Name: 长鼻扩展响应协议为侦查行为可塑性的昆虫:应用基础，生物医学和农业研究 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 31 s
Description: 学习长鼻扩展响应（PER）条件反射方案，用于研究蜜蜂（Apis mellifera）的学习行为与神经可塑性。该方法通过气味与蔗糖奖励配对，量化蜜蜂对食物刺激的反射性反应，为神经科学、行为生物学及环境压力研究提供可靠工具。

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本研究获得了美国国立卫生研究院（NIH）国家研究中心（NCRR）（项目编号 R01 RR014166，负责人 BHS）、NIH 国家耳聋及其他沟通障碍研究所（NIDCD）（项目编号 R01 DC011422，BHS 为共同项目负责人）、美国农业部（项目负责人 J Trumble，BH Smith 为共同项目负责人）以及亚利桑那州立大学的资助。用于培训学生的工作坊（图4中的数据）经费由智利科学基金会提供。

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</ol>

作者声明无利益冲突。

本方案介绍了两种利用PER程序进行条件化处理的可靠方法。这些方法是已成功应用的多种方法中的两种27,21。我们在所有使用PER的实验研究中均采用方法2，因其具有持续的可靠性，即使在不同实验操作者之间也表现稳定。
这一基本实验流程已被应用于多种不同的蜜蜂研究，包括使用不同的条件刺激和不同的行为反射。该方法还被用于探究学习差异的遗传基础28,29、大脑中嗅觉感知与记忆的生理相关性13,14,30，以及行为的调节机制和分子遗传基础15,16,31。由于人们对蜜蜂嗅觉学习的生态学意义已有深入认识——这一研究始于卡尔·冯·弗里希（Karl von Frisch）一百多年前的开创性工作31——因此，通过伸吻反射（PER）获得的研究结果可直接关联到蜂群的生存需求。最近，该方法还被应用于农业研究，以考察农药和环境毒素对蜜蜂行为的亚致死效应17。
该基本实验方法具有很强的适用性，也可用于研究其他物种中的相关问题。已有研究利用两种蛾类——烟草天蛾（Manduca sexta）和棉铃虫（Spodoptera littoralis）——通过伸吻反射（PER）实验探究气味识别的神经基础以及各自嗅觉学习的能力32,33。果蝇的伸吻反射实验则揭示了化学感受和学习过程中涉及的分子信号级联反应的诸多机制34。此外，伸吻反射技术最近还被用于研究重要疾病传播媒介——锥蝽（Rhodnius prolixus）——的 Habituation（习惯化）现象35。
通常情况下，该实验方法对操作步骤的改变具有较强的耐受性；采用不同的方法很可能仍能产生相同的处理组间相对差异。尽管操作流程相对简单，但在某些情况下仍可能出现一些问题，导致蜜蜂无法学会气味-蔗糖的关联。以下内容涉及对本实验方案可能进行的调整，以及在PER条件化训练过程中可能遇到的一些常见问题。
条件化方案中试验次数与类型的考虑
任何学习方案都需要在习得阶段使蜜蜂经历一定数量的训练试验。该数量主要取决于任务的难度。蜜蜂在单次试验后即可学会简单任务，但至少需要三次试验才能诱导形成长期记忆。正如预期，蜜蜂需要显著更多的试验次数才能充分掌握困难任务。通常情况下，存在一个最大试验次数上限，超过该上限后蜜蜂的表现将不再显著提升。该上限取决于具体任务、气味类型与浓度，以及蔗糖浓度。
当使用多种不同气味的试验时，应以伪随机序列呈现不同类型的试验，以防止蜜蜂记忆简单的气味呈现顺序，而非学习不同气味之间的差异36。在这些伪随机序列中，每种气味类型的试验次数必须相等。此外，对于所有气味而言，某一气味类型试验之前和之后出现相同气味或其他任一气味的概率必须相等。对于两种气味——A 和 B——可使用以下序列：ABBABAAB。在八次试验中，每种气味各呈现四次。通过连接相同的序列，以达到每种气味所需试验次数。
