用于成像和免疫组织化学的视网膜全层铺片制备的优化方案

该实验利用小鼠视网膜组织，演示如何稳定脆弱的神经组织以保持其结构完整性。在免疫组织化学染色的多个步骤中，首先去除眼球，切除角膜，并将视网膜与巩膜分离。在视网膜眼杯上做切口，以展平组织。

然后使用负压转移法将视网膜附着在带支撑环的膜上，避免直接操作，以保持组织的完整性。接着将支撑环转移至多孔板中进行染色。我们的结果表明，该技术可有效用于活体组织，并为突触蛋白的成像提供了优于现有视网膜处理方法的优良基底。

这些技术可实现对精细组织的转移，同时最大限度地减少物理操作，从而降低组织变形和损伤的风险。我们最初是在需要对视网膜变性小鼠模型（RD1 小鼠）中扁平铺片的视网膜组织进行记录时产生这一想法的，由于突变基因 Chief 导致大量细胞死亡，该小鼠的视网膜极为纤薄且脆弱。

我们实验室的一名博士后将与我共同演示该操作步骤。首先，摘除麻醉小鼠的眼球，并将眼球转移至充氧的HEPES缓冲林格液中。为去除角膜，用镊子夹住角膜缘处固定眼球，然后沿锯齿缘环形剪开。

使用镊子取出晶状体，以便进行团注注射和电生理记录。使用尖端磨平的镊子尽可能多地去除玻璃体。现在用镊子牢固地夹住巩膜，以稳定眼杯。

将第二把镊子置于视网膜与眼杯之间，缓慢沿眼球周边移动。剪断视网膜与眼杯之间的视神经，并用剪刀移除眼杯。

从视网膜周边部开始，一直切至视神经处。或者，若需使用整个视网膜，可从周边部向视神经方向切至一半距离，以缩短支撑架。使用车床去除多余部分。

然后用细砂纸打磨粗糙的表面。从环的下方取下支脚。剪掉塑料移液管的狭窄尖端。

然后将组织连同样品溶液一同转移至膜上。在铺展视网膜的同时逐步去除溶液，并展开组织。现在将视网膜的神经节细胞面向上固定在膜上。

剪下一毫升注射器的持握尖端，并将其直接置于组织下方。将活塞向后拉动至约0.3毫升的体积，以物理方式将组织嵌入膜内。使用约一兆欧的电阻拉制一些硼硅酸盐毛细玻璃管移液器。

然后轻轻折断每个膜片电极尖端。接着，将 0.3 µL 的选择素储备染色液加入 10 µL 的 HEPES 缓冲林格溶液中。现在将膜置于灌流有温热含氧 HEPES 缓冲林格溶液的记录室中。

使用显微操作器将含有染料的移液器置于内界膜处。进一步推进移液器以穿透内界膜，随后将染色液注入单个或多个目标位置。

现在在落射荧光照明下观察组织，使其恢复10分钟。如有需要，将插入物转移至玻璃底培养皿中，使视网膜面朝下。加入一滴heap溶液以保持样本湿润。

此外，在塑料环的边缘周围放置三处真空脂，以将插入物牢固地固定在培养皿上。固定后，将培养皿转移至显微镜载物台上，将膜浸入蔗糖梯度溶液中。从塑料插入环上切除膜。

用 Kim 擦拭纸尽可能吸去溶液，将组织置于载片上，视网膜面朝上。将带有组织的载片转移至冷冻切片机腔室，并加入一滴 OCT 包埋剂。使用快速冷冻装置加速冷冻过程。

取下冷冻样本并翻转。现在切去多余的冷冻OCT包埋剂，在样本的三个侧面各保留约两毫米，而在将要连接到持样器的一侧保留毫米。

用一滴OCT覆盖暴露的视网膜面，保留附着区域不覆盖。冷冻含有视网膜组织的膜。在冰冷的持片环上滴加一滴OCT。

立即将冷冻样品浸入液滴中。在负19摄氏度下切10至20微米厚的切片，并将其贴附于温热的多聚赖氨酸粘附载玻片上。将带有切片的载玻片置于41摄氏度的加热平台上，在避光条件下孵育两到三分钟。

然后将样品储存在负20摄氏度。本实验展示了一种快速且简单的视网膜血管系统表征方法，视网膜血管系统是一个跨越多个视网膜层的复杂血管网络。通过结合iso选择素的团注加载与亚甲蓝浸渍标记，几乎可以立即对活体组织进行可视化和扫描，从而实现从浅层到深层对视网膜血管的标记。

与相对易于扩散的SRH相比，选择素（selectin）不易穿过内界膜。在标记突触蛋白时，使用碳二亚胺（carbimide）固定相比传统的多聚甲醛固定具有多个优势；例如，经碳二亚胺短时间固定后，对突触标志物PSD-95进行免疫荧光染色，在内丛状层（IPL）中呈现出明亮的点状结构，能够清晰区分单个突触。

相比之下，使用传统的多聚甲醛固定剂时，突触组分的识别较为模糊。在视网膜冷冻切片中也获得了类似的结果。观看本视频后，您应能充分理解如何将精细的组织样本装载到该膜上，以及如何对制备好的样品进行细胞化学染色。

将视网膜连接到滤膜上需要15分钟。