Name: 组织工程:建设多细胞三维支架的层状细胞片交货 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: 学习利用温敏聚合物pNIPAM培养高密度细胞片，通过降温完整剥离并转移至纤维基质构建可植入组织工程补片。该方法可保持细胞片完整性，促进血管生成，为组织工程研究提供新途径。

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本工作由加州再生医学研究所（CIRM；RN2-00921-1）的新教员奖 II、美国国立卫生研究院（NIH）资助的国家研究奖（F32-HL104924）以及 CIRM 培训基金（TG21163）资助。材料由 Glycosan Biosystems Inc / BioTime 和匹兹堡大学 Stephen Badylak 博士提供。

1. 聚N-异丙基丙烯酰胺（pNIPAAM）包被板的制备
<ol>
	<li>将2.6 g pNIPAAM溶解于2 ml的60%甲苯/40%正己烷溶液中。</li>
	<li>将混合物加热至60 °C，搅拌10分钟，直至pNIPAAM完全溶解。</li>
	<li>将滤纸剪成直径为60 mm的圆形，并放入布氏漏斗中。</li>
	<li>将溶液通过布氏漏斗过滤至已预先称重的玻璃烧杯中（切勿使用塑料器皿，因为正己烷会溶解塑料）。</li>
	<li>将烧杯及其内容物置于钟罩式真空干燥器（24 psi）中过夜&#160;（16小时）。注意：在残留物与异丙醇反应之前，其易被氧化，因此务必避免接触氧气。</li>
	<li>称量烧杯重量，以确定pNIPAAM的重量。</li>
	<li>向pNIPAAM中加入异丙醇，配制成50/50 w/w的溶液。</li>
	<li>取2 ml该溶液滴加于组织培养板表面，并在紫外光下照射涂层5分钟。</li>
	<li>使用前用2 ml温热的PBS洗涤培养板两次。</li>
</ol>
2. 细胞片的制备
注意：可通过多种不同方法制备目标器官原代细胞的细胞片，或如本文所述，通过在组织培养表面包被温敏性聚合物来制备。多家供应商也提供预先包被的温敏性培养板。
注意：本方案适用于使用35 mm培养皿进行培养。简言之，细胞首先在37 °C下孵育至少24小时，直至达到汇合状态，以建立相邻细胞之间的侧向连接。为释放细胞片，将培养皿置于低于32 °C的温度下。随后将细胞片转移至含有新生血管许可性水凝胶及血管内皮细胞的强基底纤维基质中。
<ol>
	<li>分离细胞群体。注意：该方法取决于具体的细胞来源及细胞类型。本示例使用大鼠主动脉平滑肌细胞（RASMC），这些细胞是从大鼠腹主动脉中分离得到的原代平滑肌细胞。</li>
	<li>用 2 ml 温热的 PBS 洗涤细胞。</li>
	<li>向细胞中加入 3 ml 胰蛋白酶（或其他裂解/解离溶液），作用 5 分钟。</li>
	<li>加入 3 ml 含 10% 胎牛血清（FBS）的培养基或磷酸盐缓冲液（PBS）以终止胰蛋白酶反应。</li>
	<li>将细胞收集至锥形管中，并对部分样品进行计数。</li>
	<li>以 1,000 rpm（228 × g）离心 5 分钟。</li>
	<li>吸除上清液，并将细胞重悬于生长培养基中（RASMC 使用 SmGM2 加 bullet kit 培养基）。</li>
	<li>将含细胞的培养基接种至 35 mm 温度敏感型培养皿——即 pNIPAAM 包被的培养板，接种密度应达到 100% 汇合度。注意：对于 RASMC，确定的接种密度为 100,000 个细胞/cm2；但由于传代过程中存在细胞损失，实际接种时使用该数值的 120%。</li>
	<li>将培养皿置于 37 °C 培养箱中过夜培养。注意：保持 37 °C 的培养温度对维持细胞在培养板上的贴附至关重要。</li>
</ol>
3. 基础基质的制备
注意：可使用多种三维纤维基质将坚固的纤维基质层置于精细的细胞片层之间。一些实例包括：明胶海绵（gelfoam）、生物玻璃（bioglass）、天然去细胞化材料26或纳米纺丝材料27,28。本研究中所用的猪膀胱基质（UBM）由我们的合作者Badylak博士慷慨提供29。
<ol>
