Name: 淋巴免疫治疗和疫苗接种小鼠 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 33 s
Description: 学习淋巴结内疫苗注射技术，通过直接向小鼠腹股沟淋巴结注射疫苗来增强免疫反应。该方法可显著提高疫苗效力并减少剂量需求，适用于免疫学和疫苗学研究。

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作者感谢Iris Erdmann、Barbara von Beust和Julia Maria Martínez-Gómez在小鼠淋巴内免疫方法开发过程中提供的实验帮助。同时感谢Maggy Arras和Nikola Cesarovic允许我们使用他们的手术室进行本视频的制作。&#160;

1. 小鼠麻醉
<ol>
	<li>通过将氯胺酮（分离麻醉剂）和赛拉嗪（镇静剂和镇痛剂）溶于缓冲生理盐水中来配制麻醉剂。最终溶液中氯胺酮和赛拉嗪的浓度分别为 12.5 mg/mL 和 2 mg/mL。</li>
	<li>使用带有 25–30 G 针头的注射器，通过腹腔注射方式将麻醉剂注入小鼠体内。剂量为每 10 g 体重注射 0.1 mL。</li>
	<li>在小鼠眼睛上涂抹眼用软膏，以防止角膜干燥。</li>
	<li>用镊子轻夹小鼠足部或脚趾以确认其是否已充分麻醉。若小鼠对夹捏无反射反应，则可继续进行手术。若小鼠对夹捏出现反射或肌肉收缩，应等待 1–2 分钟后重复测试。若小鼠仍存在反应，则应更换新的动物，并从步骤 1.2 起重复操作流程。</li>
</ol>
2. 小鼠腹股沟区域的外科切口
<ol>
	<li>将小鼠仰卧放置。</li>
	<li>用70%消毒乙醇湿润一侧腹股沟区域。为了获得更好的消毒效果，可在乙醇消毒前剃除腹股沟区域的毛发。</li>
	<li>握住后肢，弯曲髋关节，使髋关节呈约90°角。</li>
	<li>使用弯头显微解剖镊，夹住髋关节弯曲处的腹股沟区皮肤，并轻轻向上提起湿润的皮肤。</li>
	<li>用手术剪在镊子夹起的皮肤上剪出一个小切口（&#60;5 mm）。</li>
	<li>将闭合的手术剪尖端插入切口，然后在切口内打开剪刀以进一步扩大切口。这将导致皮肤撕裂，切口直径应小于10 mm。注意：可使用带有柔性导光管的冷光源以改善视野。在较年老的小鼠中，尤其是雄性，由于腹股沟区域脂肪组织较多，可能难以辨认淋巴结。</li>
</ol>
3. 淋巴内注射
<ol>
	<li>准备一支0.5 ml或更小容量的注射器，配28-30 G的皮下注射针头；短斜面针头可能优于长斜面针头。吸取10 μl待注射的疫苗，并确保注射器内无气泡。</li>
	<li>借助弯头镊子和闭合剪刀的尖端定位腹股沟淋巴结。淋巴结在较白的脂肪组织中呈灰白色，可通过进入和离开淋巴结的输入与输出毛细血管进一步确认。</li>
	<li>用弯头镊子的两个分支夹住淋巴结，使其固定不动。</li>
	<li>取注射器，将针头斜面朝上刺入淋巴结，并确保整个斜面完全进入淋巴结内。</li>
	<li>注射疫苗（10 μl）。若观察到淋巴结肿胀（膨起），则可认为注射成功。若针头插入淋巴结深度不足，部分或全部疫苗可能外漏而未能进入淋巴结；若针头插入过深，注射的疫苗将释放至淋巴结下方的皮下组织。如发生后一种情况，应重复注射或更换一只未经处理的小鼠。</li>
</ol>
4. 缝合切口以关闭切口
<ol>
	<li>打开一包无菌外科缝合线。</li>
	<li>用持针器夹住缝合针针体的远端部分。挤压持针器并收紧，直至第一个棘齿卡住。</li>
	<li>用镊子夹住切口一侧的皮肤（根据术者的偏好，可使用有齿镊、无齿镊或皮肤钩）。插入针头 约 距切口边缘2-3毫米处，从皮肤外侧进针。</li>
	<li>用镊子松开皮肤，用镊子夹住切口的对侧。插入针头 约 距切口边缘2-3毫米处，从皮肤内侧进针。</li>
	<li>松开持针器，用镊子夹住针的末端。将带线的针穿过皮肤，使线在第一个进针点外留出适当长度（若需处理多只小鼠，则留较短的线头；一根缝合针线可为5-10只小鼠进行手术）。</li>
	<li>根据标准外科手术规范打结。若切口不超过10 mm，缝合一针即可；对于较大的切口，需缝合第二针。</li>
</ol>
5. 术后处理
<ol>
	<li>将小鼠放入笼中，并用纸巾覆盖以保持温暖。处理多只小鼠时，可将它们放置在彼此靠近的位置以保温。或者，可将小鼠置于加热垫上，直至其苏醒。</li>
	<li>观察小鼠直至其完全苏醒。</li>
	<li>每日观察小鼠伤口愈合情况以及其他临床症状，如伤口感染等。通常情况下，伤口在操作后两天内基本闭合，七天内完全愈合。</li>
</ol>

