Name: 成像InlC的分泌由细菌病原体调查感染蜂窝单核细胞增生李斯特氏菌 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-19T22:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 5 s
Description: 了解基于显微成像的高通量筛选方法，用于检测单核细胞增生李斯特氏菌感染宿主细胞的过程。该方法通过荧光标记细菌蛋白InlC，结合siRNA转染技术，帮助研究人员定量分析感染指数并鉴定调控细菌入侵的关键宿主因子。

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P. Cossart 实验室的研究工作得到了巴斯德研究所、法国国家健康与医学研究院、法国国家农业研究院、欧洲研究理事会高级资助（233348）、法国国家研究局（资助号 MIE-SignRupVac）、Louis-Jeantet 基金会以及 Le Roch Les Mousquetaires 基金会的支持。A.K. 获得了巴斯德-巴黎大学国际博士项目/传染病 Carnot 研究所研究生奖学金的资助。我们还承蒙瑞士系统生物学研究计划 SystemsX.ch 框架内的研究与技术开发（RTD）项目 InfectX 获得资助 51RT 0_126008 的支持（资助对象：C.D.）。

1. 细胞与细菌培养物、转染工具及一抗的制备
<ol>
	<li>准备新鲜的琼脂平板，用于从保存在 -80 °C 的细菌甘油 stock（50% 甘油 / 50% 饱和细菌液体过夜培养物）中分离单个 L. monocytogenes 菌落。
	<ol>
		<li>使用预先置于 -80 °C 的铝制架子运输冷冻的细菌甘油 stock，并将细菌划线接种于脑心浸液（BHI）琼脂平板上。</li>
		<li>将平板在 37 °C 培养 48 小时（或直至可分离出单个细菌菌落）。</li>
		<li>此后将该工作平板保存在 4 °C，最长不超过 1 个月（用于接种液体培养物）。</li>
		<li>在本实验方案中，我们使用的是 L. monocytogenes 血清型 1/2a EGDe.PrfA* 菌株，但如图 1所示，L. monocytogenes 血清型 4b P14.PrfA* 菌株也可获得类似结果。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>HeLa ATCC CCL2 细胞在添加 10% 胎牛血清（FBS）的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中培养，不使用抗生素。</li>
	<li>将独立的乱序（对照）和抗 Met siRNA 储液加入黑色 384 孔显微镜细胞培养板中。
	<ol>
		<li>将 160 pmol siRNA 溶于 500 μl 无 RNase 水中，每孔加入 5 μl 该溶液（终浓度：1.6 pmol）。</li>
		<li>将该板保存在 -20 °C，最长不超过 1 年。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过使用 InlC-GST 重组蛋白免疫接种的方法，已获得针对细菌蛋白 InlC 的多克隆兔抗体，方法如先前所述25。</li>
</ol>
2. 反向siRNA细胞转染
<ol>
	<li>感染前72小时，将每孔含有1.6 pmol siRNA溶于5 μl无RNase水中的黑色384孔显微镜细胞培养板置于室温。</li>
	<li>在室温下以300 rcf离心该板3分钟，使可能附着在孔壁上的siRNA沉降至孔底。</li>
	<li>配制含0.4% Lipofectamine RNAiMAX的室温DMEM培养基。</li>
	<li>向每孔加入25 μl DMEM/RNAiMAX转染培养基（转染培养基配制后勿超过20分钟再加入siRNA）。</li>
	<li>前后轻轻晃动培养板，使siRNA与转染液充分混合，随后在室温下静置1小时，以形成siRNA-Lipofectamine复合物。</li>
	<li>用10 ml预热至37 °C的PBS洗涤一个汇合或亚汇合状态的HeLa细胞培养瓶一次。</li>
	<li>向细胞培养瓶中加入1 ml预热至37 °C的胰蛋白酶，37 °C孵育3至5分钟，使HeLa细胞脱落。</li>
	<li>用10 ml预热至37 °C、含16% FBS的DMEM重悬细胞。</li>
	<li>计数细胞，并用含16% FBS的DMEM配制浓度为每毫升12,000个细胞的细胞悬液。</li>
	<li>向384孔板的每孔中加入50 μl细胞悬液。</li>
	<li>快速前后晃动培养板以均匀分布细胞，随后在室温下静置10分钟，使细胞沉降。</li>
	<li>用Parafilm密封培养板，置于37 °C、含5% CO2的湿润环境中培养72小时。</li>
</ol>
3. 细胞感染与染色
<ol>
	<li>感染前一天，从BHI琼脂平板上挑取单个 L. monocytogenes菌落，重悬于15 ml聚苯乙烯管中的5 ml液体BHI培养基中。</li>
	<li>在37 °C条件下，使用摇床振荡培养过夜，以促进细菌生长。</li>
	<li>感染当天，取1 ml过夜培养的L. monocytogenes菌液，在台式离心机中以10,600 rcf离心2分钟，进行洗涤。</li>
	<li>弃去上清液（其中含有分泌型细胞毒素李斯特溶血素O），将沉淀物重悬于1 ml PBS中（重复该洗涤步骤3次）。</li>
	<li>测定细菌在600 nm处的光密度值，并估算细菌数量（OD=1相当于1E9个细菌/ml）。</li>
	<li>在补充有1% FBS的DMEM中配制适当浓度的L. monocytogenes稀释液：对于高侵袭性菌株如EGDe.PrfA*，建议每孔加入含5E4个细菌的30 μl培养基（按2,000个细胞计，感染复数约为25）。</li>
	<li>移除每孔中的细胞培养基（80 μl），并加入30 μl含L. monocytogenes的培养基。</li>
	<li>将培养板在室温下以200 rcf离心5分钟，以同步化感染过程。</li>
	<li>将培养板置于预热的铝块上，在37 °C、含5% CO2的湿润环境中孵育1小时。</li>
	<li>移除含L. monocytogenes的培养基，每孔加入30 μl预热的、补充有10% FBS和40 μg/ml庆大霉素的DMEM，以杀灭胞外的L. monocytogenes。</li>
	<li>在37 °C、含5% CO2的环境中，将培养板置于预热的金属块上继续孵育4小时。</li>
	<li>配制含8%甲醛的PBS溶液（应新鲜配制，以确保使用的是甲醛单体而非多聚甲醛聚合物）。</li>
	<li>不弃去细胞培养基，每孔加入30 μl含8%甲醛的PBS溶液（终浓度为4%），室温孵育15分钟。</li>
	<li>移除固定液，每孔用80 μl PBS洗涤三次（每孔最终保留80 μl PBS）。</li>
	<li>将兔抗InlC血清用含0.2%皂苷的PBS按1:250比例稀释。</li>
	<li>弃去PBS后，每孔加入10 μl一抗溶液，室温孵育30分钟。</li>
	<li>弃去一抗溶液，每孔用40 μl PBS洗涤四次。</li>
	<li>将Alexa Fluor 546标记的山羊抗兔二抗（1:250稀释）、DAPI溶液（1:1,500稀释）和phalloidin-Dy647（1:150稀释）共同溶于含0.2%皂苷的PBS中。</li>
	<li>每孔加入10 μl上述二抗染色液，室温孵育30分钟。</li>
	<li>弃去二抗染色液，每孔用40 μl PBS洗涤四次（每孔最终保留40 μl PBS，并密封培养板）。</li>
	<li>培养板可立即进行成像，或避光保存于4 °C（用铝箔包裹）以备后续分析。</li>
</ol>
4. 图像采集与分析
<ol>
	<li>使用自动显微镜配备的10倍物镜，在三个不同通道（350 nm、546 nm 和 647 nm）中获取图像（建议每个孔优先获取9张图像）。</li>
	<li>可使用图像分析软件（如CellProfiler）测量InlC信号，该软件可分别利用DAPI和鬼笔环肽染色对细胞核和细胞体进行自动分割。</li>
</ol>

