组织工程:建设多细胞三维支架的层状细胞片交货
2014年10月3日
为了创建复杂组织的高度组织结构，必须将多种材料和细胞类型组装成一个集成的复合材料。 这种组合设计结合了器官特异性分层细胞片和两种不同的生物衍生材料，其中包含强大的纤维基质基质，以及用于增强新血管形成的内皮细胞。
该程序的总体目标是使用细胞片构建组织工程贴剂。这是通过首先用热敏聚合物聚丙烯酰胺（也称为 p nipam）处理细胞培养表面来实现的。第二步是在聚合物包被的表面上高密度培养目标细胞，以形成细胞片。
接下来，通过降低板温度来提升片材，这使得细胞可以作为片状细胞从板中分离。最后一步是移动完整的细胞片，而不会将它们撕裂到植入结构上。最终，可以使用简单的光学显微镜来显示细胞片在其作过程中已经创建和维护，同时创建可植入的组织工程材料。
与将细胞像水凝胶一样嵌入基质的现有方法相比，该技术的主要优点是，在这种技术中，可以产生和维持细胞的侧缘作为功能性组织。这些方法还可以促进组织工程领域的进一步研究。例如，当细胞处于这种有组织的状态时，移植后的存活情况如何？
演示此程序的是我实验室的博士后研究员 William Turner 博士和 Snapshot sand 女士。要开始此过程，请将 2.6 克 P nipam 溶解在 2 毫升 60% 甲苯、40% 己烷溶液中。接下来，将混合物加热至 60 摄氏度 10 分钟，搅拌至尼帕姆 P 溶解。
然后将滤纸切成直径为 60 毫米的圆圈，并将其放入布赫纳漏斗中。通过 Buchner 漏斗将溶液过滤到预先称重的玻璃烧杯中。将烧杯和内容物放在钟形真空中过夜。
然后，用 p nipam 称量烧杯。随后将异丙醇添加到 P nipam 中，制成 50 50 重量的溶液。接下来，将 2 毫升溶液放在组织培养板表面，并在紫外线下涂布 5 分钟。
然后用 2 毫升温热的 PBS 洗涤板两次，然后再用于细胞培养。在此过程中，首先，通过用两毫升温热的 PBS 洗涤细胞来分离大鼠主动脉平滑肌细胞。接下来，向细胞中加入 3 毫升胰蛋白酶或其他裂解分离溶液，并孵育 5 分钟。
然后向细胞中加入 3 毫升含有 10% FBS 的培养基或 PBS。之后，将细胞收集在锥形管中并计数。随后，以 1000 RPM 离心细胞 5 分钟。
吸出上清液并将细胞重悬于生长培养基中。接下来，将含有细胞的培养基以达到 100% 汇合的浓度放在 35 毫米热敏板上，然后在 37 摄氏度下孵育过夜，以保持细胞对板的粘附。现在收集内皮细胞并将它们分散到单个细胞溶液中。
使用一种 x 胰蛋白酶、acuate 或细胞解离缓冲液也可用于单细胞分散。接下来，用等量的大豆胰蛋白酶抑制剂或 10% FBS 的 PBS 溶液使胰蛋白酶失活。然后将细胞收集在 15 毫升锥形管中。
用血细胞计数器计数细胞，并计算 4 毫米贴片的贴片尺寸所需的体积，使用 200 万个内皮细胞，提取 200 万个细胞并将它们放入新的 15 毫升锥形管中。然后将细胞离心 5 分钟，吸出上清液，将细胞以沉淀形式留在锥形管中。现在按照公司方案准备高 aurin 水凝胶。
将高 aurin 和液体明胶以 1：1 的比例混合。随后将总最终体积的 80% 转移到含有沉淀的锥形管中，将内皮细胞重悬于高 aurin 明胶混合物中。接下来，将悬浮细胞转移到纤维基质中。
加入交联剂最终总体积的 20%，并在 37 摄氏度下孵育 1 小时。在此步骤中，从培养箱中取出含有细胞的 35 毫米 P nypa 处理板，并将其置于细胞培养罩中。在室温下，从细胞中快速吸出培养基。
然后在板中加入两毫升 37 摄氏度、6% 的普通明胶，趁明胶仍然温暖，将金属晶格放入明胶中，将其浸入普通明胶表面下方。然后，将整个盘子放在冰上 5 到 7 分钟，让明胶变硬。七分钟后，用刮刀小心地将明胶边缘与板的侧面分开。
接下来，用镊子将金属晶格从板上提起。将细胞片转移到培养皿中，并将其放在纤维基质水凝胶组合的顶部。向组织培养板中加入 2 毫升 37 摄氏度的培养基并孵育过夜，以使细胞片粘附在水凝胶表面。
同时，在溶液预热后去除金属晶格。在这里，细胞在 Pippa 包被的表面上培养，然后以片状移动到纤维基质的表面。未使用明胶金属晶格转移的早期试验导致小破烂斑块。
该图像代表了结合了线粒体追踪器、红色染色大鼠主动脉平滑肌细胞、钙绿色荧光人脐静脉内皮细胞和透射光图像的早期贴片设计合成图片。这是细胞片与更强的基质纤维基质水凝胶组合的复合。该合成图像是通过更坚固的基底纤维基质从贴片底部拍摄的，而细胞片的合成图像是在基底纤维基质上拍摄的。
片状中的水凝胶组合细胞覆盖了基础纤维基质水凝胶组合，由于细胞聚集，其边缘的荧光增加。这是构建体的透射图像，DPI 中的自发荧光天然纤维基质如下所示。遵循此程序，其他组织工程实验可以回答其他问题，例如细胞排列和通讯如何影响移植成功。
这项技术使组织工程研究人员能够探索移植多种细胞类型的复杂方法。不要忘记，使用溶剂可能非常危险。执行此程序时应始终采取预防措施，例如佩戴适当的口罩和化学头罩。
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概述
本研究聚焦于使用细胞片构建组织工程补丁的方法。该过程包括用热敏聚合物处理细胞培养表面，并培养细胞以创建完整的细胞片用于植入。
研究的主要组成部分
科学领域
- 组织工程
- 细胞培养技术
- 生物材料
背景
- 创建复杂组织的有序结构需要多种材料和细胞类型。
- 利用器官特异性的分层细胞片可增强组织整合。
- 生物衍生材料可以支持新血管的形成。
- 热敏聚合物有助于细胞片的脱离。
研究目的
- 开发构建组织工程补丁的方法。
- 利用细胞片改进植入技术。
- 展示在操作过程中维持细胞完整性的可行性。
使用的方法
- 用聚丙烯酰胺（pNIPAM）处理细胞培养表面。
- 在聚合物涂层表面高密度培养细胞。
- 通过降低温度提升细胞片以使其脱离。
- 将完整的细胞片转移到待植入的构建物上。
主要结果
- 成功创建可在操作过程中不撕裂的细胞片。
- 光学显微镜确认了过程中细胞片的完整性。
- 该方法允许构建可植入的组织工程材料。
- 展示了在工程组织中增强血管形成的潜力。
结论
- 研究提出了一种可行的方法来创建组织工程补丁。
- 使用热敏聚合物进行细胞片操作是有效的。
- 这种方法可能显著推进组织工程领域的发展。
常见问题
Executive Industry Relevance
