Name: 本体感觉和张力感受器在蟹四肢：学生实验室练习 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-24T17:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 58 s
Description: 探索甲壳类动物步足关节本体感受器和肌肉张力感受器的生理功能与解剖结构。本研究通过生理记录和解剖技术，揭示感觉反馈机制在运动控制中的作用，为神经科学和比较生物学研究提供重要见解。

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作者感谢 Hyewon Cooper 提供的艺术贡献。

1. 从柄节-指节（PD）神经分离并记录电活动
<ol>
	<li>从后方抓住螃蟹的头胸甲，避开其螯足，用镊子夹住基节（meropodite）的近端部分。该肢体将发生自切，以防止动物失血过多而死亡。处理蓝蟹时需格外小心，因其具有较强的攻击性且动作迅速。 
	<img alt="甲壳动物肢体解剖图：基节、腕节、掌节、指节、PD器官。" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51050/51050fig1.jpg" width="500px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 1"> 
	图1. 螃蟹的第一步足。图中叠加显示了弦音器官（阴影区域）的解剖位置。双箭头指示进行PD神经实验时截断肢体的位置。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51050/51050fig1highres.jpg" target="_blank">点击此处查看大图</a>。</li>
	<li>在掌节（propodite）与腕节（carpodite）之间做一切口。弃去腕节及其相连的基节（图1）。</li>
	<li>使用11号刀片的解剖刀，在掌节的有色（外侧）表皮上切出一个较大的窗口（图2 和 图3）。注意：切勿切得过深。</li>
	<li>将解剖刀刀片插入表皮下方，并沿表皮平行滑动，以去除表皮层。此操作可切断附着于表皮的肌纤维。</li>
	<li>采用相同技术，在掌节无色素（内侧）的一面切出一个较小的窗口，但需保留髁突（condyle，即节段间的关节窝或铰链结构）的连接完整。 
	<img alt="植物种子荚结构示意图，用于植物形态学研究。" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51050/51050fig2.jpg" width="500px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 2"> 
	图2. 沿掌节虚线处切割。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51050/51050fig2highres.jpg" target="_blank">点击此处查看大图</a>。 
	<img alt="鱼类鳃部显微图像，显示寄生虫（箭头），说明水生生物的寄生感染情况。" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51050/51050fig3.jpg" width="500px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 3"> 
	图3. 暴露窗口中的神经（箭头勾勒出神经束）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51050/51050fig3highres.jpg" target="_blank">点击此处查看大图</a>。</li>
	<li>准备一个内衬Sylgard的培养皿，加入蟹生理盐水，用于固定标本。注意：物种特异性生理盐水配方见表1。</li>
	<li>使用火焰抛光的玻璃针小心探查，定位PD器官。横跨关节的弹性细丝呈银白色外观。</li>
	<li>从肌腱两侧清除遮挡PD器官视野的肌纤维。操作时务必小心，避免损伤PD器官或其神经。</li>
	<li>完成上述操作后，将标本牢固地重新固定于培养皿中，使色素面（外侧）朝上（图4）。 
	<img alt="甲壳动物肢体解剖图，突出显示肌肉与神经结构，标注指节。" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51050/51050fig4.jpg" width="500px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 4"> 
	图4. 暴露的PD器官与神经。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51050/51050fig4highres.jpg" target="_blank">点击此处查看大图</a>。</li>