	<li>使用前，需确定基质的特性，包括若使用脱细胞基质时其无细胞成分27,28、细胞特异性活力以及孔隙空间22。</li>
	<li>将预灭菌的基质切割成所需的尺寸和形状。注意：此处使用打孔器切割出直径为 4 mm 的圆形。</li>
</ol>
4. 将内皮细胞接种至新生血管许可型水凝胶中
注意：内皮细胞可来源于多种组织，包括干细胞或前体细胞的分化。本实验使用 HuVECs。
<ol>
	<li>使用任何允许性水凝胶（如纤维蛋白、胶原凝胶），只要其交联时间足够短，以保证细胞保持活性。注：此处使用基于透明质酸（HA）并通过二硫键交联的水凝胶。</li>
	<li>按照公司提供的操作说明制备 HA 水凝胶。</li>
	<li>收集内皮细胞，并使用 1× 胰蛋白酶将其分散为单细胞悬液。注：也可使用 Accutase 或细胞解离缓冲液进行单细胞分散。</li>
	<li>通过加入等量的大豆胰蛋白酶抑制剂（若需避免细胞接触血清）或含 10% FBS 的 PBS 来终止胰蛋白酶活性，并将溶液/细胞收集至 15 ml 锥形管中。</li>
	<li>对细胞进行计数，并根据补片尺寸（先前已量化）计算所需体积。注：对于 4 mm 的补片，此处使用 200 万个内皮细胞。</li>
	<li>取出 200 万个细胞，转移至新的 15 ml 锥形管中。</li>
	<li>在 228 × g 条件下离心 5 分钟。</li>
	<li>吸除上清液，保留锥形管中的细胞沉淀。</li>
	<li>将 HA 和明胶液体材料按 1:1 比例混合，然后将总体积的 80% 加入含有细胞沉淀的锥形管中。</li>
	<li>将内皮细胞在 1:1 的 HA/明胶混合液中重新悬浮。</li>
	<li>将重悬的细胞混合液转移至第 2 步制备的基础纤维基质中。</li>
	<li>加入所需交联剂总体积的 1/5（即 20%）。</li>
	<li>在 37 °C 下孵育 1 小时。</li>
</ol>
5. 细胞片的分离
<ol>
	<li>从培养箱中取出含有细胞的35 mm经pNIPAAM处理的培养板，置于室温下的细胞培养操作台中。</li>
	<li>迅速吸除细胞中的培养基，并加入2 ml已加热至37 °C的6%正常明胶溶液。</li>
	<li>在明胶仍保持温热时，将金属网格放入明胶中，使其完全浸没于明胶液面以下（影片1）。</li>
	<li>将整个培养板置于冰上5至7分钟，使明胶凝固。</li>
	<li>7分钟后，用刮铲小心地将明胶边缘与培养板壁分离，然后用镊子将金属网格从培养板中提起。注意：6%明胶及细胞片应随网格一同被提起。</li>
	<li>将细胞片转移至培养皿中，放置在基础纤维基质-水凝胶复合物上方，并小心地将网格置于构建物顶部。注意：细胞片的顶面仍应朝上。</li>
	<li>加入2 ml预热的培养基（37 °C）。</li>
	<li>孵育过夜&#160;，使细胞片贴附于水凝胶表面。</li>
	<li>待溶液恢复至培养温度后（约1小时），或于次日，移除金属网格。</li>
</ol>

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</ol>

我们无任何披露事项。

该实验方案的关键步骤包括：用温敏性聚合物包被培养板表面，以及在降低培养板温度后对细胞片进行操作。由于不同细胞具有不同的物理特性（如黏附性），因此每种细胞类型的剥离时间都应进行优化。本方案中第二个也是最具挑战性的环节是细胞片的操作，这是组织构建方法中的关键部分。细胞片中的单层细胞非常脆弱，若使用镊子操作，容易发生撕裂。此外，当细胞片未被固定时，容易收缩并发生折叠。本方案提出的利用支撑筛进行细胞片转移的方法，有助于对脆弱的细胞片进行操作。
本文所述的设计方法为创建适用于多种组织工程应用的细胞片提供了一种成本相对较低的途径。此外，在大学实验室中采用该方法制备聚异丙基丙烯酰胺（pNIPAAM）包被的培养板可实现标准化操作，且可根据不同细胞类型和表面条件对实验方案进行相应调整。使用细胞片而非无序的单细胞有助于组织构建，并可能提高移植组织的存活率与整合能力。然而，这些构建物的体内（in vivo）递送方法（本方案中未提及）需针对每种组织类型进行优化。未来的研究方向包括探索并优化特定器官系统的组织制备方法。

