Name: 的剪切粘合地图使用SynVivo合成微血管网络代 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: 了解如何使用SynVivo合成微血管网络在单次实验中生成细胞颗粒剪切粘附图谱。该方法通过微流控技术和计算数据库，显著节省时间与试剂成本，适用于药物递送和细胞粘附研究。

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SynVivo 技术是在 NHLBI 资助项目 #2R44HL076034 下开发的。

1. 启动 SynVivo-SMN 微流控装置
<ol>
	<li>该装置的每个端口（入口/出口）均由两个平行端口组成——一个用于引入表面涂层分子（黏附分子、生长基质等）和/或用于接种的细胞，另一个用于运行实验（图1A）。</li>
	<li>将SynVivo-SMN微流控装置（图1B）完全浸入盛有无菌去离子水（DI水）的培养皿中，并将培养皿放入真空干燥器内。启动干燥器，直至装置通道内的所有空气被完全排出，此过程大约需要15分钟。</li>
	<li>在将装置从水中取出之前，使用尖头镊子将已预充满水的Tygon管（外径0.06英寸，内径0.02英寸）插入装置的每个端口。管子长度约为1英寸。此时可将装置从水中取出。图1C展示了装置连接管路后的图像。</li>
</ol>
2. 用目标蛋白包被微流控装置例如，亲和素）
<ol>
	<li>使用移液器在其中一个入口端口管路的底部周围滴加一滴水（约 100 µl）。小心移除用于预润湿装置的管路。水滴可防止空气进入装置。</li>
	<li>准备一支装有浓度为 20 µg/ml 亲和素的 1 ml 注射器。将注射器连接至一根 24 G 不锈钢针头和管路。将管路插入装置的一个入口端口。用鳄嘴夹夹闭未使用的入口端口。</li>
	<li>以 1 µl/min 的流速注入亲和素，持续 10 分钟，以确保装置完全灌注。流注结束后，用鳄嘴夹夹闭管路，并将装置置于 4 °C 过夜。</li>
</ol>
3. 进行黏附实验时流动生物素标记的微粒
<ol>
	<li>让装置恢复至室温。将装置放置在配备有电动载物台和高性能相机的倒置荧光显微镜上。</li>
	<li>在磷酸盐缓冲液（PBS）中配制浓度为 5 × 106 个颗粒/ml 的 2 µm 生物素化颗粒溶液。将颗粒溶液装入 1 ml 注射器中。另准备一支仅含 PBS 的 1 ml 注射器。将两支注射器分别安装到注射泵上，并连接针头和管路。</li>
	<li>使用移液器，在进样口管路底部周围滴加一滴水（约 100 µl）。小心移除用于包被装置的管路。水滴可防止空气进入装置内部。</li>
	<li>将步骤 3.2 中连接生物素化颗粒和 PBS 的管路小心插入各自的进样口。 图 2A 显示了该装置的示意图。</li>
	<li>以 2.5 µl/min 的流速开始注入生物素化颗粒。在显微镜下观察进样口。一旦观察到颗粒进入，立即启动计时器，并持续流动 3 分钟。</li>
	<li>3 分钟结束后，停止注入生物素化颗粒，同时以 2.5 µl/min 的流速开始注入 PBS。让 PBS 在装置中流动 3 分钟，以洗去未结合的颗粒。</li>
</ol>
4. 使用成像软件（NIKON Elements）获取图像并进行兴趣区域（AOI）测量
<ol>
	<li>使用成像软件中的“扫描大图像”功能获取整个装置的图像。</li>
	<li>对装置中的分叉结构进行依次编号，并创建直径为通道两倍的圆形感兴趣区域（AOI）。本例中，由于通道直径为 100 µm，因此将 AOI 直径设为 200 µm。</li>
	<li>使用成像软件中的自动计数功能，将每个 AOI 中的颗粒数量导出至 Microsoft Excel 表格。</li>
	<li>同样，使用自动计数功能将整个装置中的颗粒总数导出。</li>
</ol>
5. 使用计算流体动力学（CFD）模型进行颗粒通量分析
<ol>
	<li>使用商用软件（CFD-ACE+，ESI公司）对SynVivo-SMN装置的拓扑结构进行CFD模拟。模拟结果存储在数据库中，用于分析实验观察结果。模拟结果包含装置内壁面剪切速率、流速、颗粒通量和黏附信息。</li>
	<li>利用模拟结果，根据给定的入口颗粒浓度，确定进入每个感兴趣区域（AOI）的颗粒数量。</li>
</ol>
6. 生成剪切黏附力图谱
<ol>
	<li>通过将分叉处黏附的颗粒数除以流经分叉处的颗粒数来计算黏附百分比，如公式6.1所示。 
	<img alt="黏附百分比公式，% 黏附=(黏附颗粒数/流动颗粒数)，科学方程式。" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/51025/51025eq1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Equation 1"> 其中，黏附颗粒数和流动颗粒数分别来自实验步骤4.3和5.2。</li>
	<li>利用步骤(5.1)数据库中获得的各分叉网络的剪切速率，以及由公式6.1计算得到的%黏附值，绘制剪切黏附图谱。</li>
</ol>