	<li>尽可能向近端追踪掌节内的PD器官神经，以释放足够长的神经段（1.5 cm），便于记录。此操作最好在PD神经仍与主腿神经相连时进行。</li>
	<li>借助玻璃针将PD神经与主腿神经分离后，使用虹膜剪在近端切断PD神经。注意：解剖过程中切勿拉伸或牵拉神经。</li>
	<li>将指节（dactylopodite）移动至完全伸展和完全屈曲的位置。记录极端屈曲、伸展位置以及中间位置，供后续使用。</li>
	<li>将接地导线置于生理盐水浴内。</li>
	<li>开启电生理记录硬件/软件。注意：本实验装置此前已有描述23。</li>
	<li>调整显微镜位置，使其俯视显微镜载物台。将标本皿放置于载物台上后，需调节高亮度照明光源的位置，以获得最佳标本观察效果。</li>
	<li>调整显微操作器位置，使连接的吸电极组件能够方便地接触盐水浴和标本。吸电极的构造如在线视频所示24。</li>
	<li>为检测神经活动，将PD神经的切断端吸入吸电极内。</li>
	<li>借助玻璃探针或木棒，将指节在伸展和屈曲位置之间移动多个周期。</li>
	<li>随后观察指节固定于伸展、屈曲及中间位置时的神经活动。</li>
</ol>
2. 监测力生成的同时记录张力神经的电活动
<ol>
	<li>确定腿部的外侧和内侧。内侧质地较软，可通过用指甲轻轻捏压基节区域来感知。</li>
	<li>将柔软的角质层朝上放置于培养皿中。支配开肌的兴奋性运动神经也支配腕节中的伸肌。</li>
	<li>为了刺激开肌，需分离位于腕节区域的伸肌运动神经，并使用吸电极进行刺激。用剪刀横断基节部分，以去除腿部近端结构。</li>
	<li>在腕部内侧（内侧）去除一段表皮 图 5A).</li>
	<li>切断屈肌的腱膜，并小心移除肌肉，避免将腿部的主要神经从腿腔中拉出（图5B、C 注意弯曲肌腱分离处的箭头位置）。随后可观察到主腿部神经及通往伸肌的分支（图5D).</li>
	<li>找到从主神经束分支至伸肌的神经图5E， 在箭头处. 可将其剪至靠近肌肉处，并拉入吸电极中以进行刺激（图5F 和 G, 箭头指示该分支。</li>
	<li>分离出通向 opener 肌肉的一段神经，注意不要夹伤神经。横切 stretcher/opener 运动神经。</li>
	<li>将运动神经拉入吸电极，然后进行刺激。</li>
	<li>为了暴露开肌和张力神经，需去除闭肌及基节的腹侧区域。使用带有#11刀片的解剖刀在基节处切断闭肌。图6). 注意： 不要在近端区域进行深部切割，以免损伤开肌运动神经。 
	<img alt="Crayfish nerve dissection sequence, histological staining, and microscopy analysis for neurobiology study." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51050/51050fig5.jpg" width="500px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 5"> 
	图5. 暴露用于刺激开肌的运动神经元的解剖步骤. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51050/51050fig5highres.jpg" target="_blank">单击此处查看大图</a>. 
	<img alt="Crayfish dissection; anatomical detail; educational diagram; marine biology study." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51050/51050fig6.jpg" width="500px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 6"> 
	图6. 在基节腹侧半部切开节肢动物表皮，以暴露闭肌，便于将其移除. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51050/51050fig6highres.jpg" target="_blank">单击此处以查看大图</a>.</li>
	<li>在整个解剖过程中，用新鲜的冷生理盐水更换原有生理盐水，以保持神经元的活性。进行进一步解剖时，将培养皿置于解剖显微镜下，并使用光纤照明。</li>
	<li>使用尖头中号剪刀小心地将靠近的肌腱从其在指节上的附着处剪下。</li>
	<li>务必小心，不要触碰从主腿神经分支到开肌的神经支，这些神经支应清晰可见。</li>
	<li>去除并弃去邻近的肌肉和肌腱。</li>
	<li>用解剖针在指节上打一个小孔。此孔稍后将用于钩住张力（力）传感器上的金属针，但必须在该实验步骤的此阶段完成。</li>