单独注射细胞和/或单一材料在其他器官系统中已显示出不一的效果，在心脏再生中的效果则更为有限。5,7-12 目前，干细胞来源的细胞可通过多种递送方式输送至受损组织，包括：直接将细胞注射至组织内，或通过血液供应进行灌注。13-17 其他研究已尝试单独植入细胞、单独植入材料，或联合使用材料载体以促进受损器官的再生。18-21 该设计结合了多种策略，可提供材料强度、多种材料的图案化结构以及支持多种细胞类型共存的环境。
具体而言，脱细胞纤维基质为构建物提供了基础的物理强度，使其在必要时可适用于缝合植入患者体内。基质中的孔隙空间填充了内皮细胞，并置于一种允许新生血管形成的水凝胶中22，以快速建立植入物的血管化。随后，该复合结构与预先图案化的细胞片层整合，以增强细胞间通讯，并更接近模拟天然组织1,23-25。分层细胞补片的整体制备流程如图1中的流程图所示。

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;试剂&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Calcein-AM</td><td>Invitrogen</td><td>C3099</td><td>细胞示踪剂 / 活细胞染料</td></tr><tr><td>Lysotracker Red</td><td>Invitrogen</td><td>L7528</td><td>细胞示踪剂</td></tr><tr><td>Neutral Red</td><td>Sigma</td><td>N7005</td><td>可见细胞染料</td></tr><tr><td>pNIPAAM</td><td>Sigma Aldrich</td><td>412780250</td><td>聚（&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;-异丙基丙烯酰胺）</td></tr><tr><td>甲苯</td><td>Sigma Aldrich</td><td>244511-1L</td><td></td></tr><tr><td>己烷</td><td>Sigma Aldrich</td><td>296090-1L</td><td></td></tr><tr><td>RAOSMC</td><td>Lonza</td><td>R-ASM-580</td><td>大鼠主动脉平滑肌细胞</td></tr><tr><td>SmGM2</td><td>Lonza</td><td>CC-4149</td><td>平滑肌细胞培养基</td></tr><tr><td>HUVEC</td><td>Invitrogen</td><td>C-003-5C</td><td>人脐静脉内皮细胞</td></tr><tr><td>HyStem</td><td>Glycosan/Biotime</td><td></td><td></td></tr><tr><td>异丙醇</td><td>VWR International</td><td>BDH1133-4LP</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶</td><td>Corning Cellgro</td><td>25-053-C1</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>14287-072</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>16140-071</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;专用设备&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>滤纸</td><td>Ahlstrom&amp;nbsp;</td><td>6310-0900&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>布氏漏斗&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich&amp;nbsp;</td><td>Z247308&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>UpCell 培养板&amp;nbsp;</td><td>Nunc&amp;nbsp;</td><td>2014-11&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>紫外灯</td><td>Jelight Company&amp;nbsp;</td><td>UVO Cleaner Model No.42</td><td></td></tr></tbody></table>

组织工程：构建用于递送分层细胞片的多细胞三维支架

Tissue Engineering: Construction of a Multicellular 3D Scaffold for the Delivery of Layered Cell Sheets