无论实验设计如何，都有一些参数必须保持恒定，以优化学习效果。条件刺激（CS）与非条件刺激（US）之间的重叠对于有效的条件反射至关重要。图1、表1所示的试验间间隔需要保持恒定并进行优化，因为不规则或过短或过长的试验间间隔会显著影响条件反射方案的有效性1。
行为测试实验的重要性与设计考量
在实验的“获得阶段”记录的反应（此时条件刺激 CS 与非条件刺激 US 同时呈现）可能具有参考价值。但需注意，不同试验类型中的气味呈现条件可能存在差异。在强化试验中，伴随蔗糖奖励的气味会与视觉刺激（递送蔗糖液滴装置的运动）同时出现，这可能影响蜜蜂的反应；此外，蜜蜂仅有三秒钟时间作出反应（四秒的气味刺激减去与蔗糖呈现重叠的一秒；图1）。如果实验涉及蜜蜂学习区分两种气味（例如，一种强化、一种未强化），那么在交替试验中呈现的未强化气味不伴随奖励相关的视觉刺激，且蜜蜂有完整的四秒钟时间作出反应。因此，在获得阶段，对这两种气味的反应并不完全可比。无论采用何种条件化方案，均不应仅依赖获得曲线1来判断学习效果。为了更准确地评估蜜蜂的学习情况，应引入一系列未强化的测试试验，在这些试验中两种气味均不伴随奖励，从而确保所有刺激的测试条件完全一致。
根据实验的具体目的，测试可以包括对条件化气味的单次测试试验，或对条件化气味的一系列试验，或条件化气味与一种新气味的组合试验。对条件化气味进行单次测试试验，可简单地检测蜜蜂是否记得该条件化气味。然而，第一次测试试验的反应可能既反映了蜜蜂的动机水平，也反映了它们对条件化气味的回忆。一系列测试试验，无论是对条件化气味的一系列消退试验，还是对条件化气味与一种或多种新气味的单次测试系列，也可用于评估记忆。一系列消退试验可用于评估蜜蜂对该条件化关联的记忆强度：回忆越强，消退条件化反应所需的试验次数就越多。对条件化气味与新气味进行一系列单次测试，还可评估蜜蜂对条件化气味记忆的特异性。
同时对对照组和处理组在相同的时间点进行条件化处理和测试也至关重要。将条件化后不久测试的蜜蜂与长时间饲养后测试的蜜蜂进行比较是存在问题的，因为蜜蜂在饱食过程中会接触到蔗糖非条件刺激（US），从而产生干扰。例如，长时间间隔后表现下降可能归因于记忆衰退，也可能归因于因非强化性接触US所引起的动机状态改变和/或学习效应，这会使结果变得不明确。因此，处理组的表现应始终以在同一时间点进行条件化和测试的对照组为参照进行判断。
气味浓度与完整性
气味（条件刺激，CS）的浓度和完整性可能受到多种因素的影响而受损。气味传递中最常见的问题是因过度使用导致气味 cartridges 耗尽（图2）。为避免这一问题，建议每使用10至12次（即每进行2或3轮实验，每组5只蜜蜂）后更换cartridges。在测试试验中必须使用全新的cartridges，因为已使用过的cartridges可能消耗程度不同，从而导致提供的气味刺激不均等。另一个常见问题是气味cartridges被污染，这通常是由于在未彻底清洁的情况下将同一cartridge用于多种不同气味所致。被污染或不洁净的气流可能无意中引入额外的嗅觉刺激（使用活性炭过滤器可防止背景污染）。当将PER条件反射训练与对气味的生理反应测量相结合时，这一问题尤为突出。若气味cartridges存在泄漏，蜜蜂会在实验开始前就暴露于气味中，从而降低气味刺激的显著性。此外，气味输送系统的供气装置若安装不严密，可能导致阀门打开时气味输送量极少甚至完全无法输送，从而人为地削弱蜜蜂对目标气味的反应。
蔗糖溶液与非条件刺激（奖励）
作为非条件刺激（US）所使用的蔗糖溶液的用量、浓度和完整性对实验的成功至关重要。条件化效果取决于用作非条件刺激的蔗糖水溶液的用量和浓度37。方法2中使用的显微注射器可精确控制非条件刺激的递送（精确至0.2 μl），我们建议在所述的两种方法中均使用此类注射器。牙签法（方法1）适用于无法使用昂贵注射器的情况，例如在对大量学生进行培训、野外工作或预算有限的情况下。只要保持准确的时间控制，并定期更换牙签以避免蔗糖积累（以及递送浓度的变化），方法1的严谨实施也是可行的。然而，使用牙签更难以精确控制和估算所递送非条件刺激的量和强度，而这一点在条件化研究中非常重要1。为提供足够奖励以维持蜜蜂学习条件关联的动机，所需蔗糖浓度可能取决于任务难度、蜜蜂的内部状态或一年中的时间。任务越困难，蜜蜂成功学习所需蔗糖溶液的浓度就越高。即使在5 °C条件下，蔗糖溶液中也可能滋生霉菌，这会破坏溶液的完整性，影响蜜蜂在实验期间的健康及其对奖励的感知。最好每隔几天更换一次溶液。