<ol><li>Weitz-Schmidt, G., Chreng, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+adhesion+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell adhesion assays.</a> Methods Mol Biol. 757, 15-30 (2012).</li>
<li>Parsons, S. A., Jurzinsky, C., Cuvelier, S. L., Patel, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+leukocyte+recruitment+under+flow+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Studying leukocyte recruitment under flow conditions.</a> Methods Mol Biol. 946, 285-300 (2013).</li>
<li>Luscinskas, F. W., Gimbrone, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Jr+Endothelial-dependent+mechanisms+in+chronic+inflammatory+leukocyte+recruitment%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Med%22%5BJournal%5D)">Jr Endothelial-dependent mechanisms in chronic inflammatory leukocyte recruitment.</a> Annu Rev Med. 47, 413-421 (1996).</li>
<li>Adriani, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+preferential+targeting+of+the+diseased+microvasculature+by+disk-like+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The preferential targeting of the diseased microvasculature by disk-like particles.</a> Biomaterials. 33, 5504-5513 (2012).</li>
<li>Decuzzi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+chamber+analysis+of+size+effects+in+the+adhesion+of+spherical+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Flow chamber analysis of size effects in the adhesion of spherical particles.</a> Int J Nanomedicine. 2, 689-696 (2007).</li>
<li>Zou, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PSGL-1+derived+from+human+neutrophils+is+a+high-efficiency+ligand+for+endothelium-expressed+E-selectin+under+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">PSGL-1 derived from human neutrophils is a high-efficiency ligand for endothelium-expressed E-selectin under flow.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 289, 415-424 (2005).</li>
<li>Sakhalkar, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte-inspired+biodegradable+particles+that+selectively+and+avidly+adhere+to+inflamed+endothelium+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Leukocyte-inspired biodegradable particles that selectively and avidly adhere to inflamed endothelium in vitro and in vivo.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 15895-15900 (2003).</li>
<li>Van Kruchten, R., Cosemans, J. M., Heemskerk, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+whole+blood+thrombus+formation+using+parallel-plate+flow+chambers+-+a+practical+guide%5BTitle%5D)+AND+%22Platelets%22%5BJournal%5D)">Measurement of whole blood thrombus formation using parallel-plate flow chambers - a practical guide.</a> Platelets. 23, 229-242 (2012).</li>
<li>Ganguly, A., Zhang, H., Sharma, R., Parsons, S., Patel, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+human+umbilical+vein+endothelial+cells+and+their+use+in+the+study+of+neutrophil+transmigration+under+flow+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of human umbilical vein endothelial cells and their use in the study of neutrophil transmigration under flow conditions.</a> J Vis Exp. 66 (66), (2012).</li>
<li>Shirure, V. S., Reynolds, N. M., Burdick, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mac-2+binding+protein+is+a+novel+E-selectin+ligand+expressed+by+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Mac-2 binding protein is a novel E-selectin ligand expressed by breast cancer cells.</a> PLoS One. 7, (2012).</li>
<li>Ploppa, A., Schmidt, V., Hientz, A., Reutershan, J., Haeberle, H. A., Nohé, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+leukocyte+distribution+during+sepsis%3A+an+experimental+study+on+the+interdependence+of+cell+activation%2C+shear+stress+and+endothelial+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Care%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of leukocyte distribution during sepsis: an experimental study on the interdependence of cell activation, shear stress and endothelial injury.</a> Crit Care. 14, 201(2010).</li>
<li>Oh, H., Diamond, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethanol+enhances+neutrophil+membrane+tether+growth+and+slows+rolling+on+P-selectin+but+reduces+capture+from+flow+and+firm+arrest+on+IL-1-treated+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Ethanol enhances neutrophil membrane tether growth and slows rolling on P-selectin but reduces capture from flow and firm arrest on IL-1-treated endothelium.</a> J Immunol. 181, 2472-2482 (2008).</li>