	<li>在开肌远端区域找到通向开肌及其骨片的神经分支。用火焰抛光的玻璃工具小心探查该神经。</li>
	<li>观察从腱膜远端发出并延伸至运动神经束的张力神经。</li>
	<li>为检测神经活动，用蟹生理盐水填充吸电极，并将 opener 张力神经的切断端吸入电极内。确保吸电极与神经紧密贴合。</li>
	<li>检测被动张力在开肌腱膜上的神经相关性。在记录张力神经电活动的同时，快速将指节旋转至伸展关节位置即 拉伸开肌。</li>
	<li>接下来，检测刺激频率与主动收缩力发展之间的关系。</li>
	<li>将一个金属钩牢固地固定，使钩的尖端穿过可动指上的小孔。</li>
	<li>将金属钩的另一端连接至力传感器。 注意： 确保换能器处于一个 90° 每次调整角度，使针垂直于换能器，以最大程度检测产生的力。</li>
	<li>将钩子和指状突拉至大约一个位置 45° 张口器关节角度。</li>
	<li>以100 Hz刺激运动神经250毫秒，同时测量张力神经的放电频率及产生的力。</li>
	<li>将关节置于完全伸展的位置，使开肌的肌纤维处于松弛状态。</li>
	<li>以100 Hz频率刺激运动神经250毫秒，同时测量张力神经的收缩力及放电频率。</li>
	<li>弯曲/屈曲关节，使其完全屈曲（约90°）。在此位置，开肌的肌纤维被完全拉伸。由于肌肉的这种被动拉伸，换能器可能会测得一定的力。</li>
	<li>以100 Hz频率刺激运动神经250毫秒，同时测量张力神经的收缩力及放电频率。</li>
	<li>测量力之后，在各个频率下依次进行：20、40、60、80 和 100 Hz，每种关节位置持续 8–10 秒。</li>
	<li>通过快速释放张力来测量反应。调整制备装置，使力传感器上的钩子能够轻松地从指节的孔中推出。</li>
	<li>弯曲/屈曲关节，使其完全屈曲（约90°。现在以100 Hz的频率连续刺激运动神经5秒。</li>
	<li>在施加张力约一秒钟或更短时间后，当 opener 肌肉张力已建立时，将针从指节的孔中推出。</li>
	<li>在松开固定指节的销钉前后，检查张力神经记录。</li>
	<li>通过将章鱼胺、血清素和前激肽等神经活性物质加入灌流液中作用于暴露的张肌，可测定这些物质对张力神经元输出的调节作用，并重复实验。</li>
	<li>使用移液器，在样本上滴加1-2 ml。</li>
</ol>
3. 甲壳类步行足外周神经系统结构的染色
<ol>
	<li>亚甲蓝技术
	<ol>
		<li>将1份亚甲蓝氯化物储备液（0.25%）与2份蒸馏水混合稀释。</li>
		<li>将此混合物加入五份缓冲盐水中。充分冲洗目标区域。</li>
		<li>按照第1部分的方案解剖一条腿。将制备好的样本在12-13 °C.</li>
		<li>每10-15分钟使用解剖显微镜并以低强度光照检查一次制备情况，以观察染色进展。某些情况下染色在1小时内完成，而其他情况下可能需要过夜。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>4-di-2-ASP 技术
	<ol>
		<li>荧光染料可用于逆向填充PD神经元，或直接从浴液中对制备样本进行染色。但需要配备能够观察荧光染色的合适显微镜。</li>
		<li>按照第1节中的方案解剖一条腿。</li>
		<li>将制备物在 10 µM 4-Di-2-ASP 溶液的浓度，并将标本置于冰箱中孵育 15 分钟。使用足量溶液覆盖标本即可。</li>
		<li>快速拍摄标本，避免在汞灯下曝光过久。这种荧光染料褪色较快。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>氯化钴法
	<ol>
		<li>按照第1节中的方案暴露PD神经，并将其保持在冷盐水中浸泡。</li>
		<li>用凡士林制作一个凹井以容纳 CoCl2. 如果存在任何 CoCl2 如果溢出到盐水浴中，整个制备物将变成黑色，应予以丢弃。</li>
		<li>将一小块聚苯乙烯板切割成小片，制成塑料平台，并以针固定，使其不会漂走或浸入盐水浴中（图7). 
		<img alt="Precision dissection technique using fine tweezers, illustrating manual dexterity in lab setup." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51050/51050fig7.jpg" width="500px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 7"> 
		图7. 带有固定针的聚苯乙烯板，用于在培养皿中固定位置. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51050/51050fig7highres.jpg" target="_blank">单击此处查看大图</a>.</li>