<ol><li>Pizarro-Cerdá, J., Kühbacher, A., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entry+of+Listeria+monocytogenes+in+mammalian+epithelial+cells%3A+an+updated+view%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">Entry of Listeria monocytogenes in mammalian epithelial cells: an updated view.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2, 1-17 (2012).</li>
<li>Mackaness, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+resistance+to+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cellular resistance to infection.</a> Journal of Experimental Medicine. 116, 381-406 (1962).</li>
<li>Tilney, L. G., Portnoy, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+filaments+and+the+growth%2C+movement%2C+and+spread+of+the+intracellular+bacterial+parasite%2C+Listeria+monocytogenes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Actin filaments and the growth, movement, and spread of the intracellular bacterial parasite, Listeria monocytogenes.</a> Journal of Cell Biology. 109, 1597-1608 (1989).</li>
<li>Mengaud, J., Chenevert, J., Geoffroy, C., Gaillard, J. L., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+structural+gene+encoding+the+SH-activated+hemolysin+of+Listeria+monocytogenes%3A+listeriolysin+O+is+homologous+to+streptolysin+O+and+pneumolysin%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Identification of the structural gene encoding the SH-activated hemolysin of Listeria monocytogenes: listeriolysin O is homologous to streptolysin O and pneumolysin.</a> Infection and Immunity. 55, 3225-3227 (1987).</li>
<li>Gaillard, J. L., Berche, P., Frehel, C., Gouin, E., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entry+of+L.+monocytogenes+into+cells+is+mediated+by+internalin%2C+a+repeat+protein+reminiscent+of+surface+antigens+from+gram-positive+cocci%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Entry of L. monocytogenes into cells is mediated by internalin, a repeat protein reminiscent of surface antigens from gram-positive cocci.</a> Cell. 65, 1127-1141 (1991).</li>
<li>Mengaud, J., Dramsi, S., Gouin, E., Vazquez-Boland, J. A., Milon, G., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pleiotropic+control+of+Listeria+monocytogenes+virulence+factors+by+a+gene+that+is+autoregulated%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Pleiotropic control of Listeria monocytogenes virulence factors by a gene that is autoregulated.</a> Molecular Microbiology. 5, 2273-2283 (1991).</li>
<li>Kocks, C., Gouin, E., Tabouret, M., Berche, P., Ohayon, H., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L.+monocytogenes-induced+actin+assembly+requires+the+actA+gene+product%2C+a+surface+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">L. monocytogenes-induced actin assembly requires the actA gene product, a surface protein.</a> Cell. 68, 521-52 (1992).</li>
<li>Glaser, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+genomics+of+Listeria+species%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Comparative genomics of Listeria species.</a> Science. 294, 849-852 (2001).</li>
<li>Toledo-Arana, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Listeria+transcriptional+landscape%3A+from+saprophytism+to+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The Listeria transcriptional landscape: from saprophytism to virulence.</a> Nature. 459, 950-956 (2009).</li>
<li>Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Illuminating+the+landscape+of+host-pathogen+interactions+with+the+bacterium+Listeria+monocytogenes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Illuminating the landscape of host-pathogen interactions with the bacterium Listeria monocytogenes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 108, 19484-19491 (1073).</li>
<li>Mengaud, J., Ohayon, H., Gounon, P., Mege, R. -M., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E-cadherin+is+the+receptor+for+internalin%2C+a+surface+protein+required+for+entry+of+L.+monocytogenes+into+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">E-cadherin is the receptor for internalin, a surface protein required for entry of L. monocytogenes into epithelial cells.</a> Cell. 84, 923-932 (1996).</li>
<li>Shen, Y., Naujokas, M., Park, M., Ireton, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((InIB-dependent+internalization+of+Listeria+is+mediated+by+the+Met+receptor+tyrosine+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">InIB-dependent internalization of Listeria is mediated by the Met receptor tyrosine kinase.</a> Cell. 103, 501-510 (2000).</li>
<li>Lecuit, M., Hurme, R., Pizarro-Cerda, J., Ohayon, H., Geiger, B., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+alpha-and+beta-catenins+in+bacterial+uptake%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">A role for alpha-and beta-catenins in bacterial uptake.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 97, 10008-10013 (2000).</li>
<li>Ireton, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+phosphoinositide+3-kinase+in+bacterial+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A role for phosphoinositide 3-kinase in bacterial invasion.</a> Science. 274, 780-782 (1996).</li>
