利用SynVivo合成微血管网络生成剪切黏附图谱

以下实验的总体目标是利用合成微血管网络，通过单次实验获得细胞颗粒黏附的纯剪切力黏附图谱。该目标首先通过将微流控装置包被目标蛋白（本实验中为 avadon）来实现。第二步是在生理剪切速率下将生物素化颗粒注入装置，这些颗粒会以不同的模式结合到包被有 avadon 的装置表面，具体结合模式取决于局部剪切速率。

接下来，通过使用计算生成的网络内剪切速率值数据库，对结合的颗粒数量进行计数，以生成颗粒的剪切黏附图谱。结果表明，仅通过一次实验即可获得剪切黏附图谱，与传统的平行板流动腔相比，可显著节省时间和试剂。该技术相较于现有方法（如线性流动通道）的主要优势在于，能够通过单次实验生成剪切黏附图谱，从而在成本和时间上实现显著节约。

该方法有助于回答药物递送领域中的关键问题，例如药物递送载体与特定靶标结合的能力。我们最初提出该方法时，正在使用桨板流动室来研究细胞特定病变。然而，在流体条件下，该检测的主要目的是为微粒与细胞黏附提供基础性认识。

该体内模拟平台可应用于多种其他系统，如癌症和中枢神经系统递送、感染与炎症性血栓以及微循环功能障碍。本方法的可视化演示至关重要，因为微流控装置的操作步骤较难掌握，熟悉小体积样本的处理以及避免气泡形成的最佳操作实践通过视觉展示能更有效地传达。本次操作演示将由本实验室的研究科学家 Ashley Smith 进行。

SynVivo SMN 微流控装置包含两组平行端口，一组用于引入表面包被物、分子或细胞以进行固定，另一组用于运行检测。开始时，先将装置完全浸入含有无菌去离子水的培养皿中，并将培养皿放入真空环境中。进行干燥处理，使干燥过程持续进行，直至装置通道内的所有空气被完全去除。

在将装置从水中取出之前，应等待大约15分钟。使用尖头镊子将已用清水预润的特戈管插入装置的每个端口。管道长度应约为一英寸。

现在可以使用移液器或注射器将装置从水中取出。在其中一个进样口管路的底部周围滴加一滴水。小心地取下管路。

水滴可防止空气进入装置。接下来，准备一支装有浓度为20微克/毫升阿瓦多恩（avadon）的1毫升注射器。将注射器连接至24号不锈钢针头，并使用鳄口夹夹闭未使用的进样口。

将管路插入装置的入口端口。以每分钟一微升的流速注入avadon，持续10分钟，以确保装置完全灌注。流速时间结束时。

用鳄鱼夹夹紧所有管路，并将装置置于4摄氏度环境中过夜。使装置恢复至室温。然后将装置置于配备电动载物台和高性能相机的倒置荧光显微镜上。

在磷酸盐缓冲液（PBS）中配制浓度为每毫升500万个的2微米生物素化微粒溶液。将微粒溶液装入1毫升注射器中。另准备一支1毫升的PBS注射器。

仅将每个注射器装载到注射泵上，然后使用移液器注射器将其连接至针头和管路。在进样口管路底部周围滴加一滴水，小心移除用于包被装置的管路。小心地将用于生物素化微粒和PBS的管路分别插入每个进样口。

然后以每分钟2.5 µL的流速开始注入生物素标记的颗粒。在显微镜下观察进样口，一旦发现颗粒即刻启动计时器，并持续流动3分钟。

三分钟结束后，停止生物素化颗粒的流动，同时以每分钟2.5微升的流速开始注入磷酸盐缓冲液（PBS）。使PBS在装置中持续流动三分钟，以洗去未结合的颗粒。开始图像采集时，使用成像软件中的“扫描大图像”功能获取整个装置的图像，随后依次对装置内的分叉结构进行编号，并创建直径为通道两倍的圆形感兴趣区域。

在此情况下，由于通道直径为 100 微米，将兴趣区域的直径设置为 200 微米。使用成像软件中的自动计数功能，将每个兴趣区域内的颗粒数量导出至电子表格中。同样，使用自动统计功能将整个装置内的颗粒数量导出。

进行计算流体动力学（CFD）模拟，并将结果存储在数据库中以供进一步分析。结果中包含的信息有管壁剪切速率、粒子速度通量以及粒子在装置表面的黏附情况。这些信息可用于确定在给定粒子浓度输入条件下，各个关注区域所黏附的粒子数量。

为了生成剪切黏附图谱，需按照文本方案中详细描述的步骤，最后计算黏附百分比。利用网络各分叉处的剪切速率和黏附百分比数值绘制剪切黏附图谱。该图像显示了在结合了两微米生物素化颗粒后，典型的avidan包被的体外合成SMN装置。

请注意，颗粒倾向于在管网的分叉处附近粘附。此处可见合成体内SMN管网中标记编号的分叉位置。该图像为设备的CFD模型生成的样本壁面剪切力图。

该装置内的剪切速率变化范围为250秒⁻¹至15秒⁻¹，与体内微血管中观察到的情况一致。需要注意的是，线性微流控通道无法同时获得这些不同的剪切速率，因为它们在每一流速下仅提供恒定的剪切速率。此处所示的网络各分叉处剪切速率数值图表明，剪切速率的分布模式十分复杂，无法像线性流动通道那样通过简单的解析关系获得。

此外，网络中存在多个位于同一剪切率区间的分叉结构，这增强了所示数据的统计置信度。以下是用于计算实验网络中各分支和分叉处粒子通量的 CFD 分析结果示例。

从单次 syn vivo SMN 实验获得的剪切黏附图谱，与通过线性通道实验获得的剪切黏附图谱所观察到的结果呈相反关系。然而，使用 SynVivo 检测方法，仅需一次实验即可生成该剪切黏附图谱，而线性通道则需要进行多次实验。观看本视频后，您应能够充分理解如何利用 SynVivo SMN 装置通过单次实验生成共享黏附图谱。

进行本实验时，需要注意在微流控芯片 SynVivo SMN 制备完成后避免引入气泡。该技术为炎症研究领域的科研人员提供了在单次实验中研究不同剪切速率下白细胞与内皮细胞相互作用的途径。在下一代设备中，研究人员将能够在单次检测中同时研究白细胞的滚动黏附和迁移过程，而这是目前尚无法实现的。

通过该实验流程，还可开展其他研究药物、药物递送载体及细胞黏附的方法，以探讨流动对细胞-细胞、细胞-药物及药物-载体黏附的生理影响等问题。