		<li>将一次性注射器上安装的细皮下注射针头中的凡士林推出，然后在聚苯乙烯薄片表面制作一圈屏障（圆形效果可能较好），屏障高度约为1.5毫米，仅在中点处留一浅“V”形缺口，以便神经跨过此处。</li>
		<li>在屏障靠近“V”形处的两侧各滴一滴生理盐水。注意不要拉伸或夹压神经，小心地将神经从培养皿中提起，放入石蜡油井内的生理盐水滴中。</li>
		<li>操作需迅速，以免神经暴露部分干燥，小心挤出石蜡油覆盖暴露的神经。随后用生理盐水测试屏障，确保无泄漏。</li>
		<li>用吸水纸吸去屏障内侧的生理盐水，观察当浴液生理盐水液面升高至石蜡油壁周围时是否渗入屏障内部，以确认两侧是否相互隔离。图8). 
		<img alt="Uncut PD nerve in well; microscopy image; neuroscience study; tissue inspection setup." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51050/51050fig8.jpg" width="500px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 8"> 
		图8. 含盐水和贯穿井道的PD神经的凡士林井PD神经尚未被切断。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51050/51050fig8highres.jpg" target="_blank">单击此处以查看大图</a>.</li>
		<li>用一张纸巾吸走孔中的生理盐水，避免纸巾缠绕神经。</li>
		<li>用几滴蒸馏水形成一个新的水洼，然后切断神经末端。切割时务必小心，避免将神经拉过屏障。蒸馏水的渗透休克会使轴突膨胀呈气球状。</li>
		<li>30 秒内加入一滴少量 CoCl2 加入水中，浸泡此溶液，然后添加足量的 CoCl2 在缩短的神经段上形成液滴图9）。样品最好在冰箱中冷藏保存于 13 °C 12-24 小时 
		<img alt="Microscope image of cut PD nerve in well; nerve tissue study, biological research, cellular analysis." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51050/51050fig9.jpg" width="500px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 9"> 
		图9. 暴露于CoCl₂的切断PD神经2神经切断后在水的存在下会肿胀，这有助于并加速染料分子通过轴突进入神经元胞体。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51050/51050fig9highres.jpg" target="_blank">单击此处以查看大图</a>.</li>
		<li>去除加湿产生的水滴。用纸巾吸去氯化钴溶液，并用多次更换的生理盐水洗去残留的钴。</li>
		<li>将分离好的标本转移至含有约10 ml 蟹生理盐水的小型玻璃培养皿中。神经元进行清洗后，执行以下步骤 原位此后步骤中不得使用金属器械处理样品（应使用专用工具，且该工具不得在后续生理学实验中再次使用）。</li>
		<li>加入1-2滴硫化铵（NH₄）₂S4)2S 加入生理盐水中。盖上（NH4)2将S瓶拧紧并放回通风橱中。在解剖显微镜下观察制备过程中的反应。</li>
		<li>1-2 分钟内，含钴的神经元及其突起应开始显现，因其会染成黑色。</li>
		<li>5–10 分钟后，用新鲜生理盐水替换显影液。</li>
		<li>确保将显影液倒入水槽下水口后，用自来水冲洗几分钟，或将其收集至带盖的废液瓶中。</li>
		<li>倒出生理盐水，用波因氏固定液固定神经标本约15分钟，期间更换固定液两次。对于较大的组织（如开肌，用于染色张力感受神经元），将固定时间延长至30分钟。</li>
		<li>从70%乙醇浓度开始，按浓度递增的顺序进行脱水处理（即 70%、80%、90%、100%）。对于小块组织，每个浓度处理约10分钟即可。</li>
		<li>约在两次更换的100%乙醇中处理10–15分钟后，用100%水杨酸甲酯替换乙醇以透明组织。制备样品将永久保存于该溶液中，便于反复观察。随着时间推移，由于周围组织逐渐变得更加透明，标记细胞将愈发清晰可见。可采用增强方法以帮助防止信号随时间褪色。25.</li>
		<li>使用相同的方法用 CoCl 填充张力神经2然而，在每个乙醇脱水步骤中需多次更换乙醇溶液，并将样本在酒精中孵育约20分钟，以充分脱水并使肌肉组织充分透明。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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作者声明不存在任何竞争性经济利益。