条件刺激与非条件刺激呈现的精确性、时机及一致性
正确实施PER实验程序（或任何条件反射程序）最关键的环节在于条件刺激（CS）和非条件刺激（US）呈现的精确性、时机控制和一致性（图1）。初次进行该实验的研究人员常常在一种或两种刺激的呈现上不够精确。若刺激间间隔（ISI）设置不当，导致CS与US未能有效重叠，则会导致条件反射效果不佳。程序逻辑控制器（PLC）会自动向实验人员发出声音信号，提示其在气味刺激开始后3秒给予蔗糖溶液。研究人员应在信号发出后，迅速将蔗糖/水液滴递送至蜜蜂附近。这些操作有助于确保ISI的一致性。在训练区域旁放置秒表，可方便地确定每次试验的时间点，并监控蜜蜂在刺激呈现前后停留在实验区域的时间。这样可使刺激间间隔（ITI）保持相对一致，并使整个实验过程以可控的节奏进行。ITI过短（例如少于1分钟）或过长均可能导致条件反射效果下降1。
季节性、环境和情境因素对蜜蜂表现的影响
蜜蜂的学习表现可能在训练前后受到周围环境的显著影响。季节变化带来的温度波动和食物可获得性变化，常常会改变蜜蜂的学习动机。当花朵盛开时，蜜蜂在实验室内学习条件反射关联的动机就会降低38。当蜂群受到极端温度、食物短缺或疾病相关压力等应激因素影响时，其学习表现也会明显下降。在飞行室内饲养的蜜蜂可能在初期表现出良好的学习能力，但随着时间推移，疾病和衰老带来的应激同样会逐渐削弱其学习表现。训练过程中的环境背景也可能降低蜜蜂的表现。任何额外的气味、移动或其他刺激都可能使蜜蜂分心，偏离实验刺激。为避免这一问题，应保持相对一致且简化的视觉环境。
基因型和经验影响 PER 表现
由于任务分工、基因型或其他环境因素，蜜蜂工蜂在任何条件反射实验中的表现可能存在显著差异20。因此，为了减少个体间的变异，尽可能标准化实验中所用动物的类型非常重要。在由一只自然交配的蜂王所领导的蜂群中，即蜂王与多只雄蜂交配，工蜂的父系基因型会有所不同。遗传背景可能导致感官反应性39和学习能力29的显著差异。使用仅由单只雄蜂精子人工授精的蜂王所领导的蜂群，可降低这种个体间的变异28。
上述方案包括一种从蜂巢入口收集蜜蜂工蜂的方法。然而，这些蜜蜂在年龄或行为任务方面存在差异。它们可能是年轻的（缺乏经验的）或年长的（经验较丰富的）采集蜂，也可能是进行首次定向飞行的年轻蜜蜂，或者是守卫蜂。为减少变异性，可在蜜蜂羽化为成虫时（以控制年龄）和/或开始采集活动时（以控制经验），使用快干搪瓷漆或标记标签对蜜蜂进行标记。数天后，收集已标记的蜜蜂用于训练。从事哺育行为的工蜂可从蜂巢框中采集。当工蜂将头部伸入蜂巢幼虫室以喂养和照料其中的幼虫时，即可准确识别其为哺育蜂。
使用处女蜂王或雄蜂进行PER条件化训练
除了工蜂之外，处女蜂王和雄蜂也可通过 PER 实验程序进行训练，用于培育在学习能力上存在差异的蜜蜂遗传品系的研究28。处女蜂王应在羽化后尽快采集，并直接放入固定装置中，无需麻醉。从蜂群内的育雏巢脾上采集的年轻未成熟雄蜂通常缺乏学习动机。雄蜂在开始交配飞行后，能够 readily完成 PER 任务的学习28。应在它们完成交配飞行返回时进行采集，并在用于培育蜂王的蜂群中，将其置于小型笼内过夜饲养。切勿在训练前一日尝试将雄蜂固定于装置中；它们在固定装置中过夜存活率较低。在开始训练前约两小时，可从笼中取出雄蜂，直接放入固定装置中，无需麻醉。
结论
这种PER实验方法可作为设计PER实验的起点。大多数PER实验方案都需要对该流程进行某些修改，以实现特定的实验目标，并适应多个处理组的设置。该方法易于实施，但正确操作需要注重细节并加以练习。一旦掌握，该方法便可成为多种基础研究和应用研究项目中针对不同昆虫物种的一项有力研究工具。