<li>Resto, V. A., Burdick, M. M., Dagia, N. M., McCammon, S. D., Fennewald, S. M., Sackstein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L-selectin-mediated+lymphocyte-cancer+cell+interactions+under+low+fluid+shear+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">L-selectin-mediated lymphocyte-cancer cell interactions under low fluid shear conditions.</a> J Biol Chem. 283, 15816-15824 (2008).</li>
<li>Enders, S., Bernhard, G., Zakrzewicz, A., Tauber, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+L-selectin+binding+by+polyacrylamide-based+conjugates+under+defined+flow+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Inhibition of L-selectin binding by polyacrylamide-based conjugates under defined flow conditions.</a> Biochim Biophys Acta. 1770, 1441-1449 (2007).</li>
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<li>Brown, D. C., Larson, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvements+to+parallel+plate+flow+chambers+to+reduce+reagent+and+cellular+requirements%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Immunology%22%5BJournal%5D)">Improvements to parallel plate flow chambers to reduce reagent and cellular requirements.</a> BMC Immunology. 2, 9(2001).</li>
<li>Zheng, W., Zhang, W., Jiang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+control+of+cell+adhesion+by+combination+of+surface+chemistry+and+soft+lithography%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Healthc+Mater%22%5BJournal%5D)">Precise control of cell adhesion by combination of surface chemistry and soft lithography.</a> Adv Healthc Mater. 2, 95-108 (2013).</li>
<li>Qian, T., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro%2Fnano-fabrication+technologies+for+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Biol+Eng+Comput%22%5BJournal%5D)">Micro/nano-fabrication technologies for cell biology.</a> Med Biol Eng Comput. 48, 1023-1032 (2010).</li>
<li>Biswas, A., Bayer, I. S., Biris, A. S., Wang, T., Dervishi, E., Faupel, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+top-down+and+bottom-up+surface+nanofabrication%3A+techniques%2C+applications+%26+future+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Colloid+Interface+Sci%22%5BJournal%5D)">Advances in top-down and bottom-up surface nanofabrication: techniques, applications & future prospects.</a> Adv Colloid Interface Sci. 170, 2-27 (2012).</li>
<li>Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soft+lithography+in+biology+and+biochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Soft lithography in biology and biochemistry.</a> Annu Rev Biomed Eng. 3, 335-373 (2001).</li>
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<li>Prabhakarpandian, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+microvascular+networks+for+quantitative+analysis+of+particle+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Microdevices%22%5BJournal%5D)">Synthetic microvascular networks for quantitative analysis of particle adhesion.</a> Biomed Microdevices. 10, 585-595 (2008).</li>
<li>Rosano, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+physiologically+realistic+in+vitro+model+of+microvascular+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Microdevices%22%5BJournal%5D)">A physiologically realistic in vitro model of microvascular networks.</a> Biomed Microdevices. 11, 1051-1057 (2009).</li>
<li>Tousi, N., Wang, B., Pant, K., Kiani, M. F., Prabhakarpandian, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preferential+adhesion+of+leukocytes+near+bifurcations+is+endothelium+independent%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc+Res%22%5BJournal%5D)">Preferential adhesion of leukocytes near bifurcations is endothelium independent.</a> Microvasc Res. 80, 384-388 (2010).</li>
<li>Prabhakarpandian, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bifurcations%3A+focal+points+of+particle+adhesion+in+microvascular+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Bifurcations: focal points of particle adhesion in microvascular networks.</a> Microcirculation. 18, 380-389 (2011).</li>
</ol>