本系列实验的目的在于：1）讲授并展示从可识别的本体感受器官和张力神经进行细胞外记录的基本原理；2）强调解剖定位在特定感觉系统生理功能研究中的重要性。该实验方法所采用的动物模型成本低廉，且在神经生理学教学实验室中相对易于实施。
弦音器官的神经元具有两种特定的功能类型：一类对运动产生反应，另一类对静态位置产生反应。对多种弦音器官进行的单细胞记录，无论检测的是哪个关节，均证实了这一情况3,5。事实上，与龙虾触角关节相关的弦音器官也表现出相同的两种感觉类型和基本解剖结构27。&#160;除了存在两种神经元类型（运动型和位置型）外，这些神经元在其各自的弹性纤维上具有相同的解剖排列方式。位于纤维近端、体积较大的细胞体通常属于对动态运动敏感的神经元；而传递静态位置信号的神经元则具有较小的细胞体，位于远端。这些细胞呈紧张性活动。掌指关节（PD关节）仅包含一个弦音器官，而在腕掌关节（CP关节）和前臂腕关节（MC关节）中则各有两个弦音器官。
为了对蓝蟹（C. sapidus）的本体感受结构进行电生理记录，解剖时需采用一种允许关节在自然位置下活动的策略。步足中张肌的张力神经是一条非常纤细的神经，由多个神经元组成。若操作不慎，在解剖过程中可能损伤该张力神经，以及支配待刺激肌肉的运动神经。为了获得最佳记录效果，需根据神经的大小定制吸吮电极。在学生实验室内，使用30–40倍放大倍数的解剖显微镜和低端显微操作器即可方便地进行记录。
未来值得探索的与混合型弦音器官相关的实验，可包括在不同物种生命周期的各个阶段，研究其在腿部再生过程中的结构与生理特征，以此作为对先前使用Cancer magister19,26所开展的初步研究的后续工作。尚待解决的问题包括：1）再生神经元的分布与组织是否依赖于动物在肢体再生时的年龄；2）再生肢体中轴突向中枢神经系统（腹神经索）的投射是否具备功能，还是需要一定时间及关节活动才能建立功能性连接；3）当肢体发生自切时，位于自切平面近端的被切断轴突会发生何种变化？28
甲壳动物会顺应环境条件及其周围温度的变化，但目前尚不清楚当神经元活动随温度变化而改变时，它们如何在神经回路内维持协调性。缓慢的温度变化可能使动物有一定时间进行适应，而快速的温度变化则可能无法实现这种适应。&#160;由于代谢和行为引起的pH值或渗透压的生理变化31，或环境影响可能对参与本体感受的神经回路造成类似的挑战。这些甲壳动物制备标本非常适合用于研究此类问题，因为其功能在单细胞水平上已有充分表征。
在本实验方案中，我们展示了张力感受神经元在监测伸肌产生的力方面的生理学重要性。通过染色技术，可将这些张力感受器定位至其在腱膜内的具体位置。这些神经元与哺乳动物类似，能够在不同强度下检测力的大小，并随着力的增加募集更多的神经元参与响应。其放电频率与运动神经元的刺激频率相关，直至感受器达到接收饱和状态。采用快速释放实验方案，在趾节关节屈曲状态下，张力活动迅速消失，但当关节完全伸展并重新建立张力后，该活动随即恢复。这是一种经典的实验方法，用于演示张力感受器所测得的力的变化。可在制备的标本上施加多种神经调质，以观察其对力的产生及神经元反应的影响。其中一个关键问题是神经反应在中枢神经系统中如何被处理和整合，并进一步影响运动神经元的活动。我们所展示的技术手段有助于深入研究张力（感觉）神经元与运动神经元环路的功能，即&#160;信号在完整腿部中从神经节传向肌肉，再由肌肉传回神经节的过程。
所展示的染色步骤对于理解支配本体感受器官的感觉神经元的生理特性至关重要。根据功能和胞体大小，这些神经元在蟹腿内不同弦音器官中的解剖排列相似。目前尚不清楚其他甲壳类物种或昆虫中是否存在类似的神经元排列。结合单细胞水平的生理记录与位置定位，可建立直接的结构-功能关系。利用氯化钴（CoCl2）染色和固定技术长期保存解剖结构，使得研究者能够重复测量并评估其结构排列。
本体感受和骨骼肌张力感知是使节肢动物在多种骨骼肌构型下能够协调行为并对外部和内部环境产生反应的两种感觉模式。龙虾腹部的肌肉感受器器官是另一个被充分记录的实验模型（参见Crawdad项目；<a href="http://www.crawdad.cornell.edu/">http://www.crawdad.cornell.edu/</a>），可用于教学，每个腹部半体节仅包含两个神经元23。&#160;能够从单个神经元到感觉神经束进行记录，可提供更详细的机制信息，有助于理解感觉接收的基本原理。这些相对简单的甲壳类动物模型可用于研究本体感受和张力监测的基本机制，并有望揭示实现本体感受与其他感觉输入中枢整合的神经回路9-12, 32, 33。