许多组织（例如成人心脏）在受损后无法有效再生2,3。组织工程策略提出了多种创新方法，以协助机体实现修复与恢复。例如，组织工程技术可能有助于减轻心肌梗死（MI）后的心脏重构，并有望将整体心脏功能提升至接近MI前的正常水平4。与任何功能性组织一样，心脏组织的成功再生需要将多种细胞类型在适宜的微环境信号引导下递送至损伤部位，以促进移植细胞/组织移植物的整合与存活。工程化组织应综合考虑多个参数，包括可溶性信号分子、细胞间相互作用，以及作为递送载体的基质材料，评估这些材料对细胞存活、材料强度以及促进细胞向组织有序组装的影响。目前一些仅采用直接注射细胞移植物的研究忽略了这些关键要素2,5,6。能够整合上述所有要素的组织设计方案尚未建立。本文展示了一种集成化设计示例，即通过将具有特定图案的细胞片层与两种不同类型的生物来源材料进行层叠组装，其中材料含有目标器官的细胞类型及内皮细胞，以促进“组织”内新生血管的形成。尽管本研究聚焦于类心脏组织的构建，但该组织设计只需进行极少的结构和材料调整，即可应用于除心脏外的多种器官，并旨在成为一种即用型再生治疗产品。本实验方案包含五个详细步骤：首先，使用温度敏感性聚（N-异丙基丙烯酰胺）（pNIPAAM）包被组织培养皿；其次，在包被后的培养板/微图案化表面培养组织特异性细胞，使其形成具有强侧向黏附性的细胞片层；第三步，通过将多孔基质与允许新生血管形成的水凝胶及内皮细胞结合，构建组织的基础基质层；最后，将细胞片层从pNIPAAM包被的培养皿上剥离，并转移至基础基质层上，从而完成整体结构的构建。

流程图（图1）展示了制备多层补片的整体方法。当温度降至32 °C以下时，细胞片会从经pNIPAAM处理的培养板上脱落。随后将细胞片置于交联水凝胶上层，该水凝胶下方的纤维基质中已接种内皮细胞（图1）。经预处理的温敏性培养板也可用于制备细胞片。特殊的拓扑结构表面可用于对细胞进行特定的图案化（即，定向排列）30。
基础纤维基质可通过脱细胞化天然组织基质或静电纺丝方法制备。此处，将纤维材料裁剪成直径为4 mm的片状，作为补片基底（图2A）。对该材料的表征对于确定可用于填充孔隙空间的水凝胶用量至关重要。本实验所用基质此前已被表征并发表22。
将HA水凝胶液态组分施加到纤维基质后，含有内皮细胞的水凝胶发生交联。荧光/透射显微镜显示，被包裹在交联水凝胶中的活细胞经Calcein AM染色后可见（图2B）。
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为了构建高度有序的复杂组织结构，必须将多种材料和细胞类型组装成一个整体复合物。这种组合设计结合了器官特异性的分层细胞片，以及两种不同的生物来源材料，后者包含强韧的纤维基质基础和内皮细胞，以促进新生血管的形成。