<ol><li>Johansen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+intralymphatic+injection+of+peptide+vaccines+enhances+immunogenicity%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Direct intralymphatic injection of peptide vaccines enhances immunogenicity.</a> Eur. J. Immunol. 35, 568-574 (2005).</li>
<li>Maloy, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intralymphatic+immunization+enhances+DNA+vaccination%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Intralymphatic immunization enhances DNA vaccination.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 3299-3303 (2001).</li>
<li>Smith, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancing+DNA+vaccination+by+sequential+injection+of+lymph+nodes+with+plasmid+vectors+and+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Enhancing DNA vaccination by sequential injection of lymph nodes with plasmid vectors and peptides.</a> Vaccine. 27, 2603-2615 (2009).</li>
<li>Kreiter, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intranodal+vaccination+with+naked+antigen-encoding+RNA+elicits+potent+prophylactic+and+therapeutic+antitumoral+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Intranodal vaccination with naked antigen-encoding RNA elicits potent prophylactic and therapeutic antitumoral immunity.</a> Cancer Res. 70, 9031-9040 (2010).</li>
<li>Johansen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+kinetics+determines+immune+reactivity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Antigen kinetics determines immune reactivity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 5189-5194 (2008).</li>
<li>Smith, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymph+node-targeted+immunotherapy+mediates+potent+immunity+resulting+in+regression+of+isolated+or+metastatic+human+papillomavirus-transformed+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Lymph node-targeted immunotherapy mediates potent immunity resulting in regression of isolated or metastatic human papillomavirus-transformed tumors.</a> Clin. Cancer Res. 15, 6167-6176 (2009).</li>
<li>Johansen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll-like+receptor+ligands+as+adjuvants+in+allergen-specific+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Exp.+Allergy%22%5BJournal%5D)">Toll-like receptor ligands as adjuvants in allergen-specific immunotherapy.</a> Clin. Exp. Allergy. 35, 1591-1598 (2005).</li>
<li>Johansen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heat+denaturation%2C+a+simple+method+to+improve+the+immunotherapeutic+potential+of+allergens%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Heat denaturation, a simple method to improve the immunotherapeutic potential of allergens.</a> Eur. J. Immunol. 35, 3591-3598 (2005).</li>
<li>Martinez-Gomez, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intralymphatic+injections+as+a+new+administration+route+for+allergen-specific+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+Arch.+Allergy+Immunol%22%5BJournal%5D)">Intralymphatic injections as a new administration route for allergen-specific immunotherapy.</a> Int. Arch. Allergy Immunol. 150, 59-65 (2009).</li>
<li>Martinez-Gomez, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+MHC+class+II+pathway+of+antigen+presentation+enhances+immunogenicity+and+safety+of+allergen+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Allergy%22%5BJournal%5D)">Targeting the MHC class II pathway of antigen presentation enhances immunogenicity and safety of allergen immunotherapy.</a> Allergy. 64, 172-178 (2009).</li>
<li>Mohanan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Administration+routes+affect+the+quality+of+immune+responses%3A+A+cross-sectional+evaluation+of+particulate+antigen-delivery+systems%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Control+Release%22%5BJournal%5D)">Administration routes affect the quality of immune responses: A cross-sectional evaluation of particulate antigen-delivery systems.</a> J. Control Release. 147, 342-349 (2010).</li>
<li>Waeckerle-Men, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymph+node+targeting+of+BCG+vaccines+amplifies+CD4+and+CD8+T-cell+responses+and+protection+against+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Lymph node targeting of BCG vaccines amplifies CD4 and CD8 T-cell responses and protection against Mycobacterium tuberculosis.</a> Vaccine. 31, 1057-1064 (2013).</li>
<li>von Beust, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+the+therapeutic+index+of+CpG+oligodeoxynucleotides+by+intralymphatic+administration%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Improving the therapeutic index of CpG oligodeoxynucleotides by intralymphatic administration.</a> Eur. J. Immunol. 35, 1869-1876 (2005).</li>
<li>Senti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intralymphatic+immunotherapy+for+cat+allergy+induces+tolerance+after+only+3+injections%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Allergy+Clin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Intralymphatic immunotherapy for cat allergy induces tolerance after only 3 injections.</a> J. Allergy Clin. Immunol. 129, 1290-1296 (2012).</li>
<li>Senti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intralymphatic+allergen+administration+renders+specific+immunotherapy+faster+and+safer%3A+a+randomized+controlled+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Intralymphatic allergen administration renders specific immunotherapy faster and safer: a randomized controlled trial.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 17908-17912 (2008).</li>
<li>Lesterhuis, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Route+of+administration+modulates+the+induction+of+dendritic+cell+vaccine-induced+antigen-specific+T+cells+in+advanced+melanoma+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Route of administration modulates the induction of dendritic cell vaccine-induced antigen-specific T cells in advanced melanoma patients.</a> Clin. Cancer Res. 17, 5725-5735 (2011).</li>
<li>Fadul, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+response+in+patients+with+newly+diagnosed+glioblastoma+multiforme+treated+with+intranodal+autologous+tumor+lysate-dendritic+cell+vaccination+after+radiation+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunother%22%5BJournal%5D)">Immune response in patients with newly diagnosed glioblastoma multiforme treated with intranodal autologous tumor lysate-dendritic cell vaccination after radiation chemotherapy.</a> J. Immunother. 34, 382-389 (2011).</li>