本体感觉是指对肢体位置和运动的感知，它使机体能够实现协调的运动行为。本体感受器包括感知位置（静态）和运动（运动觉）的受体。在昆虫和甲壳类动物中，弦音器官是向中枢神经系统（CNS）提供此类信息的结构1。并非所有的弦音器官都跨越关节，但由于它们附着在跨越关节的骨针（类似肌腱的结构）上，因此仍能监测关节运动，这些骨针会随着骨骼肌的收缩和关节的活动而移动。蟹的腿部有六个关节，每个关节含有一到两个弦音器官2。典型的弦音器官由60至100个或更多的感觉神经元组成，这些神经元嵌入一条弹性细丝中，能够传递关节的静态位置、运动方向和速度信息3-6。来自各关节和腿部弦音器官的输入信号在中枢神经系统中被整合处理，从而使动物实现协调的运动。
等长收缩和等张收缩期间，腿部肌肉产生的力由与肌纤维及其附着于腱膜的结构相关的张力感受器检测7-9。&#160;在接下来的甲壳动物步行腿实验方案中，我们介绍了记录本体感觉初级感觉神经元以及响应肌纤维产生之力的神经元的方法。同时介绍了一种激活腿部运动并量化力量生成的技术，以及可用于表征这些周围神经系统结构排列的解剖学技术。
以下演示的实验步骤可用于分析支配弹性索和腱膜上两类感受器的神经元，其结构与功能均与其在弦音器弹性索和腱膜上的位置相关。作为示例，我们采用基节-指节（propodite-dactylopodite，PD）弦音器，该器官跨越蟹腿最远端的节段3尽管详细的电生理学研究始于20世纪30年代并持续至今，但关于各关节本体感受器的节段性连接及其在肌肉协调控制中的作用，部分机制已逐渐明确10-16。&#160;建立本体感受器官、肌肉与神经系统之间的结构-功能关系，将有助于进一步明确这些器官的作用。例如，标记插入到骨腱中的张力感受神经元的胞体及其远端末梢，可揭示其相对于肌纤维的位置。8,17-21.
我们介绍了三种可用于甲壳类动物腿部的染色技术，适用于科研或教学实验室。亚甲蓝染色可为肌肉和神经提供良好的对比度，推荐作为学生学习解剖学的简便技术。具备荧光显微镜设备的实验室可通过将神经短暂暴露于活体染料4-di-2-ASP，实现更具选择性的神经元染色。第三种方法是CoCl2逆向填充，该方法可对神经元进行染色并固定，无需荧光成像。尽管该染色过程耗时且劳动强度较大，但对已填充的神经具有高对比度和高特异性。这些技术可联合用于比较各类弦音器官，不仅可在同一肢体或不同肢体之间进行比较，也可在不同甲壳类和昆虫物种之间进行比较20-22。用于生理记录和解剖染色的蓝蟹（C. sapidus）在美国南部和东南部沿海地区广泛可得。该物种代表了大多数蟹类中常见的弦音器和张力神经排列方式。西海岸的实验室则更倾向于使用体型更大的邓杰内斯蟹（Cancer magister）进行此类实验。

