMS 印章的结构表面。用敷料组织镊子抓住蛋白质涂层的邮票，并将结构化表面与干燥的水凝胶表面接触。
用镊子的尖端在 PDMS 印章顶部施加短暂的压力点，以确保印章微特征和水凝胶表面之间有良好的接触，一小时后将 PDMS 印章在室温下留在水凝胶表面一小时。用敷料组织镊子轻轻地从羟基聚丙烯酰胺水凝胶上取下 PDMS 印章，并在乙醇水溶液中通奸 15 分钟清洁印章。在无菌条件下通过三次 PBS 交换充分洗涤冲压的羟基聚丙烯酰胺水凝胶，每次交换 10 分钟。
最后一次 PBS 洗涤后，加入 BSA 无菌溶液，并在 4 摄氏度下在摇板上轻轻搅拌孵育过夜。这将在第二天吃掉非打印区。在无菌条件下通过三次 PBS 交换充分洗涤冲压的羟基聚丙烯酰胺水凝胶，每次交换 10 分钟。
冲压羟基聚丙烯酰胺水凝胶可以在 4 摄氏度下储存长达一周。结果表明，羟基聚丙烯酰胺水凝胶刚度的演变与沉积在羟基聚丙烯酰胺上的层合矩形微图案的双丙烯酰胺交联剂落射荧光图像之间存在线性相关性 三种不同刚度的水凝胶证明了微图案几何形状和基质刚度的独立调整。可以通过改变用于孵育 PDMS 标记的蛋白质溶液的浓度来调节细胞配体密度。
这里显示的是来自连续微接触打印的两张荧光图像。红色纤连蛋白条纹和绿色层粘连蛋白条纹以 90 度交叉，纤维蛋白层粘连蛋白和胶原蛋白条纹依次微印在 25 公斤帕斯卡羟基聚丙烯酰胺水凝胶基材上。当原代细胞接种在均匀涂被的微图案羟基聚丙烯酰胺水凝胶表面上时，接种后三天内的细胞活力至少为 80%。
还观察到，与软质基质相比，细胞在坚硬的基质上增殖更多。当电镀在矩形纤连蛋白涂层的微图案上时，沉积在三种不同刚度的羟基聚丙烯酰胺水凝胶上。原代内皮细胞表现出低肌动蛋白纤维密度和软细胞核呈圆形。
较硬的基质上的基质，肌动蛋白纤维更直、更厚，细胞核发育后变形。这项技术为机械转导领域的研究人员探索细胞微环境参数在广泛的细胞系统（如原代细胞或干细胞、组织水平、模式生物、时尚、人口统计学或器官系统）中的个体作用铺平了道路。
查看完整文字稿并访问数千部科学视频
概述
本研究介绍了羟基-PAAm，一种新型聚丙烯酰胺水凝胶，能够在最低的专业知识下直接结合ECM蛋白。羟基-PAAm与微接触印刷的集成允许对细胞微环境中的各种信号进行独立控制，有助于研究细胞力学转导。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 生物材料
背景
- 水凝胶技术对于研究细胞行为至关重要。
- ECM蛋白在细胞功能中起着重要作用。
- 微接触印刷是一种用于表面图案化的技术。
- 理解力学转导对于各种生物学应用至关重要。
研究目的
- 开发一种简单的方法用于蛋白质在水凝胶上的固定。
- 实现对细胞微环境的精确控制。
- 促进对细胞对机械信号响应的研究。
所用方法
- 在PDMS印章表面涂抹蛋白质溶液。
- 用氮气干燥PDMS印章。
- 让蛋白质涂覆的印章与水凝胶表面接触。
- 使用倒置荧光显微镜观察蛋白质图案。
主要结果
- 成功地在羟基-PAAm水凝胶上固定蛋白质。
- 展示了对微环境参数的控制。
- 实现了在图案化表面上观察细胞行为。
- 提供了对力学转导过程的洞察。
结论
- 羟基-PAAm是细胞生物学研究的一个多功能工具。
- 该方法简化了研究ECM相互作用的过程。
- 预计将在力学转导研究中有进一步的应用。
常见问题
Executive Industry Relevance
Decoupling mechanotransduction cues is critical for understanding how extracellular matrix (ECM) properties independently influence cell fate decisions in early discovery. The hydroxy-PAAm hydrogel platform enables precise, independent control of matrix stiffness, protein composition, and ligand density, directly supporting mechanistic de-risking and target validation. This capability enhances predictive confidence at key inflection points in the discovery pipeline and informs risk-adjusted portfolio advancement.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of individual ECM parameters to clarify their roles in cellular signaling and gene expression.
- Supports functional target validation by isolating mechanical and biochemical cues affecting cell behavior.
- Facilitates mechanistic de-risking by allowing independent tuning of microenvironmental variables.
- Improves predictive confidence for downstream biological hypotheses and target selection.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, tunable hydrogel substrates for reproducible cell-based assays.
- Standardizes assay conditions by independently controlling matrix stiffness, protein type, and ligand density.
- Enables quantitative, high-content readouts for compound screening and phenotypic analysis.
- Supports scalable and reusable assay platforms for reliable compound evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro mechanotransduction models with disease-relevant ECM conditions for translational continuity.
- Facilitates risk-adjusted advancement by providing mechanistic insights into cell-ECM interactions.
- Supports biomarker discovery by enabling controlled studies of cellular responses to defined mechanical cues.
Pipeline & Workflow Integration
This hydrogel platform fits from early discovery through lead identification and preclinical research, enabling hypothesis-driven studies of ECM influence on cell fate.
- Discovery Biology: Provides a system for hypothesis testing and pathway clarification by decoupling ECM variables.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible substrates with independently tunable parameters.
- Analytics: Generates quantitative measurements of cell morphology, viability, and mechanotransduction outputs.
- Translational Research: Bridges in vitro findings to preclinical models by mimicking disease-relevant ECM properties.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized, adaptable platform for diverse cell types and experimental needs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of cell-based assays.
- Strategic Value: Supports informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio management.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of discovery programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in hydrogel preparation, protein immobilization, and sterile technique.
- Needs access to fluorescence microscopy and microcontact printing infrastructure.
- Demands cross-team standardization of ECM protein selection and assay protocols.
- Adaptable to various cell types and experimental models with protocol optimization.
- Storage and handling of hydrogels must maintain hydration and sterility for reproducibility.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:41
Activating the Surface of Glass Coverslips
3:42
Preparation of Hydroxy-PAAm Hydrogels
5:50
Micropatterning Hydroxy-PAAm Hydrogels
9:09
Results: Micropatterned Hydroxy-PAAm Hydrogels Enable Independent Tuning of Mechanotransduction Cues In Vitro
10:55
Conclusion