<li>Ireton, K., Payrastre, B., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Listeria+monocytogenes+protein+InlB+is+an+agonist+of+mammalian+phosphoinositide+3-kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The Listeria monocytogenes protein InlB is an agonist of mammalian phosphoinositide 3-kinase.</a> Journal of Biological Chemistry. 274, 17025-17032 (1999).</li>
<li>Pizarro-Cerdá, J., Jonquières, R., Gouin, E., Vandekerckhove, J., Garin, J., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+protein+patterns+associated+with+Listeria+monocytogenes+InlA-+or+InlB+phagosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Distinct protein patterns associated with Listeria monocytogenes InlA- or InlB phagosomes.</a> Cellular Microbiology. 4, 101-115 (2002).</li>
<li>Pizarro-Cerdá, J., Payrastre, B., Wang, Y. -J., Veiga, E., Yin, H. L., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+II+phosphatidylinositol+4-kinases+promote+Listeria+monocytogenes+entry+into+target+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Type II phosphatidylinositol 4-kinases promote Listeria monocytogenes entry into target cells.</a> Cellular Microbiology. 9, 2381-2390 (2007).</li>
<li>Hamon, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+modifications+induced+by+a+family+of+bacterial+toxins%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Histone modifications induced by a family of bacterial toxins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 104, 17555-17559 (2007).</li>
<li>Ribet, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Listeria+monocytogenes+impairs+SUMOylation+for+efficient+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Listeria monocytogenes impairs SUMOylation for efficient infection.</a> Nature. 464, 1192-1195 (2010).</li>
<li>Rämet, M., Manfruelli, P., Pearson, A., Mathey-Prevot, B., Ezekowitz, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+genomic+analysis+of+phagocytosis+and+identification+of+a+Drosophila+receptor+for+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional genomic analysis of phagocytosis and identification of a Drosophila receptor for E. coli.</a> Nature. 416, 644-648 (2002).</li>
<li>Agaisse, H., Burrack, L. S., Philips, J. A., Rubin, E. J., Perrimon, N., Higgins, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+RNAi+screen+for+host+factors+required+for+intracellular+bacterial+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-wide RNAi screen for host factors required for intracellular bacterial infection.</a> Science. 309, 1248-1251 (2005).</li>
<li>Cheng, L. W., Viala, J. P., Stuurman, N., Wiedemann, U., Vale, R. D., Portnoy, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+RNA+interference+in+Drosophila+S2+cells+to+identify+host+pathways+controlling+compartmentalization+of+an+intracellular+pathogen%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Use of RNA interference in Drosophila S2 cells to identify host pathways controlling compartmentalization of an intracellular pathogen.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 102, 13646-13651 (2005).</li>
<li>Ripio, M. T., Domínguez-Bernal, G., Lara, M., Suárez, M., Vazquez-Boland, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Gly145Ser+substitution+in+the+transcriptional+activator+PrfA+causes+constitutive+overexpression+of+virulence+factors+in+Listeria+monocytogenes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">A Gly145Ser substitution in the transcriptional activator PrfA causes constitutive overexpression of virulence factors in Listeria monocytogenes.</a> Journal of Bacteriology. 179, 1533-1540 (1997).</li>
<li>Rajabian, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bacterial+virulence+factor+InlC+perturbs+apical+cell+junctions+and+promotes+cell-to-cell+spread+of+Listeria%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The bacterial virulence factor InlC perturbs apical cell junctions and promotes cell-to-cell spread of Listeria.</a> Nature Cell Biology. 11, 1212-1218 (2009).</li>
<li>Gouin, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Listeria+monocytogenes+InlC+protein+interferes+with+innate+immune+responses+by+targeting+the+I%CE%BAB+kinase+subinit+IKK%CE%B1%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">The Listeria monocytogenes InlC protein interferes with innate immune responses by targeting the IκB kinase subinit IKKα.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 107, 17333-17338 (2010).</li>
<li>Pizarro-Cerdá, J., Lecuit, M., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+and+analysing+invasion+of+mammalian+cells+by+bacterial+pathogens%3A+the+Listeria+monocytogenes+system%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Measuring and analysing invasion of mammalian cells by bacterial pathogens: the Listeria monocytogenes system.</a> Methods in Molecular Microbiology. 31, 161-177 (2002).</li>
<li>Snijder, B., Sacher, R., Rämö, P., Damm, E. M., Liberali, P., Pelkmans, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Population+context+determines+cell-to-cell+variability+in+endocytosis+and+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Population context determines cell-to-cell variability in endocytosis and virus infection.</a> Nature. 461, 520-523 (2009).</li>
</ol>