<li>Eizenberg, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acceptance+of+Intanza%28R%29+9+mug+intradermal+influenza+vaccine+in+routine+clinical+practice+in+Australia+and+Argentina%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Ther%22%5BJournal%5D)">Acceptance of Intanza(R) 9 mug intradermal influenza vaccine in routine clinical practice in Australia and Argentina.</a> Adv. Ther. 28, 640-649 (2011).</li>
<li>Durando, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adjuvants+and+alternative+routes+of+administration+towards+the+development+of+the+ideal+influenza+vaccine%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Vaccin%22%5BJournal%5D)">Adjuvants and alternative routes of administration towards the development of the ideal influenza vaccine.</a> Hum. Vaccin. 7, 29-40 (2011).</li>
<li>Barth, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+randomized+trial+of+ex+vivo+CD40L+activation+of+a+dendritic+cell+vaccine+in+colorectal+cancer+patients%3A+tumor-specific+immune+responses+are+associated+with+improved+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">A randomized trial of ex vivo CD40L activation of a dendritic cell vaccine in colorectal cancer patients: tumor-specific immune responses are associated with improved survival.</a> Clin. Cancer Res. 16, 5548-5556 (2010).</li>
<li>Schwaab, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+and+immunologic+effects+of+intranodal+autologous+tumor+lysate-dendritic+cell+vaccine+with+Aldesleukin+%28Interleukin+2%29+and+IFN-%7Balpha%7D2a+therapy+in+metastatic+renal+cell+carcinoma+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Clinical and immunologic effects of intranodal autologous tumor lysate-dendritic cell vaccine with Aldesleukin (Interleukin 2) and IFN-{alpha}2a therapy in metastatic renal cell carcinoma patients.</a> Clin. Cancer Res. 15, 4986-4992 (2009).</li>
<li>Senti, G., Johansen, P., Kundig, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intralymphatic+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Allergy+Clin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Intralymphatic immunotherapy.</a> Curr. Opin. Allergy Clin. Immunol. 9, 537-543 (2009).</li>
<li>Catron, D. M., Itano, A. A., Pape, K. A., Mueller, D. L., Jenkins, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+the+first+50+hr+of+the+primary+immune+response+to+a+soluble+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Visualizing the first 50 hr of the primary immune response to a soluble antigen.</a> Immunity. 21, 341-347 (2004).</li>
<li>Itano, A. A., Jenkins, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+presentation+to+naive+CD4+T+cells+in+the+lymph+node%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Antigen presentation to naive CD4 T cells in the lymph node.</a> Nat. Immunol. 4, 733-739 (2003).</li>
<li>Johansen, P., Mohanan, D., Martinez-Gomez, J. M., Kundig, T. M., Gander, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lympho-geographical+concepts+in+vaccine+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Control+Release%22%5BJournal%5D)">Lympho-geographical concepts in vaccine delivery.</a> J. Control Release. 148, 56-62 (2010).</li>
<li>Johansen, P., von Moos, S., Mohanan, D., Kundig, T. M., Senti, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+routes+for+allergen+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Vacc.+Immunother%22%5BJournal%5D)">New routes for allergen immunotherapy.</a> Hum. Vacc. Immunother. 8, 1525-1533 (2012).</li>
<li>Senti, G., Johansen, P., Kundig, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intralymphatic+immunotherapy%3A+from+the+rationale+to+human+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Top.+Microbiol.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Intralymphatic immunotherapy: from the rationale to human applications.</a> Curr. Top. Microbiol. Immunol. 352, 71-84 (2011).</li>
<li>Duthie, M. S., Windish, H. P., Fox, C. B., Reed, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+defined+TLR+ligands+as+adjuvants+within+human+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Use of defined TLR ligands as adjuvants within human vaccines.</a> Immunol. Rev. 239, 178-196 (2011).</li>
<li>Ribas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intra-lymph+node+prime-boost+vaccination+against+Melan+A+and+tyrosinase+for+the+treatment+of+metastatic+melanoma%3A+results+of+a+phase+1+clinical+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Intra-lymph node prime-boost vaccination against Melan A and tyrosinase for the treatment of metastatic melanoma: results of a phase 1 clinical trial.</a> Clin. Cancer Res. 17, 2987-2996 (2011).</li>
<li>Bedrosian, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intranodal+administration+of+peptide-pulsed+mature+dendritic+cell+vaccines+results+in+superior+CD8%2B+T-cell+function+in+melanoma+patients%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Intranodal administration of peptide-pulsed mature dendritic cell vaccines results in superior CD8+ T-cell function in melanoma patients.</a> J. Clin. Oncol. 21, 3826-3835 (2003).</li>
<li>Lesimple, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injection+by+various+routes+of+melanoma+antigen-associated+macrophages%3A+biodistribution+and+clinical+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunol.+Immunother%22%5BJournal%5D)">Injection by various routes of melanoma antigen-associated macrophages: biodistribution and clinical effects.</a> Cancer Immunol. Immunother. 52, 438-444 (2003).</li>
<li>Brown, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus-transduced+dendritic+cells+injected+into+skin+or+lymph+node+prime+potent+simian+immunodeficiency+virus-specific+T+cell+immunity+in+monkeys%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Adenovirus-transduced dendritic cells injected into skin or lymph node prime potent simian immunodeficiency virus-specific T cell immunity in monkeys.</a> J. Immunol. 171, 6875-6882 (2003).</li>
<li>Fong, L., Brockstedt, D., Benike, C., Wu, L., Engleman, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cells+injected+via+different+routes+induce+immunity+in+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Dendritic cells injected via different routes induce immunity in cancer patients.</a> J. Immunol. 166, 4254-4259 (2001).</li>
</ol>