This method enables the construction of multicellular 3D scaffolds using layered cell sheets, addressing a key challenge in regenerative medicine: delivering organized, multi-cellular constructs with preserved cell-cell interactions and vascular potential. By preserving lateral cell borders and enabling sheet transfer onto biomatrix composites, the technique supports predictive confidence in preclinical models of tissue integration and function. It offers a scalable, off-the-shelf approach for therapeutic tissue design applicable across multiple organ systems beyond cardiac tissue.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by maintaining cell sheet integrity and lateral adhesions during manipulation.
- Operational Value: Provides a reproducible system for functional target validation through organized cell delivery.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream compound evaluation by creating standardized, implantable tissue constructs.
- Operational Value: Supports assay readiness through temperature-dependent sheet detachment and transfer, enabling scalable workflow.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Enhances disease relevance by combining organ-specific cells with neovascular-permissive hydrogels and endothelial cells.
- Operational Value: Facilitates translational continuity from discovery to preclinical validation via off-the-shelf, implantable patches.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from early target validation through lead identification to preclinical studies, supporting hypothesis testing and mechanistic de-risking in tissue engineering applications.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling controlled delivery of layered cell types with preserved interactions.
- Screening: Enables assay readiness through reproducible cell sheet formation and transfer onto biomatrix platforms.
- Analytics: Generates quantitative outputs via light microscopy and fluorescence tracking to assess sheet integrity and vascular integration.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by constructing implantable patches with vascular potential for functional tissue assessment.
- Enterprise Reuse: Represents a reusable capability for generating off-the-shelf tissue constructs across multiple organ targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence through maintained cell-cell interactions and organized tissue architecture.
- Operational Value: Standardization and scalability via temperature-sensitive polymer coating and sheet lifting.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions by reducing mechanistic ambiguity in tissue integration and survival.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization through enhanced predictive value in preclinical tissue models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, biomaterials handling, and temperature-sensitive polymer techniques.
- Depends on UV crosslinking, hydrogel preparation, and precise temperature control for sheet detachment.
- Necessitates cross-team standardization for consistent sheet quality and transfer efficiency.
- Involves adaptation considerations when applying to different cell types or organ-specific matrices.
- Includes practical limitations such as solvent hazards during pNIPAM preparation and the need for aseptic handling throughout.