我们没有需要披露的内容。

我们的InlC检测方案成功的关键在于多个参数，包括使用状态良好的细胞系，其细胞质需足够大，以便明确检测到InlC信号。本文所介绍的实验方案推荐使用HeLa CCL2细胞，因其胞质空间较大，特别适用于本实验；其他HeLa克隆，如HeLa Kyoto细胞，虽然细胞质较小，但仍可配合我们的感染方案使用（HeLa Kyoto细胞特别适用于分割分析，因为其细胞之间通常不与邻近细胞重叠，而HeLa CCL2细胞则常出现重叠现象）。细胞质非常小的细胞，如多形核细胞或巨噬细胞，不建议与本方案联合使用。
本研究所展示的成像实验方案存在一个局限性，即在对照条件下，单层细胞中应仅有极少量细胞被感染，以确保系统具备足够的分辨能力：否则，若感染细胞数量过少，则难以检测感染率的变化，尤其是在研究预期可降低感染水平的潜在分子功能时。这一局限性在使用HeLa细胞时尤为突出，因为HeLa细胞仅表达Met作为单核细胞增生李斯特菌（L. monocytogenes）蛋白InlB的表面受体，因此大多数L. monocytogenes菌株对其侵袭效率较低。一种替代方案是使用极高的感染复数...