许多昆虫会学习与生态相关的刺激，并由此改变对这些刺激的行为反应，以适应环境中新的预测性关系。多种不同的机制可能构成这种行为可塑性的基础。例如，非联合型，联合型/巴甫洛夫式，操作式/工具式1）。这些可塑性类型在刺激或行为与重要事件（如食物、配偶或危险的出现）的关联方式上有所不同。理解这些可塑性形式对于基础研究至关重要，有助于揭示神经系统如何发生改变以编码新的记忆2。了解作为重要疾病传播媒介的昆虫的适应性行为也具有重要意义（例如，采采蝇和蚊子）以及在农业上具有重要意义的昆虫，包括在作物生产中起作用的（如蜜蜂）或作为害虫的昆虫。
研究任何动物的行为可塑性都需要在实验中对多个变量进行一定程度的控制，而这种控制在野外条件下是无法实现的1。这就需要建立一种可靠的条件化实验方案，该方案可在更受控的环境中实施，同时仍与自然条件下的行为相关。蜜蜂（Apis mellifera）是建立用于分析行为可塑性的受控实验方法的理想模型3,4。蜜蜂的吻部伸展反应（Proboscis Extension Response, PER）是一种自然的行为反射，当蜜蜂的触角受到糖溶液刺激时，会本能地伸出其吻部。在正常的觅食行为中，当蜜蜂在花朵中发现花蜜时就会发生PER。幸运的是，蜜蜂在实验室环境中也容易表现出这一简单且易于量化的反应。这使得研究人员能够在受控条件下，研究影响这一生态相关行为的内在机制5。此外，PER还可结合条件化训练方案，用于在不同处理条件下探究刺激感知以及学习与记忆过程，从而揭示行为可塑性背后的神经与行为机制6。
自从Kuwabara的早期研究以来7，PER（伸吻反应）条件化已被广泛用于揭示蜜蜂行为可塑性背后的非关联性、关联性和操作性机制8。这些机制与自由飞行蜜蜂研究中揭示的机制相同9。与自由飞行蜜蜂的研究不同，PER条件化实验可与脑部的电生理记录10,11或活细胞荧光成像技术12-14相结合。此外，PER实验方案还允许通过药理学或分子遗传学手段对神经通路进行实验性操控，以检验特定神经网络组分（如神经调质）功能的假设15,16。PER实验方案还为评估环境因素以及毒素对蜜蜂健康和觅食效率的亚致死效应提供了重要途径17。
本实验流程并列介绍了两种气味递送方法。方法1是一种气味与非条件刺激（蔗糖）递送方式，可提供一种成本低廉且技术简单的气味与蔗糖奖励呈现手段。该方法适用于基础训练，以及无法实现自动化操作的情况，是将该技术引入课堂或教学实验室的优良方式。在涉及更复杂任务以及需联合进行气味感知、学习或记忆相关生理学评估的实验中，准确且精确地调控刺激的起始时间、持续时间及递送时序至关重要。为实现最可靠的刺激递送，应采用自动化气味递送手段以及精确的奖励递送方法。方法2采用自动化气味递送和更精确的蔗糖递送方式，技术上更为复杂，初始设置所需资源也多于方法1，但能显著提高训练过程中刺激时序与剂量的一致性，应尽可能优先使用。