本文的出版费用由&#160;CFD Research Corporation&#160;赞助。

平行板流动腔虽然为细胞间及细胞-颗粒相互作用提供了重要见解，但存在若干局限性，例如试剂消耗量大，且需要多次实验才能生成剪切黏附图谱。采用SynVivo-合成微血管网络（SynVivo-SMNs）可在模拟生理条件的单次实验中生成剪切黏附图谱 体内 条件。此外，显著的节约（&#62;试剂的纯度也达到95%以上。
使用SynVivo-SMN进行颗粒黏附实验时，最重要的步骤是在实验开始前确保芯片内无气泡。气泡的引入会导致流动不稳定，并使芯片中“气锁”区域无法被液体通达。因此，在将管路插入或拔出装置端口时必须格外小心。若在预灌注阶段发现装置内有气泡，可重复预灌注步骤以去除气泡。或者，也可以低流速（0.1 µl/min 或更低）注入培养基/试剂，确保装置完成无气泡的预灌注。
该方案的主要局限在于，一旦芯片内出现无法去除的气泡，芯片即无法继续使用。然而，通过仔细的操作练习，实验成功率可接近100%。此外，剪切力黏附图的生成需要来自计算流体动力学（CFD）模型的信息。但通过预先计算不同流动条件下的CFD结果数据库，可轻松避免...

目前研究细胞间及颗粒-细胞相互作用的常用方法通常采用静态的孔板形式，其中颗粒或细胞在蛋白基质或贴壁细胞上孵育。在指定的孵育时间结束后，通过显微镜定量黏附的颗粒或细胞数量1。尽管这些方法能够深入揭示这些相互作用背后的生化过程，但一个关键的局限性在于缺乏生理性的流体流动（类似于微循环环境），以及无法评估流体剪切力对颗粒黏附的影响。
为了克服这一局限性， 体外 近年来已开发出多种流动室装置。这些流动室的共同特点是采用透明装置，在低雷诺数条件下灌注，以模拟血管中观察到的管壁剪切速率 体内2血管壁通过在流动腔室的一个表面涂覆生物分子或培养细胞来模拟3. 颗粒4-7 或细胞8-16 然后在所需的流速范围内注入流体，以量化不同剪切速率下黏附的颗粒数量。
然而，使用平行板流动腔来研究和验证生化现象成本较高且耗时较长。这主要是因为需要进行多次实验，以生成流体剪切力与黏附颗粒/细胞数量之间的关系图。此外，由于平行板流动腔尺寸较大（高度较高），需要消耗大量试剂。 &#62; 250 µm 和宽度 &#62; 1 mm）。最后，这些装置无法准确模拟几何特征（例如，分叉）和流动条件（例如，会聚流与发散流）的存在 体内.
基于光刻的微加工技术最新进展17-19 推动了芯片实验室设备领域的发展20-21这些装置在开发微型化平行板流动腔方面发挥了重要作用，其尺寸已达到微米量级。尺寸的缩小也显著减少了实验所需的试剂、细胞或颗粒的体积。然而，目前可用装置的一个关键局限在于采用线性通道来模拟微血管，无法真实再现所观察到的复杂微血管结构。 体内.
我们近期开发出一种新方法，可将微血管网络重建于一次性塑料基底上，从而形成微血管网络的合成模型 体内 条件。这些设备称为 SynVivo-合成微血管网络（SMN），采用基于 PDMS 的软光刻工艺制备。SynVivo-SMN 设备可用于获取细胞/颗粒黏附的剪切黏附图谱22，研究靶向药物递送23 并已通过验证 在体 数据24-25本文介绍了一种实验方案，可通过单次实验在低至1-5 µl的微小体积中生成剪切黏附力图谱，从而显著节省资源与时间。