A correction was made to <a href="http://www.jove.com/video/51043">Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes</a>. Three authors were omitted from the article at the time of publication. The acknowledgments section was also updated. The author list has been updated from:
Andreas K&#252;hbacher1,2,3, Edith Gouin1,2,3, Pascale Cossart1,2,3, Javier Pizarro-Cerd&#225;1,2,3 
1Unit&#233; des Interactions Bact&#233;ries Cellules, Pasteur Institute, 2INSERM U604, 3Institut National de la Recherche Agronomique (INRA), USC2020
to
Andreas K&#252;hbacher1,2,3, Edith Gouin1,2,3, Jason Mercer4, Mario Emmenlauer5, Christoph Dehio5, Pascale Cossart1,2,3, Javier Pizarro-Cerd&#225;1,2,3 
1Unit&#233; des Interactions Bact&#233;ries Cellules, Pasteur Institute,2INSERM U604, 3Institut National de la Recherche Agronomique (INRA), USC2020, 4Institute of Biochemistry, ETH Z&#252;rich 5Focal Area Infection Biology, Biozentrum, University of Basel
The acknowledgments where update from:
Research in P. Cossart laboratory is supported by the Pasteur Institute, the Institut National de la Sant&eacute; et de la Recherche M&eacute;dicale, the Institut National de la Recherche Agronomique, ERC Advanced Grant (233348), the Agence Nationale de la Recherche (Grant MIE-SignRupVac), the Louis-Jeantet Foundation and the Fondation Le Roch Les Mousquetaires. A.K. is a recipient of a scholarship from the Pasteur-Paris University International Doctoral Program/Institut Carnot Maladies Infectieuses. We thank Jason Mercer for optimizing the cellular transfection protocol.
to
Research in P. Cossart laboratory is supported by the Pasteur Institute, the Institut National de la Sant&eacute; et de la Recherche M&eacute;dicale, the Institut National de la Recherche Agronomique, ERC Advanced Grant (233348), the Agence Nationale de la Recherche (Grant MIE-SignRupVac), the Louis-Jeantet Foundation and the Fondation Le Roch Les Mousquetaires. A.K. is a recipient of a scholarship from the Pasteur-Paris University International Doctoral Program/Institut Carnot Maladies Infectieuses. We acknowledge support by grant 51RT 0_126008 for the Research and Technology Development (RTD) project InfectX in the frame of SystemsX.ch, the Swiss Initiative for Systems Biology (to C.D.).

A correction to author list has been made for the article Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes. Three authors were omitted from the article at the time of publication.

