模拟胰腺神经可塑性：体外双神经元可塑性检测

以下实验的总体目标是研究外周神经元对不同胰腺微环境的反应性改变。首先，从正常人胰腺和病变胰腺组织中制备全组织裂解液；随后，分离新生大鼠的背根神经节（DRG）细胞，并用所提取的组织裂解液进行处理，从而实现上述研究目的。

接着，经过48小时孵育后，对细胞进行固定，以进行后续的双重免疫荧光染色。结果显示了在不同组织提取物中培养的神经元的 neurite 密度分支模式以及胶质细胞密度的差异。该方法有助于推动神经胃肠病学领域的研究，例如分子介质在不同胃肠道疾病中神经可塑性改变的作用。

尽管该方法可为胰腺疾病的不同神经营养特性提供见解，但也同样适用于其他系统，例如癌症或整个胃肠道的炎症状态。我们最初是在与儿科系统神经病变疾病（如 Ong 病）领域的研究人员开展合作时萌生了使用该方法的想法，并将其应用于人胰腺组织的均质化。将 5×5×5 毫米的胰腺组织块直接从 −80 °C 转移至液氮中。

然后将冷冻的组织块先放入含有金属解离球的匀浆管中，再立即放入组织匀浆器中进行匀浆，注意在解离后不要让组织解冻。将呈固体粉末状的匀浆物重新悬浮于 300 至 500 微升冰预冷的 0.1 倍 PBS 中。请勿使用任何裂解缓冲液，因为这可能会。

裂解神经元后，在4°C条件下以21,130 × g离心均质液至少15分钟。收集澄清的上清液，其中含有组织提取物；收集人胰腺细胞系的细胞培养上清液。将细胞在正常生长培养基中培养至至少70%至80%融合度。

当细胞准备就绪后，用细胞培养级 PBS 至少洗涤细胞三次，并将其在无血清培养基中培养最多 48 小时。接着，通过 Bradford 蛋白质测定法测定组织匀浆液或细胞系上清液的蛋白浓度。然后分装组织提取物和细胞系上清液，使提取物或上清液在神经元培养基中的终浓度为 100 微克/毫升。

并在负80摄氏度下保存。使用一只去头的P2至P12新生大鼠，切开皮肤并暴露椎体柱，然后进行前路椎板切除术以暴露脊髓。

接下来，暴露并摘除背根神经节或dRRGs。将DRG置于含有庆大霉素和甲硝唑的冰冻MEM中。继续收集DRG，从尾部DRG开始，逐步向上至颈部上段DRG。

完成后，收集到的 52 个背根神经节已足够用于一个 24 孔板。接下来，使用显微剪刀将背根神经节与其根部和神经分离。然后剪除任何残留的外周和中枢突起。

背根神经节采集后，将其置于含有II型胶原酶的HBSS中，在37摄氏度下孵育20至30分钟。孵育结束后，使用直径逐渐减小的注射器反复吹打背根神经节进行机械解离。

请注意，过量的胰蛋白酶可破坏神经元，但对胶质细胞的破坏作用较小。一旦含有背根神经节（DRGs）的培养基变得浑浊，将悬液在93.9 ×g下离心5分钟。然后弃去培养基并重悬。

用神经基础培养基重悬细胞，以准备细胞培养。使用血细胞计数板估算神经元和胶质细胞的总数。然后将细胞接种到13毫米预包被的盖玻片上。

在24孔板中，所使用的包被物取决于实验目的。接着，用神经基础培养基填充各孔，使细胞在孔内过夜贴壁。次日，解冻添加了组织提取物的培养基或添加了细胞系上清液的培养基。

接下来，吸除DRG中的接种培养基，并用PBS进行一次可选的、非常轻柔的洗涤。然后缓慢地将组织提取物补充培养基或细胞系上清液补充培养基滴加到细胞上，使其终浓度达到每毫升100微克。随后，将细胞在37摄氏度条件下，在含有组织提取物或细胞系上清液补充培养基中继续培养48小时。

吸去培养基，并用4%多聚甲醛固定以进行免疫染色。进行双重免疫荧光染色时，使用神经元特异性和胶质细胞特异性标记物来分析形态学特征。使用配备CCD相机的倒置光学显微镜，结合自动分析软件，在200倍放大条件下测量神经突密度。

通过叠加一个50 × 50微米的网格，测量神经元培养物的神经突密度，计算每个方格内相交纤维的纤维密度。在每张盖玻片上选取四至五张具有代表性的显微照片，针对其中生长最密集的四个不同区域重复此分析。从每张盖玻片中随机选取30个孤立神经元，标记其神经突和胞体，测量神经突外延生长的平均每神经元分支数、平均分支长度及胞体大小。图中显示的是用正常胰腺组织提取物培养的背根神经节（DRG）神经元。

相比之下，用慢性胰腺炎或胰腺癌组织提取物培养的背根神经节神经元表现出更高的神经突密度，如图所示。以下是用不同人胰腺组织提取物培养的肌间神经丛神经元。

在慢性胰腺炎或胰腺癌提取物中培养的肌间神经丛神经元，相较于在正常胰腺提取物中培养的神经元，表现出更长的神经突起和更复杂的分支模式。当将背根神经节（DRG）神经元与胰腺癌细胞的上清液共培养时，也观察到神经密度增加，这与使用组织提取物所观察到的现象相似。然而，当选择性耗竭或阻断某些神经营养因子（如我们的蛋白或神经生长因子）时，这种增加是可逆的。

Ggl 细胞对不同的胰腺组织提取物也表现出不同的反应，慢性胰腺炎或胰腺癌组织提取物可增强背根神经节（DRG）来源的胶质细胞培养物中的胶质细胞生长及胶质细胞计数。尽管该效应在胰腺癌提取物作用下比慢性胰腺炎提取物更为显著。一旦掌握该技术，若操作得当，可在四到五小时内完成。

该方法为神经胃肠病学领域的研究人员探索不同胃肠道疾病（包括炎症性和恶性胃肠道疾病）中的神经可塑性机制奠定了基础。观看本视频后，您将深入了解如何分离外周神经元以研究胰腺神经可塑性，以及如何在胃肠道疾病中应用该系统及其他神经改变和神经可塑性检测方法。