<table><tbody><tr><td>蔗糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9378-1KG</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;气味化合物（例如）&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;1-己醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>471402-100ML</td><td>更多示例</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;2-辛酮</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W280208-800G-K</td><td>气味剂，参见任意</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;庚醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>51778-5ML</td><td>关于嗅觉的论文</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;香叶醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>163333-25G</td><td>处理自</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;壬醛</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>131210-100ML</td><td>Smith 实验室</td></tr><tr><td>己烷</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>296090-1L</td><td></td></tr><tr><td>重矿物油</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>330760-1L</td><td>确保它&amp;rsquo;无气味。</td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>459836-1L</td><td></td></tr><tr><td>闪烁瓶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z190535-1PAK</td><td>使用小型钻头在小瓶盖上钻一个小孔。</td></tr><tr><td>蜜蜂固定装置</td><td></td><td></td><td>定制自直径为0.9 cm的塑料饮料吸管或硬质塑料/金属管。</td></tr><tr><td>胶带</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z188956-1PAK</td><td></td></tr><tr><td>洗瓶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z560847-3EA</td><td>对于70%乙醇。</td></tr><tr><td>干燥管</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;仅适用于方法1&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>20 ml 一次性塑料注射器</td><td>Cole-Parmer</td><td>WU-07945-18</td><td></td></tr><tr><td>15 mm 滤纸圆片</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z274844-1PAK</td><td></td></tr><tr><td>图钉</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>牙签</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;仅适用于方法2&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Gilmont 微量注射器，0.2 ml</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-07840-00</td><td></td></tr><tr><td>Gilmont 微量注射器针头</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-07841-00</td><td></td></tr><tr><td>26 G 3/8&amp;rdquo; Leur hub 皮下注射针头</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-826-10</td><td></td></tr><tr><td>1 cc 结核菌素注射器（塑料/玻璃）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z181641-1EA 或 Z192090-200EA</td><td>玻璃结核菌素注射器可选用，但塑料注射器价格低廉得多，且在有限次数的使用中性能良好。</td></tr><tr><td>小型橡胶/硅胶限位器</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-95702-02</td><td>由外径为4.8 mm的硅胶管或1 cc注射器活塞的橡胶头制成。</td></tr><tr><td colspan="4">[页眉]</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7793-1EA</td><td></td></tr><tr><td>75 x 100 mm 滤纸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z695106-500EA</td><td></td></tr><tr><td>Direct Logic 05 可编程逻辑控制器</td><td><a href="http://www.koyoele.co.jp/english/product/plc/index.html" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Koyo Electronics Industries Co, Ltd</a></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 mm，4 mm， &amp;amp; 内径为6 mm的PVC或硅胶管</td><td>Cole-Parmer</td><td>各种</td><td>Cole-Parmer 提供多种适用的管路选择。</td></tr><tr><td>聚丙烯连接器 &amp;amp; leur接头</td><td>Cole-Parmer</td><td>各种</td><td>Cole-Parmer 提供多种管径的接头和管件供选择。</td></tr><tr><td>65 mm 相关流量计</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-03216-08</td><td>带玻璃浮子的铝制转子流量计；用于液体和气体，带阀门。</td></tr><tr><td colspan="4">或</td></tr><tr><td>Tetra Whisper 300 (Tetratek DW96-2) 水族箱气泵</td><td><a href="http://www.aquacave.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Aquacave</a></td><td>AE-TETRA-300</td><td></td></tr><tr><td>LIF 系列电磁阀，适用于内径 0.042 英寸的管路，配置 "E"</td><td><a href="http://www.theleeco.com/LEEWEB2.NSF" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> The Lee Company</a></td><td>LFAA1200118H</td><td>氯丁橡胶，430不锈钢，302不锈钢，280毫瓦</td></tr><tr><td>PCB电路板 12V直流 70分贝压电蜂鸣器</td><td><a href="http://www.radioshack.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> RadioShack</a></td><td>273-074</td><td></td></tr></tbody></table>