TMK 是关于人类淋巴内免疫治疗专利的发明人。TMK 曾担任 ImVisioN GmbH、Cytos Biotechnology、MannKind Corporation&#160;和 XBiotech USA Inc. 的科学顾问，并从这些公司获得过差旅费用。PJ 无任何利益冲突需要披露。

淋巴内免疫接种和免疫治疗已被证明适用于刺激抗体反应和T细胞反应。如本视频文章所示，淋巴内疫苗接种是一种在小鼠中快速、简便地诱导强烈免疫反应的方法。经过培训的外科医生可在3至4分钟内完成该操作。该操作也可由两名外科医生协作完成，其中一名通常负责麻醉和缝合，另一名负责切口和注射。该方法的效果比其他免疫方法更依赖于操作者，尤其是在外科医生尚未熟练的情况下。然而，经验丰富的操作者能够通过免疫反应分析实现实验结果的定量重复。该方法的一种改进是将疫苗注射至脾脏1,2。其准备工作与淋巴内注射类似，但切口通常更大，需缝合两针以闭合切口。脾内免疫接种的主要优势在于：脾脏比淋巴结更容易定位和命中，可注射更大的体积并更频繁地进行注射；此外，针头插入或注射对淋巴结造成的损伤可能影响淋巴结的较大区域，而对脾脏造成的损伤则相对局限，影响范围较小且更具局部性。
小鼠淋巴内免疫接种程序可重复进行（例如 在首次注射后经过3-4周的恢复期再进行第二次同侧淋巴结加强免疫注射。若计划更频繁地注射，则应交替使用左右两侧腹股沟淋巴结。每个淋巴结至少可进行两次注射，但需进一步研究以更准确...