<table><tbody><tr><td>硅胶</td><td>Dow Corning</td><td>182 硅胶试剂盒</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>氯化钙&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5670</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 酸</td><td>Sigma</td><td>3375</td><td>游离酸，结晶状</td></tr><tr><td>HEPES 碱</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>D-葡萄糖</td><td>Sigma</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>硫酸镁&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;bull;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma</td><td>M2643</td><td></td></tr><tr><td>硫酸钠&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;SO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;bull;10H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma</td><td>246980</td><td></td></tr><tr><td>Bouin&amp;rsquo;s 溶液固定剂</td><td>Sigma</td><td>HT10-1-32</td><td>注意：危险品（需特殊运输费用）</td></tr><tr><td>氯化钴&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td></td><td>注意：危险品。请根据当地及联邦法规妥善处理。</td></tr><tr><td>亚甲蓝氯化物</td><td>Matheson Co., Inc</td><td>碱性蓝 9，C.I. 52015</td><td></td></tr><tr><td>4-Di-2-ASP</td><td>Molecular Probes</td><td></td><td>4-(4-二乙氨基苯乙烯基)-N-甲基吡啶碘化物</td></tr><tr><td>漂白剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>用于氯化银丝</td></tr><tr><td>氢氧化钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221465</td><td>用于调节 pH</td></tr><tr><td>盐酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1758</td><td>用于调节 pH</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>材料</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>解剖工具</td><td>World Precision Instruments</td><td>套装</td><td></td></tr><tr><td>细胞内电极探针</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>法拉第笼</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>昆虫针</td><td>Fine Science Tools, Inc</td><td>26001-60</td><td></td></tr><tr><td>解剖显微镜（100倍）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>光纤灯</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>小型可调反射镜</td><td></td><td></td><td>用于将光束导向样本</td></tr><tr><td>玻璃电极</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS7095B5X</td><td>每盒200支，吸电极</td></tr><tr><td>显微操作器</td><td>World Precision Instruments</td><td>MD4-M3-R</td><td>可固定于底座或金属杆上</td></tr><tr><td>抬高式样本台</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>银丝（10/1,000 英寸）</td><td>A-M Systems</td><td>782500</td><td></td></tr><tr><td>计算机</td><td>任意厂商</td><td></td><td></td></tr><tr><td>交流/直流差分放大器</td><td>A-M Systems</td><td>Model 3000</td><td></td></tr><tr><td>PowerLab 26T</td><td>AD Instruments</td><td>27T</td><td></td></tr><tr><td>力传感器</td><td>AD Instruments</td><td>0-50g</td><td>MLTF050/ST</td></tr><tr><td>前置放大头段</td><td>AD Instruments</td><td></td><td>随交流/直流放大器附带</td></tr><tr><td>LabChart7</td><td>AD Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>电极导线</td><td>任意厂商</td><td></td><td></td></tr><tr><td>玻璃工具</td><td>自制</td><td></td><td>用于操作神经</td></tr><tr><td>电缆和连接器</td><td>任意厂商</td><td></td><td></td></tr><tr><td>带橡胶球的移液管</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-7</td><td>每盒500支</td></tr><tr><td>烧杯</td><td>任意厂商</td><td></td><td></td></tr><tr><td>石蜡或油泥</td><td>任意厂商或本地商店</td><td></td><td></td></tr><tr><td>刺激器</td><td>Grass Instruments</td><td>SD9 或 S88</td><td></td></tr><tr><td>吸电极用塑料尖端</td><td>本地五金店（Watt&amp;rsquo;s 品牌）</td><td>&amp;frac14; 英寸外径 × 0.170 英寸内径</td><td>切成小段，在火焰上拉细，并修剪尖端至合适尺寸</td></tr></tbody></table>

