通过VIGS介导的正向遗传学筛选鉴定参与非寄主抗性的基因

本研究的总体目标是展示利用病毒诱导基因沉默技术鉴定参与非寄主抗性相关基因的方法，以实现对植物内源基因的VIGS。将携带目标基因片段的烟草脆裂病毒（TRV）载体接种到本氏烟（Nicotiana benthamiana）植株上，随后制备并接种表达绿色荧光蛋白的非寄主病原菌至基因沉默的植物叶片上。接着，在黑暗条件下通过紫外光观察非寄主病原菌的绿色荧光菌落。

为了鉴定影响植物非寄主抗性的基因沉默植株，需通过测序病毒载体中的插入片段来确定目标基因。总体而言，这种由VIX介导的正向遗传筛选方法使研究人员能够便捷地鉴定植物抵抗细菌病原体的非寄主抗性相关基因。在较短时间内，我们认识到将病毒诱导基因沉默介导的正向遗传学与表达GFP的UV病原体相结合，对于鉴定非-ST抗性相关基因具有重要意义。

此前，我们通过筛选由超敏反应诱导的细胞死亡和病害诱导的细胞死亡，进行了一项繁琐的正向遗传筛选。将本氏烟草（Nicotiana benthamiana）种子播种于无土栽培基质中，并在生长室中使其萌发。三周后，将幼苗移栽至单独的花盆中，并在温室中继续培养至少两到三天，然后再接种烟草脆裂病毒（tobacco rattle virus）。

将含有cDNA克隆的农杆菌冻存菌株在冰上逐步解冻。在无菌条件下，将两种载体分别接种至各自的农杆菌培养物中，并划线接种于LB培养基。将农杆菌平板置于28摄氏度培养箱中培养，最多培养两天。

每个克隆培养四个重复菌落，以确保有充足的农杆菌接种物用于两株植物的接种。将TRV1接种于LB液体培养基中。通过离心收集过夜培养的菌液，将菌体重悬于接种缓冲液中，并在室温下以50 RPM振荡孵育三小时。

离心收集细胞后，测定光密度，并将菌体沉淀重悬于5 mM MES缓冲液（pH 5.5）中。随后，使用无针注射器将OD600为0.3的TRV1菌液接种至三至四片烟草（Nicotiana benthamiana）叶片的背面，接种位点为TRV1接种区域。再用牙签蘸取相应TRV2菌落的接种液，在同一叶片上刺孔处理，持续两周。将植株置于低温条件下，并保证充足营养，因为旺盛的生长状态对于病毒诱导基因沉默（VIGS）的高效性至关重要。

以本实验为例，使用的是丁香假单胞菌番茄致病变种 T1 菌株。病原菌应携带一个能够表达绿色荧光蛋白（GFPuv）的质粒。在含有 10 µg/mL 利福平和 50 µg/mL 红霉素的 KB 液体培养基中，于 28°C 条件下培养 PGE 菌株 12 小时。

通过离心收集细菌培养物，然后在暗处使用长波长紫外灯确认绿色荧光的存在。用无菌水洗涤两次后，将细胞重悬于所需浓度的无菌水中，并调整OD 600。随后将相应的病原菌接种至目标部位的轴向侧面。

如有需要，基因沉默叶片上的病斑直径约为1.5厘米。同时测试多种非寄主病原菌在目标基因沉默植株中的生长情况，并设置载体对照以供观察。将细菌培养物接种后培养两到五天。

在暗处将接种后的叶片暴露于长波长紫外光下。务必穿戴皮肤和眼部防护装备。在叶片表面发出的红色荧光背景下，观察叶轴面出现的绿色荧光斑点，即为细菌菌落。

观察宿主病原体发出的绿色荧光，以确认其作为阳性对照的作用。在接种后第2至第5天每天观察病原体的生长情况。列出那些因基因沉默而导致一种或多种非宿主病原体生长的克隆。

为了消除初筛中的假阳性结果，对所选克隆重复进行病毒诱导的基因沉默（VIGS）实验，并再次检测基因沉默植株对非亲和病原菌的响应。对所选克隆使用菌落PCR，以TRV2载体中的ATTB1和ATTB2引物或两端位于克隆位点侧翼的引物扩增插入片段。

将PCR产物在琼脂糖凝胶上电泳，验证单一条带的扩增。然后使用ATTB引物或侧翼位于克隆位点的引物，对T-DNA双元载体中的植物基因插入片段进行测序。利用测序结果进行BLAST比对，鉴定基因的具体信息。

本流程图展示了利用基于烟草脆裂病毒的fIGS在烟草中沉默大量基因的通用实验方案。部分基因沉默植株表现出多种表型改变，包括生长迟缓、黄化和光漂白表型。

这些数据展示了病原菌在接种植物前于暗处经紫外光照射后发出的绿色荧光，以及接种后三天的菌体生长情况；同一叶片在白光下照射的结果作为对照。本实验追踪了表达 G-F-P-U-V 的细菌在三种非寄主植物中的生长情况。

利用病原体来演示基因沉默植物对非寄主病原体敏感性的鉴定过程：在具有免疫能力的野生型非沉默烟草本氏烟（Nicotiana benthamiana）植株中，这些病原体无法生长；然而，在NB sgt植株上，至少有两种非寄主病原体能够生长。

一个基因沉默的叶片。细菌生长的定量数据展示了鉴定在非ST抗性方面受损的基因沉默植株的过程。利用这种由figs介导的正向遗传学方法，我们在大约一年半的时间内对烟草本塞姆氏（Nicotiana benthamiana）中的约5,000个基因进行了沉默，并鉴定了在非ST抗性方面存在缺陷的植株。

例如，此处展示了通过该筛选鉴定出的两种基因沉默植株中非寄主病原菌的生长情况。我们希望已阐明如何对数百个基因进行病毒诱导的基因沉默，并通过观察非寄主病原菌在植株中的生长来评估基因沉默植株，从而解析非寄主抗性。利用这种病毒诱导的基因沉默介导的实验方案，可在约两到三周内实现数百个基因的沉默，随后在约两到五天内，每天花费两到三个小时，检测携带GFP标记的非寄主病原菌在植株中的生长情况。