疫苗通常通过皮下或肌肉注射以激发免疫反应。该方法的成功依赖于疫苗有效引流至淋巴结，在此抗原呈递细胞可与淋巴细胞相互作用，从而产生T细胞和B细胞免疫应答。此外，所诱导免疫应答的强度和类型还取决于此类相互作用的密度或频率以及微环境本身，尤其是细胞因子的组成。由于仅有一小部分注射到外周组织的疫苗能够到达淋巴结，因此已在小鼠和人类中开展将疫苗直接注射至免疫应答发生部位——淋巴结的接种方法。在人体中，该操作在超声引导下进行，此技术也常用于向淋巴系统注射显像剂以实现可视化和诊断。在小鼠中，该操作具有侵入性：在麻醉动物的腹股沟区域做一个小切口（5–10 mm）1，用镊子定位并固定淋巴结，在直视下注射10–20 μl疫苗；初次注射及淋巴结较小的幼鼠使用10 μl，而20 μl则可用于年龄较大或已致敏、淋巴结较大的小鼠。切口可用外科缝线单针缝合闭合。通过该方法，已成功向小鼠注射质粒DNA2,3,、信使RNA4、多肽1,3,5,6、蛋白质7–10、颗粒11、细菌12以及佐剂7,13，并观察到针对所有类型疫苗的免疫应答显著增强。淋巴内接种法尤其适用于传统疫苗接种无法产生足够免疫力，或可用疫苗量有限且成本高昂的情况。在人体中，淋巴内免疫接种已应用于过敏患者14,15或癌症患者16–21。尽管目前普遍认为淋巴内接种法比肌肉注射和皮下注射等其他可注射方式更具侵入性，但其疼痛感并不高于静脉穿刺15。预计淋巴内疫苗接种将成为预防性和特别是治疗性疫苗接种的替代或补充方法。本文详细描述了小鼠淋巴内疫苗接种的操作步骤。文中所述所有操作均经苏黎世州兽医局批准，并依照瑞士联邦关于用于科研目的动物保护的指南和法规执行。