蟹类肢体中的本体感受器与张力感受器：学生实验课程

Proprioception and Tension Receptors in Crab Limbs: Student Laboratory Exercises

这些实验步骤的主要目的是为了教学和科研，演示如何记录负责本体感觉的活体初级感觉神经元的活动，这些神经元可感知关节位置与运动以及肌肉张力。通过基础的神经生理学仪器记录甲壳动物本体感受器和张力感受器的电活动，同时使用换能器测量刺激运动神经所引发的力。此外，我们还演示了如何对神经元进行染色，以快速评估其解剖结构或进行永久固定。染色结果揭示的解剖学结构代表了大多数甲壳动物中弦音器官的典型特征。通过比较张力神经反应与本体感觉反应，可有效作为教学工具，帮助确定这些感觉神经元的功能定义以及解剖结构与功能之间的关联。本文介绍了三种染色技术，供研究人员和教师根据各自实验室条件选择最合适的方法。

当通过完全伸展关节来拉伸PD器官时，PD神经在运动过程中表现出强烈的放电活动，如图10中第一秒所示。当关节保持在伸展位置静止时，仍存在部分放电活动，这些活动来源于对静态位置敏感的神经元（图10所示记录的后半部分）。位移过程中会诱发神经反应，而放电主要发生在弦音器纤维被拉伸期间（图11）。
通过排序尖峰的相对幅度，可进一步分析这些尖峰。该方法可用于展示在不同位置或运动类型中被募集的多种感觉神经元群体。5典型的振幅范围为0.25–1.5 mV，但这些数值取决于电阻（即 吸吮电极密封的紧密性。不同大小范围的尖峰频率也可用图形表示以进行分析。
通过将不同刺激频率下开肌产生的力对应的电压-时间轨迹相互叠加，可以进行比较（图13A和B）。该方法也可用于在每一给定刺激频率下，针对每个关节位置进行分析。随后可将张力神经的活动与在每个刺激频率及每个关节位置下产生的相对力大小进行关联分析。与PD神经类似，在开肌收缩时可观察到多种幅度的动作电位（图13C）。
通过亚甲蓝染色可清晰观察到步行足中神经元的解剖结构（图14）。注意靠近腱膜的弹性弦音器及其附近的张力感受神经元。该图中还可观察到多个不同直径且具有特定位置的神经元胞体。图15展示了张力神经和伸肌运动神经的完整走行路径。利用4-Di-2-ASP（图16）和CoCl2（图17）逆行填充技术，可更清晰地显示PD神经中的单个神经元。在高倍镜下，可观察到感觉末梢位于支持性的栓状体内部（图16B）21,22,26。
<img alt="静态平衡图，电压随时间变化，测量运动状态与静止状态，0.5 mV 在 0.5 秒处。" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51050/51050fig10.jpg" width="500px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 10"> 
图 10. 移动并在 0° 位置保持。动态神经元在关节运动期间放电稳定，而当关节保持张开状态时，静态敏感神经元产生动作电位。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51050/51050fig10highres.jpg" target="_blank">点击此处查看高清图像</a>。
<img alt="离子通道信号轨迹，电压钳制法，图表显示开启和关闭相，0.6mV 0.5秒。" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51050/51050fig11.jpg" width="500px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 11"> 
图11. 从完全屈曲到伸展（90-0°）位置的快速开启和关闭。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51050/51050fig11highres.jpg" target="_blank">点击此处查看大图</a>。
<img alt="肌电图（EMG）显示肌肉活动：运动与静止状态对比；标尺为 0.5 mV，0.5 秒。" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51050/51050fig12.jpg" width="500px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 12"> 
图 12. 从 PD 神经记录到的细胞外尖峰信号。关节先完全伸展，然后迅速移动至半屈曲位置并保持静止。注意运动期间的神经活动增强，而在静止时活动减弱。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51050/51050fig12highres.jpg" target="_blank">点击此处查看高分辨率图像</a>。
<img alt="电生理实验示意图；频率响应、刺激伪迹及神经峰电位分析。" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51050/51050fig13.jpg" width="500px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图13"> 
图13. 关节完全屈曲状态下，不同刺激频率产生的相对作用力。（A）显示了每种刺激频率下力传感器记录的电压-时间轨迹。（B）将A图中的轨迹以不同颜色叠加，便于比较。（C）当运动神经以80 Hz频率刺激时，从张力神经记录到的电活动电压-时间轨迹。注意刺激伪迹呈现出的规律性模式，并与神经活动进行对比。同时注意神经反应具有不同的振幅。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51050/51050fig13highres.jpg" target="_blank">点击此处查看高清大图</a>。
<img alt="显微镜下显示张力神经元和腱膜的弹性纤维示意图" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51050/51050fig14.jpg" width="500px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图14"> 
图14. 步行足制备样品的亚甲蓝染色图。图中显示了单个神经元胞体，其感觉末梢伸入弹性纤维内。靠近腱膜处可见一条张力神经元。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51050/51050fig14highres.jpg" target="_blank">点击此处查看高清大图</a>。
<img alt="组织学组织切片、神经通路示意图、神经识别、神经结构定位。" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51050/51050fig15.jpg" width="500px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图15"> 
图15. 从远端发出的张力神经（红色箭头）与运动神经（绿色箭头）汇合。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51050/51050fig15highres.jpg" target="_blank">点击此处查看大图</a>。
<img alt="荧光显微镜图像、组织结构可视化、生物学分析。" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51050/51050fig16.jpg" width="500px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图16"> 
图16. (A) 使用4-Di-2-ASP对Cancer magister的PD神经进行逆向填充。(B) 感觉末梢的高倍放大图像。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51050/51050fig16highres.jpg" target="_blank">点击此处查看高分辨率图像</a>。
<img alt="细胞运动示意图；显微镜下的弹性纤维分析；强调位置与运动。" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51050/51050fig17.jpg" width="500px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图17"> 
图17. 经 CoCl2 充填并处理的神经元（A）。所示染色标本的描记轮廓（B）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51050/51050fig17highres.jpg" target="_blank">点击此处查看高清图像</a>。
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="392">
	<colgroup>
		<col>
		<col>
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">生理盐水</td>
			<td style="width:157px;">g/L</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:235px;">NaCl</td>
			<td style="width:157px;">27.29</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:235px;">KCl</td>
			<td style="width:157px;">0.81</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:235px;">MgSO4•7H2O</td>
			<td style="width:157px;">4.81</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:235px;">CaCl2•2H2O</td>
			<td style="width:157px;">1.85</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:235px;">Na2SO4•10H2O</td>
			<td style="width:157px;">0.97</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:235px;">Dextrose (D-Glucose)</td>
			<td style="width:157px;">1.982</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:235px;">HEPES acid</td>
			<td style="width:157px;">0.476</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:235px;">HEPES salt</td>
			<td style="width:157px;">2.08</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:235px;">用 NaOH 或 HCl 调节至 pH 8.1</td>
			<td style="width:157px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1. 蟹生理盐水配方。

通过生理学和解剖学技术，研究甲壳动物步行足中关节本体感受器和肌肉张力感受器的功能与结构。

这些实验步骤的主要目的是为了教学和科研，演示如何记录活体初级感觉神经元的活动……

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科研

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Neuroscience

神经科学

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