<table><tbody><tr><td>SynVivo-SMN</td><td>CFD Research</td><td>SMN-001</td><td>CFDRC 独家提供</td></tr><tr><td>CFD-ACE+</td><td>ESI Inc.</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>亲和素</td><td>Invitrogen</td><td>43-4401</td><td>本实验可使用任何来源的亲和素</td></tr><tr><td>生物素化微粒</td><td>Polysciences</td><td>24173-1</td><td>本实验可使用任何来源的生物素化微粒</td></tr><tr><td>Tygon 导管</td><td>VWR</td><td>63018-044</td><td>尺寸适用于 SynVivo-SMN 系统</td></tr><tr><td>NIKON Elements</td><td>NIKON Instruments</td><td>N/A</td><td>也可使用其他成像软件</td></tr></tbody></table>

利用synvivo合成微血管网络生成剪切黏附图谱

Generation of Shear Adhesion Map Using SynVivo Synthetic Microvascular Networks

细胞/颗粒黏附实验对于理解疾病病理生理过程中涉及的生化相互作用至关重要，并在探索开发新型治疗手段方面具有重要应用。采用静态条件的实验无法反映黏附对剪切力的依赖性，从而限制了其与实际生理情况的相关性。 体内 环境。用于在生理流体流动条件下量化黏附的平行板流动腔需要进行多次实验才能生成剪切黏附图谱。此外，它们无法真实代表 体内 尺度和形态，并且实验需要大量（约毫升级）试剂。在本研究中，我们利用基于微血管网络的微流控装置 SynVivo-SMN，通过单次实验展示了剪切黏附图谱的生成。该装置可重建复杂的 体内 血管系统，包括几何尺度、形态学结构、流动特征以及细胞间相互作用 体外 从而为细胞行为、药物递送和药物发现的基础与应用研究提供一个符合生物学特性的环境。本实验通过研究2 µm生物素包被颗粒与微芯片上链霉亲和素包被表面的相互作用进行了验证。单次实验即可覆盖微循环中所观察到的全部剪切力范围，从而在生理条件下获得颗粒的黏附力与剪切力关系图谱。

图1A展示了SynVivo-SMN装置的示意图及其明场图像。图1B显示了安装在玻璃载片上的SynVivo-SMN装置。图1C显示了在真空干燥器中用水预处理后连接管路的装置。
图2A展示了实验装置的图像。图2B显示了2 µm生物素化颗粒结合后典型的链霉亲和素包被的SynVivo-SMN芯片。请注意，颗粒优先黏附在网络的分叉区域附近。
图3A 显示 SynVivo-SMN 网络中的编号分叉点。 图3B 显示由该装置的CFD模型生成的样本壁面剪切力分布图。装置内的剪切速率变化范围为250 sec⁻¹-1 至15秒-1 如在微血管系统中所观察到的那样 体内请注意，这些不同的剪切速率无法在直线型微流控通道中同时获得，因为直线型通道在每一流速下...

黏附实验中使用的流动室通常包含线性流动通道，需要在不同流速下进行多次实验才能生成剪切黏附图谱。SynVivo-SMN 能够利用微升级体积通过单次实验生成剪切黏附图谱，从而显著节省时间和耗材。