<table><tbody><tr><td>氯胺酮（Ketasol-100）</td><td>Graeub AG, 瑞士</td><td></td><td>麻醉剂</td></tr><tr><td>赛拉嗪（Rompun）</td><td>Bayer, 德国</td><td></td><td>麻醉剂</td></tr><tr><td>Viscotears 眼用凝胶</td><td>诺华（Novartis）, 瑞士</td><td></td><td>用于防止麻醉期间眼睛干涩</td></tr><tr><td>BD Micro-Fine 0.5 ml</td><td>BD 医疗, 法国</td><td></td><td>29 G 胰岛素注射器，带固定针头</td></tr><tr><td>6-0 Dermalon 单丝尼龙缝线</td><td>Covidien, 马萨诸塞州, 美国</td><td></td><td>用于缝合（0.7 公制，18 G，45 cm，蓝色）</td></tr><tr><td>弯头镊子，4.5 英寸</td><td>Polymed, 瑞士</td><td></td><td>用于切口及夹持淋巴结</td></tr><tr><td>直头手术剪，4.5 英寸</td><td>Polymed, 瑞士</td><td></td><td>用于切口</td></tr><tr><td>持针器，5.5 英寸</td><td>Polymed, 瑞士</td><td></td><td>用于缝合关闭切口</td></tr></tbody></table>

小鼠淋巴内免疫治疗与疫苗接种

Intralymphatic Immunotherapy and Vaccination in Mice

疫苗通常通过皮下或肌肉注射以激发免疫反应。这一过程的成功依赖于疫苗有效引流至淋巴结，在那里抗原呈递细胞可与淋巴细胞相互作用，从而产生所需的免疫反应。所诱导免疫反应的强度和类型还取决于相互作用的密度或频率以及微环境，特别是细胞因子的组成。由于仅有极小部分外周注射的疫苗能够到达淋巴结，因此已在小鼠和人类中采用直接将疫苗注射至腹股沟淋巴结的方式进行免疫接种， 即&#160;淋巴内注射。在人体中，该操作由超声引导进行。在小鼠中，于麻醉动物的腹股沟区域做一个小切口（5–10 mm），在直视下用镊子定位并固定淋巴结，随后注射10–20 μl疫苗。切口使用外科缝线单针缝合关闭。小鼠接种的疫苗包括质粒DNA、RNA、多肽、蛋白质、颗粒、细菌以及佐剂，结果显示针对所有类型疫苗的免疫应答均显著增强。淋巴内接种法特别适用于常规疫苗接种无法产生足够免疫力，或可用疫苗剂量有限的情况。

尽管小鼠淋巴内注射具有手术性质，但该操作简便且相对快速。经过培训的人员可在3-4分钟内完成操作。仅需一针缝合的切口通常在两天内愈合（图1）
淋巴内疫苗接种或免疫已使用mRNA、质粒DNA、多肽、蛋白质、病毒和细菌进行。图2展示了使用主要蜂毒过敏原蛋白磷脂酶A2（PLA2）进行免疫后抗体的产生情况。CBA小鼠在第0、14和28天通过皮下（sc）或淋巴内（iln）注射，分别接种0.01、0.1或10 μg吸附于氢氧化铝上的PLA2。在8周后检测血液中PLA2特异性抗体（IgG2a），结果表明，仅需0.01 μg PLA2即可通过淋巴内途径诱导强烈的抗体反应，而皮下注射则需要10 μg PLA2才能达到类似效果9。
淋巴内疫苗接种也已被用于刺激细胞毒性T细胞反应， 例如 LCMV糖蛋白中的肽段gp33（KAVYNFATM），可在H-2Db背景下与MHC I类分子结合，用于刺激CD8 T细胞。虽然对TCR318小鼠单次皮下注射g...