一种用于研究昆虫行为可塑性的喙伸展反应实验方案：在基础、生物医学及农业研究中的应用

A Proboscis Extension Response Protocol for Investigating Behavioral Plasticity in Insects: Application to Basic, Biomedical, and Agricultural Research

昆虫通过将刺激与生存相关的重要事件进行关联的经验，来调整其对刺激的反应。例如食物、配偶、威胁）。昆虫通过多种行为机制学习显著的关联，并将其与这些事件联系起来。了解这种行为可塑性，对于旨在协助农业有益昆虫的项目至关重要。这种理解也可用于寻找解决由作为疾病传播媒介和害虫的昆虫所引发的生物医学和农业问题的方案。Proboscis Extension Response（PER）条件化训练方案最初是为蜜蜂（Apis mellifera）开发的Apis mellifera50 多年前，该方法被用于研究蜜蜂如何感知和学习花香气味，这些气味向蜂群传递了其生存所需的花蜜和花粉资源信息。PER 实验程序为研究多种生态学上重要的行为可塑性机制提供了一个稳健且易于实施的框架。该方法可轻松改造，适用于多种其他昆虫物种及其他行为反射。这些实验方案可与多种监测中枢神经系统（CNS）神经活动的技术（如电生理学或生物成像）结合使用，也可用于操控特定的神经调节通路。该方法是一种灵敏的检测手段，可快速识别环境胁迫因子、毒素或杀虫剂对行为造成的亚致死效应。
我们展示了如何通过两种方法简便地实施PER（Proboscis Extension Response，喙伸展反应）实验方案。其中一种方法适用于学生实验课或快速检测实验处理的效果；另一种方法则能更严格地控制变量，这对于行为条件化研究尤为重要。我们说明了如何使用多种行为反应指标——从二元的是/否判断，到喙伸展的潜伏期和持续时间等连续变量——来检验科学假设。此外，我们还讨论了研究人员在初次使用该实验流程时常见的若干误区。