利用SynVivo合成微血管网络生成剪切黏附图谱

细胞/颗粒黏附实验对于理解疾病病理生理过程中涉及的生化相互作用至关重要，并具有重要的……

以下实验的总体目标是利用合成微血管网络，通过单次实验获得细胞颗粒黏附的纯剪切力黏附图谱。该目标首先通过将微流控装置包被目标蛋白（本实验中为 avadon）来实现。第二步是在生理剪切速率下将生物素化颗粒注入装置，这些颗粒会以不同的模式结合到包被有 avadon 的装置表面，具体结合模式取决于局部剪切速率。接下来，通过使用计算生成的网络内剪切速率值数据库，对结合的颗粒数量进行计数，以生成颗粒的剪切黏附图谱。结果表明，仅通过一次实验即可获得剪切黏附图谱，与传统的平行板流动腔相比，可显著节省时间和试剂。该技术相较于现有方法（如线性流动通道）的主要优势在于，能够通过单次实验生成剪切黏附图谱，从而在成本和时间上实现显著节约。该方法有助于回答药物递送领域中的关键问题，例如药物递送载体与特定靶标结合的能力。我们最初提出该方法时，正在使用桨板流动室来研究细胞特定病变。然而，在流体条件下，该检测的主要目的是为微粒与细胞黏附提供基础性认识。该体内模拟平台可应用于多种其他系统，如癌症和中枢神经系统递送、感染与炎症性血栓以及微循环功能障碍。本方法的可视化演示至关重要，因为微流控装置的操作步骤较难掌握，熟悉小体积样本的处理以及避免气泡形成的最佳操作实践通过视觉展示能更有效地传达。本次操作演示将由本实验室的研究科学家 Ashley Smith 进行。SynVivo SMN 微流控装置包含两组平行端口，一组用于引入表面包被物、分子或细胞以进行固定，另一组用于运行检测。开始时，先将装置完全浸入含有无菌去离子水的培养皿中，并将培养皿放入真空环境中。进行干燥处理，使干燥过程持续进行，直至装置通道内的所有空气被完全去除。在将装置从水中取出之前，应等待大约15分钟。使用尖头镊子将已用清水预润的特戈管插入装置的每个端口。管道长度应约为一英寸。现在可以使用移液器或注射器将装置从水中取出。在其中一个进样口管路的底部周围滴加一滴水。小心地取下管路。水滴可防止空气进入装置。接下来，准备一支装有浓度为20微克/毫升阿瓦多恩（avadon）的1毫升注射器。将注射器连接至24号不锈钢针头，并使用鳄口夹夹闭未使用的进样口。将管路插入装置的入口端口。以每分钟一微升的流速注入avadon，持续10分钟，以确保装置完全灌注。流速时间结束时。用鳄鱼夹夹紧所有管路，并将装置置于4摄氏度环境中过夜。使装置恢复至室温。然后将装置置于配备电动载物台和高性能相机的倒置荧光显微镜上。在磷酸盐缓冲液（PBS）中配制浓度为每毫升500万个的2微米生物素化微粒溶液。将微粒溶液装入1毫升注射器中。另准备一支1毫升的PBS注射器。仅将每个注射器装载到注射泵上，然后使用移液器注射器将其连接至针头和管路。在进样口管路底部周围滴加一滴水，小心移除用于包被装置的管路。小心地将用于生物素化微粒和PBS的管路分别插入每个进样口。然后以每分钟2.5 µL的流速开始注入生物素标记的颗粒。在显微镜下观察进样口，一旦发现颗粒即刻启动计时器，并持续流动3分钟。三分钟结束后，停止生物素化颗粒的流动，同时以每分钟2.5微升的流速开始注入磷酸盐缓冲液（PBS）。使PBS在装置中持续流动三分钟，以洗去未结合的颗粒。开始图像采集时，使用成像软件中的“扫描大图像”功能获取整个装置的图像，随后依次对装置内的分叉结构进行编号，并创建直径为通道两倍的圆形感兴趣区域。在此情况下，由于通道直径为 100 微米，将兴趣区域的直径设置为 200 微米。使用成像软件中的自动计数功能，将每个兴趣区域内的颗粒数量导出至电子表格中。同样，使用自动统计功能将整个装置内的颗粒数量导出。进行计算流体动力学（CFD）模拟，并将结果存储在数据库中以供进一步分析。结果中包含的信息有管壁剪切速率、粒子速度通量以及粒子在装置表面的黏附情况。这些信息可用于确定在给定粒子浓度输入条件下，各个关注区域所黏附的粒子数量。为了生成剪切黏附图谱，需按照文本方案中详细描述的步骤，最后计算黏附百分比。利用网络各分叉处的剪切速率和黏附百分比数值绘制剪切黏附图谱。该图像显示了在结合了两微米生物素化颗粒后，典型的avidan包被的体外合成SMN装置。请注意，颗粒倾向于在管网的分叉处附近粘附。此处可见合成体内SMN管网中标记编号的分叉位置。该图像为设备的CFD模型生成的样本壁面剪切力图。该装置内的剪切速率变化范围为250秒⁻¹至15秒⁻¹，与体内微血管中观察到的情况一致。需要注意的是，线性微流控通道无法同时获得这些不同的剪切速率，因为它们在每一流速下仅提供恒定的剪切速率。此处所示的网络各分叉处剪切速率数值图表明，剪切速率的分布模式十分复杂，无法像线性流动通道那样通过简单的解析关系获得。此外，网络中存在多个位于同一剪切率区间的分叉结构，这增强了所示数据的统计置信度。以下是用于计算实验网络中各分支和分叉处粒子通量的 CFD 分析结果示例。从单次 syn vivo SMN 实验获得的剪切黏附图谱，与通过线性通道实验获得的剪切黏附图谱所观察到的结果呈相反关系。然而，使用 SynVivo 检测方法，仅需一次实验即可生成该剪切黏附图谱，而线性通道则需要进行多次实验。观看本视频后，您应能够充分理解如何利用 SynVivo SMN 装置通过单次实验生成共享黏附图谱。进行本实验时，需要注意在微流控芯片 SynVivo SMN 制备完成后避免引入气泡。该技术为炎症研究领域的科研人员提供了在单次实验中研究不同剪切速率下白细胞与内皮细胞相互作用的途径。在下一代设备中，研究人员将能够在单次检测中同时研究白细胞的滚动黏附和迁移过程，而这是目前尚无法实现的。通过该实验流程，还可开展其他研究药物、药物递送载体及细胞黏附的方法，以探讨流动对细胞-细胞、细胞-药物及药物-载体黏附的生理影响等问题。