预防性和治疗性疫苗常因疫苗向淋巴结引流较弱，导致免疫细胞参与不足，难以激发强烈的免疫反应。通过将疫苗直接注射至淋巴结，即所谓的淋巴内注射，可显著提高疫苗的有效性，并减少疫苗使用剂量。

疫苗通常通过皮下或肌肉注射以刺激免疫反应。这一过程的成功依赖于……的有效引流

本实验的总体目标是通过将疫苗直接注射到小鼠淋巴结中，以刺激其免疫反应。首先对小鼠进行麻醉，并在腹股沟区域做一个小切口。接着，定位并固定腹股沟淋巴结。最后一步是将疫苗注射到腹股沟淋巴结。最终，可以通过测量其免疫反应，并与皮下注射等传统递送方法进行比较，来评估淋巴内疫苗接种的效果。通常，刚接触该方法的研究人员在将疫苗准确注入淋巴结时会遇到困难。要协调固定淋巴结、插入针头以及注射疫苗的操作可能需要一定的训练，因为针头容易移位，导致疫苗被注射到淋巴结外。首先，按照随附的文字版实验方案对小鼠进行麻醉。麻醉后应尽快将眼用软膏涂抹于小鼠眼睛，以防止角膜干燥。然后将小鼠置于仰卧位，用镊子夹住小鼠足部以确认其已充分麻醉。若未观察到反应，则用组织覆盖小鼠头部以避光，并用70%乙醇对一侧腹股沟区域进行消毒。随后抬起后肢，将髋关节弯曲至90度角。现在使用弯曲的显微解剖镊子，将弯曲处粘连的皮肤提起，并在皮肤上剪开一个小切口。然后将闭合的剪刀尖插入切口内，打开剪刀，在腹股沟区域撕开直径小于10毫米的孔径。通过其球形且呈灰白色的外观与周围较白的脂肪组织相区分，从而识别淋巴结。使用带有28号短斜面皮下针头的0.5毫升注射器，吸取10微升待注射的疫苗。现在用弯头镊的镊臂将淋巴结固定住。然后将针头斜面向上，插入淋巴结。确保整个斜面完全进入淋巴结内。注射疫苗，并观察局部隆起，以确认注射成功。用持针器打开一包无菌手术缝线。在缝针针体的远端部位夹住缝针。然后通过挤压持针器使其锁定在第一个卡齿位置，拉出缝线。接下来，用镊子夹住切口一侧的皮肤。将针从切口边缘的皮肤外侧插入。然后松开对皮肤的夹持，用镊子夹住切口对侧的皮肤。从切口边缘内侧约两到三毫米处的皮肤内部插入针头。再次用镊子夹住针头末端，然后松开持针器。将带线的针穿过皮肤，使线的一端在第一个进针点外留出适当长度。打上合适的外科结。如果切口大于10毫米。当切口充分闭合时，再缝第二针。将小鼠转移至加热垫上使其恢复。每天观察小鼠伤口愈合情况及其他临床症状，如感染等。在小鼠体内进行的这些淋巴内注射操作简单且相对快速。通常仅需一针缝合的切口可在两天内愈合。此处，抗体产生情况在使用磷脂酶A2蛋白免疫后进行了检测。主要的B型毒液过敏原。通过淋巴内注射0.01微克PLA A2即可诱导强烈的抗体反应，而皮下注射则需要10微克PLA A2才能达到足够的免疫反应水平。在本实验中，采用淋巴内接种法以刺激细胞毒性T细胞反应。对TCR 3 1 8小鼠皮下注射一次G 33，即可诱导出预期的细胞毒性八T细胞反应。在进行淋巴内注射后，该反应大约扩增了六个数量级。同时，在肿瘤攻击实验中也检测了CD四T细胞功能。当免疫小鼠通过静脉注射接受表达NP52的同系EL4肿瘤细胞攻击时，小鼠会发展为全身性淋巴瘤。经淋巴途径免疫的小鼠比经皮下途径免疫的小鼠存活时间显著延长。在人类中亦如此。在超声引导下，通过定位皮下淋巴结进行淋巴内疫苗注射。有趣的是，在人体中，放射性标记的蛋白质示踪剂表明，皮下注射后疫苗在淋巴结中的生物分布较差，而直接将疫苗注入淋巴系统则可高效递送至免疫细胞，从而有效刺激免疫反应。掌握该技术后，每只小鼠的淋巴内疫苗接种过程约需两到三分钟即可完成。

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