Erratum: Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

革兰氏阳性菌Listeria monocytogenes是一种食源性病原体，可侵入宿主细胞，破坏其内化形成的液泡，并在宿主细胞的细胞质中进行复制1。L. monocytogenes在实验室环境中易于操作（生长迅速，对健康个体毒性较低），同时在细胞和动物模型中可稳定保持细菌的毒力特征（如溶血活性、白细胞增多），因此自20世纪60年代起被首次用作研究胞内寄生现象以及建立抗感染细胞免疫理论基础的重要模型2。在20世纪80年代末至90年代初，对细菌胞内生命周期的深入解析3以及对主要细菌毒力因子的分子特征鉴定4-7，进一步推动了L. monocytogenes作为关键分子工具在宿主细胞功能调控与研究中的广泛应用。在Listeria属中存在非致病性（L. innocua）与致病性（L. monocytogenes）物种，这为开展比较基因组学研究8提供了条件；结合近年来L. monocytogenes全转录组的完整解析9，显著加深了我们对L. monocytogenes作为人类病原体的进化过程及其作为感染研究模型系统的理解10。
L. monocytogenes 通过细菌表面蛋白InlA和InlB分别与宿主细胞受体E-钙黏蛋白和Met相互作用，诱导其进入宿主细胞11-12最初的候选基因研究揭示了α/β-连环蛋白-肌动蛋白连接是InlA入侵途径中的一个重要组分13 以及磷脂酰肌醇3-激酶（PI 3-K）在InlB依赖性侵袭级联反应中的关键效应作用14-15蛋白质组学和基于功能的检测方法随后使得新型细胞骨架组分的鉴定成为可能16 以及脂质第二信使17 宿主细胞侵袭所必需的。转录研究18 基于质谱的定量蛋白质组学19 最近为宿主信号通路的激活以及免疫反应抑制的机制提供了新的见解 L. monocytogenes 感染。基于小干扰RNA（siRNA）沉默技术，通过失活大量基因（如激酶组、全基因组）的系统生物学方法，近期为分析特定细胞功能（包括吞噬作用和病原体内化）背景下的全局宿主信号级联反应开辟了新的途径。20全基因组siRNA筛选已先前用于研究感染所必需的细胞级联反应 单核细胞增生李斯特菌 在吞噬作用中 果蝇 S2细胞21-22，但此类分析尚未在非吞噬细胞中进行，而这类细胞是感染的关键靶标 体内.
我们优化了一种用于显微检测L. monocytogenes感染晚期阶段的实验方案，适用于上皮细胞中细菌入侵的高通量siRNA研究。本实验利用一种高侵袭性的L. monocytogenes菌株，该菌株在PrfA（L. monocytogenes毒力因子的主要转录调控蛋白）中携带一个点突变6：该突变（称为PrfA*）使PrfA组成型激活23，从而增强侵袭蛋白InlA和InlB的表达，因此促进细菌进入原本不易被感染的非吞噬细胞。我们对感染的检测基于分泌型细菌蛋白InlC在细胞质中的累积情况：InlC是一种多效性效应分子，主要由胞质内的L. monocytogenes优先表达9，不仅参与细菌的细胞间传播24，还可调节宿主免疫应答25。通过荧光标记细胞内细菌分泌的InlC，不仅可清晰区分感染与未感染细胞，还可作为终点检测指标，用于后续解析感染过程的各个阶段：入侵、液泡逃逸、胞质内细菌增殖及细胞间传播。该基于显微镜的实验方案可与siRNA筛选相结合，以研究L. monocytogenes感染宿主细胞过程中所涉及的细胞通路。

<table><tbody><tr><td>脑心浸液培养基（Bacto Brain Heart Infusion）</td><td>BD</td><td>237500</td><td>用于液体BHI培养基的配制</td></tr><tr><td>琼脂粉（Bacto Agar）</td><td>BD</td><td>214010</td><td>添加至液体BHI中以制备BHI琼脂平板</td></tr><tr><td>热灭活胎牛血清（Heat-Inactivated Fetal Bovine Serum）</td><td>Biowest</td><td>51830-500</td><td></td></tr><tr><td>DMEM培养基</td><td>Invitrogen</td><td>61965-026</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine RNAiMax转染试剂</td><td>Invitrogen</td><td>13778-100</td><td></td></tr><tr><td>庆大霉素（Gentamicin）</td><td>Sigma</td><td>G1397-10ML</td><td></td></tr><tr><td>甲醛（16%）</td><td>EMS</td><td>15710</td><td>每次实验前新鲜配制</td></tr><tr><td>抗兔Alexa Fluor 546荧光二抗</td><td>Invitrogen</td><td>A-11035</td><td></td></tr><tr><td>DAPI染色剂</td><td>Invitrogen</td><td>D-1306</td><td></td></tr><tr><td>鬼笔环肽-Dy647（Phalloidin Dy647）</td><td>Dyomics</td><td>647-33</td><td></td></tr><tr><td>阴性对照siRNA（siRNA Scramble）</td><td>Dharmacon</td><td>D-001810-10</td><td></td></tr><tr><td>Met基因特异性siRNA（siRNA Met）</td><td>Dharmacon</td><td>L-003156-00-0005</td><td></td></tr><tr><td>黑色384孔显微细胞培养板</td><td>Corning</td><td>3985</td><td></td></tr><tr><td>AxioObserver Z1显微镜</td><td>Zeiss</td><td>431007 9901</td><td></td></tr><tr><td>sCMOS相机</td><td>Andor</td><td>Neo</td><td></td></tr><tr><td>Metamorph图像分析软件</td><td>Molecular Devices</td><td>4000</td><td></td></tr><tr><td>CellProfiler图像分析软件</td><td>Broad Institute</td><td>公共软件，可从 &lt;a href=&quot;http://www.cellprofiler.org/&quot; target=&quot;_blank">http://www.cellprofiler.org/&lt;/a&gt; 获取</td><td></td></tr></tbody></table>