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Research

科研

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生物工程

的剪切粘合地图使用SynVivo合成微血管网络代

采用光刻技术蚀刻并由PDMS制成的微流控流动室，用于研究与内皮细胞功能障碍和炎症相关的功能结果。在一个代表性实验中，展示了不同剪切应力对单核细胞黏附于细胞因子激活的内皮细胞单层能力的调节作用。...

芯片上内皮炎症表型分析

来源：Claes, J., et al，在流动条件下研究细菌对血管壁黏附的体外与体内模型。J. Vis. Exp.

一种用于研究剪切力依赖性细菌黏附的体内模型

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发育与表征 体外 微血管网络及内皮细胞[Ca2+]i 和一氧化氮的产生

本文介绍了一种采用注塑成型的方法来构建具有内皮生理特性的微血管。该基于微流控的技术可生成通畅的三维血管网络，并可调节流动、细胞组成、几何结构和生化梯度等参数。文中描述了该制备工艺及若干潜在应用示例。...

三维微血管的微图形化与组装

本方案概述了采用图像引导的激光降解技术，在聚乙二醇二丙烯酸酯（PEGDA）水凝胶中构建源自血管、具有仿生特性的微流体网络的方法。此类仿生微流体系统可应用于组织工程、组织构建 体外...

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在镶嵌式支架上逐步接种细胞以研究出芽型血管

本文提供了一种微流控芯片及一种可自动控制、高效循环的微流控系统，可重现血管新生的初始微环境，使内皮细胞（ECs）同时受到高管腔剪切应力、生理水平的跨内皮流动以及不同分布的血管内皮生长因子（VEGF）的刺激。...

模拟新生血管化初始事件的微流控模型

本实验方案的目的是描述利用简便且易于获取的技术，生成并进行血管化人皮肤等效物的长期培养及其体积分析。在尽可能的情况下，阐述了各步骤的设计原理，以便研究人员能够根据自身研究需求进行定制化调整。...

自组装血管化人皮肤等效物的生成

在本方案中，采用了一种仿生微流控检测方法，该方法能够重现生理相关的微血管环境，并完整再现白细胞黏附/迁移级联过程，用于研究炎症疾病中的白细胞-内皮细胞相互作用。...

一种用于研究炎症过程中白细胞与内皮细胞相互作用的微生理系统

血管新生是发育和疾病中的基本过程，涉及复杂的分子和力学机制。本文介绍一种多功能的2.5D ex vivo...

2.5D 模型 离体 活体组织中出芽式血管生成的力学表征

了解如何使用SynVivo合成微血管网络在单次实验中生成细胞颗粒剪切粘附图谱。该方法通过微流控技术和计算数据库，显著节省时间与试剂成本，适用于药物递送和细胞粘附研究。

利用SynVivo合成微血管网络生成剪切黏附图谱

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