许多组织（如成人人类心脏）在受损后无法有效再生。组织工程领域的策略提出了对……的创新方案

本实验的总体目标是利用细胞片构建组织工程补片。首先，用温敏性聚合物聚丙烯酰胺（也称为 p nipam）处理细胞培养表面；第二步是在该聚合物包被的表面上高密度培养目标细胞，以形成细胞片。接下来，通过降低培养板的温度使细胞片从培养板上抬起，从而使细胞以完整的细胞片形式脱离培养板。最后一步是将完整的细胞片在不撕裂的情况下转移至用于植入的支架结构上。最终，可通过简单的光学显微镜观察来证实细胞片在操作过程中已成功形成并保持完整，从而制备出可植入的组织工程材料。与现有将细胞包埋于水凝胶等基质中的方法相比，该技术的主要优势在于能够形成并维持细胞的侧向边界，从而构成功能性组织。该方法还可推动组织工程领域的进一步研究，例如，当细胞处于这种有序状态时，其在移植后的存活情况如何？本实验操作将由我实验室的博士后研究员William Turner博士和Ms. Snapshot Sand Do共同演示。开始此操作时，将2.6克P nipam溶解于2毫升60%甲苯和40%己烷的混合溶液中。接着，将混合物加热至60摄氏度并持续10分钟，同时搅拌，直至P nipam完全溶解。然后将滤纸剪成直径60毫米的圆形，放入布氏漏斗中。通过布氏漏斗将溶液过滤至一个预先称重的玻璃烧杯中。将烧杯及其内容物置于真空干燥器中过夜。随后，称量含有 P NIPAM 的烧杯。接着向 P NIPAM 中加入异丙醇，配制成 50:50（重量:重量）的溶液。然后取两毫升该溶液滴加到组织培养板表面，并在紫外光下照射五分钟进行包被。然后用2 mL温热的PBS洗涤培养板两次，再用于细胞培养。在此步骤中，首先通过用2 mL温热的PBS洗涤细胞，分离大鼠主动脉平滑肌细胞。接着，向细胞中加入3 mL胰蛋白酶或其他消化解离溶液，孵育5分钟。然后向细胞中加入3毫升含有10% FBS的培养基或PBS。之后，将细胞收集到锥形管中并进行计数。随后，以1000 RPM离心5分钟。吸去上清液，并将细胞重悬于生长培养基中。接着，将含有细胞的培养基以达到100%汇合度的浓度接种至35毫米温敏培养板中，于37摄氏度孵育过夜，以维持细胞对培养板的黏附。现在收集内皮细胞，并将其分散成单细胞悬液。使用一倍体积的胰蛋白酶、乙酸或细胞解离缓冲液也可用于单细胞分散。接下来，加入等量的大豆胰蛋白酶抑制剂或含10%胎牛血清的磷酸盐缓冲液（PBS）以终止胰蛋白酶的消化作用。然后将细胞收集至15毫升的锥形离心管中。使用血细胞计数板对细胞进行计数，并计算适用于补片尺寸所需的体积；对于直径4毫米的补片，使用200万个内皮细胞。随后，取出200万个细胞，置于新的15毫升锥形管中。然后以5分钟离心，吸除上清液，使细胞在锥形管中形成沉淀。接下来，按照公司提供的操作说明制备高aurin水凝胶。按1:1的比例混合高浓度aurin与液态明胶。随后，将终体积80%的混合液转移至含有细胞沉淀的锥形管中，用高浓度aurin明胶混合液重悬内皮细胞。接着，将重悬的细胞转移至纤维基质中。加入交联剂，体积为终体积的20%，在37摄氏度孵育一小时。在此步骤中，从培养箱中取出含有细胞的35毫米P nypa处理板，放入细胞培养操作台。在室温下，迅速吸除细胞中的培养基。然后在凝胶仍保持温热时，向培养皿中加入 2 毫升 37 摄氏度、6% 的正常明胶，将金属网格放入明胶中，使其完全浸没于正常明胶表面之下。随后将整个培养皿置于冰上 5 至 7 分钟，使明胶凝固。7 分钟后，用刮铲小心地将明胶边缘与培养皿壁分离。接下来，用镊子将金属网格从培养板上提起。将细胞片转移到培养皿中，并放置在纤维基质水凝胶组合物的上方。向组织培养板中加入 2 毫升 37 摄氏度的培养基，过夜培养，以使细胞片贴附于水凝胶表面。在此期间，待溶液升温后，移除金属网架。此处，细胞在经Pippa包被的表面培养，随后以细胞层的形式整体转移至纤维基质表面。早期未使用明胶金属网架进行转移的试验，导致形成了细小且破碎的细胞片。该图像为早期贴片设计的复合图，结合了线粒体示踪剂、红色染色的大鼠主动脉平滑肌细胞、钙绿荧光标记的人脐静脉内皮细胞以及透射光图像。此图为细胞片层与更坚固的基底纤维基质水凝胶结合后的复合图像。该复合图像通过更坚固的基底纤维基质从贴片底部拍摄获得，而细胞片层的复合图像则是在基底纤维基质上方拍摄的。水凝胶复合细胞在片状覆盖层中覆盖于基底纤维基质水凝胶复合物之上，边缘处因细胞聚集而显示出增强的荧光。此为该构建体的透射图像，其中在DPI下可见自体荧光的天然纤维基底基质。通过该方法，其他组织工程实验可进一步探讨细胞排列与细胞间通讯如何影响移植成功率等问题。该技术可使组织工程领域的研究人员探索多种细胞类型复合移植的复杂方法。请注意，使用溶剂可能具有极高危险性。在进行该操作时，应始终采取预防措施，例如佩戴合适的口罩和使用化学通风橱。

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