成像 inlc 分泌以研究细菌病原体listeria monocytogenes的细胞感染

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

细菌胞内病原体可被视为用于解析细胞信号级联的分子工具，因其具有精细操控和颠覆宿主靶组织感染所必需的细胞功能的能力。在这些细菌病原体中，Listeria monocytogenes 是一种革兰氏阳性微生物，已被用作研究胞内寄生的典范，用于表征细胞免疫反应，并在发现调控细胞骨架和膜运输动态的分子通路过程中发挥了关键作用。本文中，我们描述了一种可靠的显微检测方法，用于检测 L. monocytogenes 感染的晚期阶段，该方法基于对分泌型细菌蛋白 InlC 的荧光标记，该蛋白在感染细胞的细胞质中积累；该检测方法可与自动化的高通量小干扰RNA筛选相结合，以鉴定参与感染上调或下调的细胞信号通路。

细胞质内 InlC 的荧光标记为单核细胞增生李斯特菌（L. monocytogenes）感染细胞提供了可靠的检测指标，如图1所示：显微照片中的中央细胞被 P14.PrfA*23 菌株高度感染，这一现象可在相差图像中观察到（箭头所示，图1A），并通过 DAPI 信号得到证实，在 DAPI 图像中可清晰分辨单个细菌（图1B）。InlC 染色（与图1C中的 DAPI 染色叠加）显示，该分泌蛋白在感染细胞的细胞质中大量积累，从而能够明确识别感染宿主细胞的形态。使用荧光鬼笔环肽对肌动蛋白细胞骨架进行染色（图1D），可提供整个接种细胞单层的形态学信息，并进一步说明邻近未感染细胞（细胞核以星号标记）不显示任何 InlC 标记。值得注意的是，由于细胞质中 InlC 的水平依赖于细胞内细菌的数量，我们观察到免疫荧光检测到的 InlC 信号与每个细胞内的L. monocytogenes数量之间存在相关性：如图1所示，感染细菌数量较少...

Listeria monocytogenes 是一种革兰氏阳性细菌病原体，常被用作研究胞内寄生现象的主要模型。在小干扰RNA筛选背景下对晚期 L. monocytogenes 感染阶段进行成像，可实现对细菌感染靶向宿主细胞所必需的细胞通路进行全局性研究。