我们展示了上述PER方案应用的两个实例。第一个实例采用方法2，研究了蜜蜂如何根据气味与条件刺激（CS）在分子结构上的相似性来感知不同气味5,24,25。第二个实例则展示了方法1的应用，以及在科研实验室中初次开展PER条件化实验时必须注意的一些事项。
此类研究已用于结合生物成像13或电生理分析26来描述蜜蜂和蛾类的嗅觉“感知空间”。蜜蜂（n = 20）经过12次前向配对训练试验，被训练将癸醛气味与蔗糖强化建立关联（图3A）。约有10%的蜜蜂在第一次试验中出现“自发性”反应，这是正常现象。此后，随着后续几次试验的进行，产生反应的蜜蜂比例逐渐上升，至第五次试验时达到100%，并在之后所有试验中保持该水平。多项研究表明，这种反应比例的上升特异性地出现在前向配对条件下（图1），相较于若干重要的对照程序具有显著差异3。在习得阶段结束后，每只蜜蜂均接受一系列无强化的测试试验（图3B），其中包括暴露于条件刺激（CS）气味以及其他在分子结构上与CS系统性差异的多种气味物质。蜜蜂对CS气味的反应最强，对其他气味物质的反应则随着结构差异的增大而逐渐减弱，对与CS最不相似的气味物质反应最低。
在图4中，展示了一个近期工作坊的结果，学生在该工作坊中首次学习使用方法1对蜜蜂进行条件化训练。学生首先通过将甲基环己酮（MCH）或辛醇（OCT）与蔗糖强化进行前向配对，来对蜜蜂进行条件化训练（图4A）。在第一次试验中，蜜蜂的反应百分比较低，随后各次试验中的反应比例逐渐上升，表明蜜蜂学会了气味与蔗糖之间的关联。不同学生组之间，蜜蜂学习条件化关联的程度存在差异。根据我们的经验，这类差异可能源于作为条件刺激（CS）所使用的气味、方法本身（方法1）中存在的不精确因素，或实验操作者训练水平的不同。在第三种情况下，随着实验者经验的增加，实验结果会迅速变得更加一致。条件化训练完成后，每只蜜蜂均用每种气味测试两次。在经过OCT或MCH前向配对条件化训练的蜜蜂组中，蜜蜂对条件化气味的反应最强，这与预期一致（图4B）。
另一组蜜蜂对气味OCT进行顺向配对训练，同时平行地与另一组进行反向配对训练，即在反向配对组中，气味OCT与蔗糖呈反向顺序配对。反向配对是多种对照程序之一，用于证明反应增强特异性地源于顺向配对，而非其他过程（例如由敏感化引起的非特异性兴奋）。在反向配对中，蔗糖非条件刺激（US）和气味条件刺激（CS）的呈现顺序与图1所示相反。由于在反向配对中，气味CS是在蔗糖呈现之后才出现，因此无法对条件反应（CR）进行评分，故未展示其习得数据。正如对联想式条件反射所预期的那样，顺向配对组对OCT的反应水平高于反向配对组（图4C）。
<img alt="经典条件反射实验示意图，试验时间线，条件刺激/非条件刺激间隔，行为反应过程。" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51057/51057fig1highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 1"> 
图 1. 采用前向配对方式进行条件反射的实验设计示意图。 本图中所用术语的定义见 表 1。(A) 条件刺激（气味）先于非条件刺激（蔗糖/水溶液）出现，并与之部分重叠。该条件刺激与非条件刺激之间的关系对蜜蜂和蛾类的条件反射训练最为有效。但最适刺激间期（ISI）可能因训练方案和动物物种而异1。(B) 条件刺激（CS）、条件反应（CR）、非条件刺激（US）和非条件反应（UR）的时间分解及其相对时序。在非条件刺激呈现之前出现，或在无强化的“测试”试验中出现的条件反应（CR），是实验方案中的因变量测量指标。
<img alt="比较不同条件下矿物油与己烷在多次使用后试次结果的图表，含显著性标记。" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51057/51057fig2highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. 使用后气味耗竭情况。 本实验中，气味滤芯按文中所述以己醇作为条件刺激（CS）。己醇在PER研究中常被用作条件刺激，但实际耗竭速率将取决于所用气味物质及溶剂。滤芯在8次试次中每分钟使用一次，每次4秒（假设标准实验中每次试次使用5只蜜蜂，则相当于总共使用40次）。所用溶剂中的稀释浓度（对PER实验而言相对标准）分别为2.0 M（A）和0.2 M（B）。（A, B） 在第一次和第八次试次后，通过固相微萃取（SPME）纤维吸附气味成分，随后将吸附物脱附至气相色谱仪进行分析。两种溶剂和两种浓度条件下，第一次试次后峰面积均显著高于第八次试次（Wilcoxon配对符号秩检验，p &lt; 0.05 [*] 或更高），表明滤芯经多次使用后释放的气味量减少。（C, D） 相同数据仅显示第八次试次结果，y轴范围扩大。结果显示，在较低浓度下，己烷的耗竭程度略高于矿物油，但在高浓度下差异不明显。
<img alt="图A：反应百分比的学习获得曲线。图B：测试气味反应比较。" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51057/51057fig3highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 3"> 
图3. 使用癸醛作为条件刺激（CS）及方法2进行条件化训练的获得与测试。（A） 在12次正向配对试验中逐次试验的条件反应（CR）（图1）。数据来自20只蜜蜂，分为4组，每组5只。刺激间间隔（ISI）为3秒，试验间间隔（ITI）为6分钟。（B） 使用与癸醛在碳链长度和/或羰基碳位置上不同的气味进行的无强化测试。这些气味在四组之间以随机顺序呈现，并与对癸醛的强化试验（每两到三次测试插入一次）交替进行，以避免条件反应（CR）消退。
<img alt="显示MCH、OCT Gp1和Gp2在各次试验中反应百分比的学习曲线图。" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51057/51057fig4highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 4"> 
图4. 研究生在工作坊中接受使用PER方法1训练蜜蜂的实验数据。(A) 三组蜜蜂对辛醇（Gp1和Gp2的n分别为23和15）和甲基环己酮（n = 10）进行条件化训练的习得数据。(B) 两种气味在无强化测试中的条件反应（CRs）；每组随机呈现四次试验。(C) 两组蜜蜂在无强化测试中对两种气味的反应，其中一组为前向配对（Gp 1，n = 23），另一组为后向配对（n = 25）。
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>术语（缩写）</td>
			<td>定义</td>
			<td>相关示例</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>条件刺激（CS）</td>
			<td>最初几乎不引起或完全不引起反应的刺激，用于提示非条件刺激（US）的出现</td>
			<td>ODOR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>条件反应（CR）a</td>
			<td>在与非条件刺激（US）建立关联后，对条件刺激（CS）产生的反应</td>
			<td>PROBOSCIS EXTENSION</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>非条件刺激（US）</td>
			<td>具有生物学意义、能引发反应的刺激</td>
			<td>SUCROSE/WATER SOLUTION</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>非条件反应（UR）a</td>
			<td>对非条件刺激（US）产生的反应</td>
			<td>PROBOSCIS EXTENSION</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>刺激间间隔（ISI）</td>
			<td>条件刺激（CS）起始与非条件刺激（US）起始之间的时间间隔</td>
			<td>ODOR to SUCROSE interval</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>试验间间隔（ITI）</td>
			<td>同一动物连续两次CS-US配对之间的时间间隔</td>
			<td>ODOR (trial n) to ODOR (trial n+1) interval</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1. 重要术语。 这些术语的图示见图1。a在PER条件反射中，条件反应（CR）与非条件反应（UR）相同，但在其他类型的关联和反射中，CR与UR可能不同。
<a href="/files/ftp_upload/51057/BEE_4.avi" target="_blank">视频 1.</a> 一只蜜蜂在经过气味条件化训练后表现出伸吻反应（PER）的视频。请注意，蜜蜂在气味呈现后约 1.5 秒出现 PER 反应。追踪软件记录了蜜蜂在气味刺激下触角的运动。视频右上角绘制的线条表示实际的触角运动轨迹。屏幕底部的两个图表分别显示了触角在 X 轴（左）和 Y 轴（右）方向上的运动。视频中图表内的垂直线从左至右依次表示：光开启、PER 反应、光关闭以及喙部回缩。