成像 InlC 分泌以研究细菌病原体Listeria monocytogenes的细胞感染

细菌胞内病原体因其能够精细地操控宿主细胞信号通路级联反应，可被视为解析细胞信号转导通路的分子工具。

以下实验的总体目标是通过在RNA干扰（irna）检测体系中定量分析单核细胞增生李斯特菌（listeria monocytogenes）的细胞侵袭能力，以发现细菌感染所必需的新型细胞功能。该目标首先通过细胞irna反向转染来实现，以抑制特定的宿主细胞功能；随后，将细胞接种单核细胞增生李斯特菌，该病原菌将根据siRNA处理所影响的细胞功能，对细胞产生差异性感染。接下来，通过免疫荧光处理感染的细胞，以标记细胞核。通过检测细胞骨架中的肌动蛋白以及细菌蛋白INLC的分布结果，可在显微镜下根据INLC蛋白在单个细胞内的分布情况识别感染细胞，并将其与未感染细胞区分开。该技术相较于现有方法（如庆大霉素侵袭实验）的主要优势在于，可采用FU方式进行应用。因此，该方法可能通过鉴定嗜肺军团菌进入细胞所必需的新信号通路，从而回答细胞微生物学领域的关键科学问题。在细胞感染前72小时，将一块黑色384孔显微镜细胞培养板置于室温下解冻，每孔含有1.6皮摩尔的siRNA溶于5微升无RNA酶的水中，以使siRNA充分溶解并沉降至孔底；随后在室温下以300 × g离心3分钟。准备室温的DMEM培养基，添加0.4%脂质体RNAiMax。将转染液加入S-I-R-N-A之前，孵育时间不得超过20分钟。向384孔板的每孔中加入25微升转染液。前后移动培养板，使INA与转染液充分混匀。然后将培养板在室温下放置一小时，以使siRNA脂质复合物形成。用10毫升37摄氏度预热的PBS洗涤一次来自融合或亚融合细胞培养瓶的HeLa细胞。通过向细胞培养瓶中加入1毫升37摄氏度预热的胰蛋白酶，并在37摄氏度孵育3至5分钟，使HELOC细胞脱离。将细胞重悬于10毫升37摄氏度预热的DMEM中，该DMEM补充有16% FBS。计数细胞后，在 DMEM 中制备每毫升含 12,000 个细胞的细胞悬液，DMEM 中需添加 16% FBS。向 384 孔板的每个孔中加入 50 微升细胞悬液。快速左右移动培养板以分散细胞，随后在室温下静置 10 分钟使细胞沉降。用封口膜密封培养板，置于 37 °C、含 5% CO2 的湿润环境中孵育 72 小时。在感染前一天，于预热的铝块上，从 A BHI 琼脂平板上挑取单个单核细胞增生李斯特菌（L. monocytogenes）菌落，悬浮于 5 毫升液体 BHI 培养基中，置于 15 毫升聚苯乙烯试管内。建议使用高侵袭性菌株。在37摄氏度的摇床中孵育过夜，以促进细菌在次日的生长。将过夜培养的单核细胞增生李斯特菌（L. monocytogenes）在台式离心机中以10,600 RCF离心两分钟。弃去上清液，并将沉淀物重悬于1毫升磷酸盐缓冲液（PBS）中，随后再次离心。再次弃去上清液，并将沉淀重悬于一毫升 PBS 中。以 PBS 重复洗涤沉淀，共洗涤四次。最后一次 PBS 洗涤后，测定细菌在 600

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免疫学与感染

成像InlC的分泌由细菌病原体调查感染蜂窝<em&gt;单核细胞增生李斯特氏菌</em

本文描述了在活体动物中进行细菌感染生物发光成像的方法。通过改造病原体使其表达荧光素酶，从而实现对活体动物体内感染的光学整体成像。可利用表达荧光素酶的病原体感染动物模型，并通过生物发光成像实时观察疾病的发展过程。...

利用荧光素酶对小鼠细菌感染进行成像

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来源： Chetrit, D., 等结合活细胞成像与冷冻电子断层扫描技术解析时空动态特征 嗜肺军团菌 Dot/Icm 分泌系统 视频实验杂志.

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通过摄入污染食物在小鼠中经口传播Listeria monocytogenes

多模态成像是研究小动物模型中细菌定植的一种有价值的方法。本方案概述了用生物发光的鼠柠檬酸杆菌（Citrobacter rodentium）感染小鼠，并利用融合三维漫射光成像断层扫描与μCT成像技术对细菌定植进行长期监测，从而生成鼠柠檬酸杆菌（C.

4D 多模态成像 鼠伤寒柠檬酸杆菌 小鼠感染

单核细胞增生李斯特菌 可导致孕妇胎儿感染以及易感人群的脑膜炎。某些细菌亚群可定植于心脏组织，引起患者及实验动物的心肌炎。本文介绍了一种用于评估的实验方案 单核细胞增生李斯特菌 心肌细胞侵袭 体外 感染动物心脏定植情况。...

评估细菌在培养的心脏细胞中的侵袭能力及感染小鼠心脏定植情况的方法 单核细胞增生李斯特菌

本方案描述了如何用单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes，L. monocytogenes）EGD 菌株感染 C57BL/6J 小鼠，以及在感染后通过自然杀伤（NK）细胞、自然杀伤 T（NKT）细胞和适应性 T...

Listeria monocytogenes 实验感染作为研究宿主干扰素-γ反应的模型

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利用细菌病原体探究宿主在细胞和有机体水平的应答

本文介绍了一种简单的共聚焦成像方法，用于可视化小鼠次级淋巴器官中分泌细胞因子干扰素γ的细胞原位定位。该方案可拓展应用于多种组织中其他细胞因子的可视化研究。...

小鼠脾脏中原位干扰素γ产生的成像 单核细胞增生李斯特菌 感染

了解基于显微成像的高通量筛选方法，用于检测单核细胞增生李斯特氏菌感染宿主细胞的过程。该方法通过荧光标记细菌蛋白InlC，结合siRNA转染技术，帮助研究人员定量分析感染指数并鉴定调控细菌入侵的关键宿主因子。

成像 InlC 分泌以研究细菌病原体Listeria monocytogenes的细胞感染

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