为蜜蜂（Apis mellifera）开发的 proboscis extension response（PER）条件化训练方案，为研究多种昆虫中不同的学习机制提供了一种生态相关性强且易于量化的手段。

昆虫通过将刺激与生存相关事件（如食物、配偶、威胁）相关联的经验，来调整其对刺激的反应。

本实验的总体目标是展示如何在蜜蜂中实现对食物简单反射性反应的行为条件化。首先捕捉蜜蜂，将其固定在束缚装置中，喂食少量分泌液，然后让其适应这种束缚状态。接着选择那些当触角接触蔗糖时表现出足够动机的蜜蜂进行条件化训练。在条件化过程中，将气味刺激与蔗糖奖励配对呈现，以诱发条件反应。随后，通过无强化试验来测定反应的有无、反应的潜伏期以及反应的持续时间。最后一步是数据分析及对条件化试验和测试试验结果的图形化呈现。该技术已成功应用于蜜蜂生物学和健康学习行为的研究，此类行为对杀虫剂等干扰性处理尤为敏感，因而能够在亚致死浓度下评估这些处理对蜜蜂行为的影响。对该方法的可视化演示有助于理解有效条件反射所需的刺激时序，以及常见错误对效果的降低作用。初学者在实施该方法时，往往难以把握实验方案及周边环境所要求的细节精度。首先，在工蜂从蜂群巢口出发前短暂停留或采食归巢时，收集工蜂。每个小瓶仅捕捉一只工蜂。盖紧瓶盖时，应将瓶口保持水平或朝下，以防止蜜蜂逃逸。采集蜜蜂后，返回实验室，将少量离心管依次放入冰水混合物中。当蜜蜂变得无法活动时，立即将离心管从冰水中取出，避免过度暴露，并将蜜蜂放入固定装置中。固定时使蜜蜂的背部胸节朝向固定架的切口部分，头部位于顶部稍上方位置。轻轻按压蜜蜂，使其口器伸出固定器边缘。将一条胶带从背部头部与胸部之间插入，并将胶带自由端牢固地粘贴在固定器侧面。确保固定装置上的胶带平整且绷紧。蜂只固定装置的前端与胶带之间不应有明显缝隙。若有缝隙，蜜蜂可能无法正常伸出其口器，或可能从中逃脱。将蜜蜂固定后，应让其恢复约30分钟，然后再进行喂食。然后在远离训练区域的地方，在喂食与条件刺激的间隔期间，给每只蜜蜂喂食约三到四微升的0.5摩尔蔗糖溶液。将蜜蜂置于实验室安静区域的塑料容器中，并在容器内放置湿润的纸巾。在此期间，于开始条件刺激前几分钟，用一滴0.5摩尔蔗糖溶液接触蜜蜂的触角，以测试其取食动机。在测试期间不要让它们进食。如果蜜蜂通过伸出喙来作出反应，则表明它们可能具有足够的学习动机，可用于本实验方案。准备就绪后，将玻璃气味注射器插入橡皮泥支架中，并调整位置，使注射器宽端的开口正对蜜蜂，距离蜜蜂10 E。将连接弹 cartridge 与气流管路及阀门系统的接头牢固地套在注射器的窄端，注射器末端应距离蜜蜂1至2厘米。每次试验开始时，将束缚好的蜜蜂放置在训练 arena 的插销上，使其触角正对气味 cartridges。在开始气味刺激前，让蜜蜂在 arena 中休息 15 至 25 秒，以适应新环境。按下启动按钮，以启动气味递送的计时装置。在刺激开始后、呈现非条件刺激之前，观察蜜蜂对气味的反应。每次试验后，让蜜蜂在训练区域继续停留15至25秒，以促进初始记忆的形成。若在试验结束后过早移动蜜蜂，将显著降低每次训练试验的效果。在呈现气味时，将针头尖端置于距离蜜蜂两到三厘米处以递送蔗糖溶液。使用训练区域的边缘固定，避免晃动注射器，因为这种动作可能会分散蜜蜂的注意力。在气味刺激呈现期间，会发出一个喂食信号声。当喂食信号响起时，轻轻触碰蜜蜂的触角，直到其伸出喙，然后立即喂食蜜蜂。气味刺激与蔗糖刺激呈现之间的时间间隔至关重要。理想情况下，这两种刺激应短暂重叠。如果气味呈现与蔗糖呈现之间的间隔超过几秒钟，蜜蜂的条件化表现将会下降。条件化训练完成后，使用无强化的测试试验来评估蜜蜂对条件化关联的记忆程度。首先，在训练区域上方的三脚架上架设一台摄像机，并将镜头对准蜜蜂头部的正面，使触角和喙处于清晰对焦状态。确保使用一个小型LED灯，用于指示气味刺激的呈现，该灯应放置在蜜蜂后方的一个区域，使其在视频中可见，但蜜蜂无法看到。这有助于在分析过程中识别气味开始和结束的时间。为了获得最一致的结果，在一切准备就绪后，使用 freshly prepared odor cartridges 进行测试。开始测试时，呈现之前所示的气味。在呈现气味前20秒开始记录，并在呈现气味后继续记录至少20秒。测试结束后，使用视频编辑软件对每只蜜蜂对刺激条件的反应进行评分。采用二元评分系统对蜜蜂的喙伸展反应进行评分，将反应结果记为阳性或阴性。将B的反应记为阳性。当B的喙伸展超过由张开的上颚尖端连线所形成的直线时，仅在气味刺激开始后、气味结束前出现喙伸展的情况下，才记为阳性反应；若在试验过程中未发生喙伸展，或喙在气味刺激结束后才伸展，则将B的反应记为阴性。此外，还可记录其他参数，例如伸展反应的潜伏期、伸展反应的次数以及伸展反应的总持续时间，以用于分析不同条件下的反应情况。随着后续条件化试验的进行，刺激强度逐渐增强。对新奇测试气味的反应，会根据该测试气味与刺激物在碳链长度和/或碳碳键位置上的差异程度而相应减弱。这些数据表明了不同新研究人员之间实验结果的变异性以及条件化训练的成功程度。对辛醇的反应因实施测试的组别而异。在测试试验中，用作条件刺激的气味引发的反应最强。当使用辛醇作为条件刺激时，与新型气味环十二酮相比，测试期间的反应更强。同样，当使用甲基环戊烯作为条件刺激时，产生的反应更强。当采用反向配对时，条件反应减弱至接近新气味的水平，这说明了精确时间控制对于成功建立条件反射的重要性。该技术的建立为神经科学领域的研究人员探索学习与记忆的神经基础，以及利用蜜蜂等昆虫模式生物开展研究铺平了道路。请注意，饲养昆虫（尤其是蜜蜂）可能存在危险。在操作这些动物时，务必穿戴适当的防护装备。

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神经科学

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