精子发生过程的细胞学分析：Drosophila 精巢的活体与固定制备

本实验的总体目标是解剖并制备果蝇睾丸以进行显微观察。首先从雄性果蝇的腹部解剖出成对的睾丸；第二步是在适当的发育阶段撕裂睾丸，并通过压片处理使睾丸内的细胞释放出来。

接下来，将压碎的睾丸组织进行固定，然后依次与一抗和二抗孵育。最后一步是将组织样本封片，用于成像。最终通过相差显微镜或免疫荧光显微镜观察精子发生不同阶段的细胞，以评估其缺陷和形态特征，并观察各种蛋白质的亚细胞定位情况。

该方法有助于解答发育生物学领域中的一些关键问题，例如鉴定蛋白质在精子发生过程中的关键作用。对果蝇睾丸进行解剖的可视化演示至关重要，因为初学者在操作初期可能难以在果蝇腹部定位睾丸。此外，组织压片操作的最佳方法通过演示比单纯用文字描述更为直观和易于理解。

开始解剖时，使用二氧化碳气流对装在瓶子或小瓶中的果蝇进行麻醉。然后将麻醉后的果蝇转移至果蝇操作垫上。在解剖显微镜下，用小型画笔对果蝇进行分选，收集约六至八只所需基因型的雄性果蝇。

接下来，用镊子去除每只果蝇的翅膀。这可以防止果蝇在液体中漂浮。解剖过程中，在黑色背景的硅胶包被解剖皿上，加入500 µL磷酸盐缓冲液（PBS），以单滴形式加入。

然后将镊子指向一只去翅果蝇的前端，用镊子夹住其胸部，并将其浸入PBS液滴中。找到位于腹侧腹部后端的深褐色结构，用另一把镊子夹住并向后拉外部生殖器，直至其与腹部脱离。

大多数情况下，睾丸、精囊和附属腺体会随外生殖器一起从腹部取出。但如果未完全取出，可用一对镊子插入腹部，将睾丸轻轻分离出来。使用两对镊子将睾丸与附属腺体及外生殖器分离。

通过其黄色将野生型睾丸与邻近的白色组织区分开来。为准备活体成像样品，用一对镊子将两到三对睾丸轻轻放入置于方形玻璃盖玻片上的四到五微升PBS液滴中。接下来，撕开。

用镊子在适当位置切开每个睾丸，以最大程度地使制备样本中包含所需的生殖系细胞类型。睾丸内容物将从撕裂处释放到载玻片上。在压片步骤中，为富集精原细胞和初级精母细胞，应从睾丸顶端附近将其撕开。

对于精母细胞和精子细胞，撕开睾丸的位置应略偏基部，位于第一层水平稍下方，以富集更成熟的生殖细胞。撕开睾丸时应靠近曲率开始处。下一步是轻柔地将载玻片盖在盖玻片上，压平睾丸组织。

不要手动施加压力，避免产生气泡。样本制备后应在15分钟内使用，以观察活细胞。通过相差显微镜观察，用擦拭纸轻轻从盖玻片边缘吸去多余液体，使样本展平，直至生殖细胞清晰聚焦。

使用金属镊子将含有压片睾丸的载玻片浸入液氮中，快速冷冻制备好的载玻片，直至液氮停止沸腾。立即用刀片移除盖玻片。然后用金属镊子将载玻片转移至装有冰冻95%乙醇的预冷玻璃载玻片架中，并在-20摄氏度下保存10分钟。

将平衡后的玻片转移至盛有含0.1%Triton X-100的4%多聚甲醛PBS溶液（即PBST）的玻璃玻片架中，室温下孵育七分钟。随后将玻片转移至盛有PBS的玻片架中。在室温下用PBS洗涤玻片五分钟，方法是弃去架中的溶液，并更换为新鲜的PBS溶液。

重复洗涤一次。弃去PBS，将载玻片浸入PBST中，在室温下孵育30分钟以通透细胞膜。随后在室温下用PBS洗涤载玻片三次，每次五分钟。用疏水屏障笔在载玻片上的压片组织周围画一个圆圈，以限制抗体溶液的扩散，并在进行免疫染色时始终保持组织湿润。

然后在圆圈内的组织上加入30至40微升用PBST稀释的一抗。在室温下孵育两小时，或在4摄氏度下过夜孵育一抗后，将切片置于湿润避光的孵育盒中。用PBS在室温下洗涤切片三次，每次五分钟。

然后向组织中加入30至40微升用PBS稀释的Alexa Fluor 488标记的二抗，在室温下避光孵育1至2小时。接着在室温下用PBS洗涤载玻片三次，每次5分钟。然后在圆圈内的组织上加入30至40微升DAPI溶液。

将玻璃盖玻片轻轻覆盖在组织上，需格外小心以避免产生气泡。若出现气泡，应小心移动盖玻片，注意不破坏样本，直至气泡从盖玻片边缘逸出。用擦拭纸从载玻片边缘吸去多余的液体。

然后用指甲油封固盖玻片，并在3至4小时内使用荧光显微镜观察免疫染色的细胞。该示意图展示了果蝇睾丸中不同细胞成熟阶段的位置。第1级包含处于精子发生早期阶段的较年轻细胞，第3级则包含更为成熟的精子细胞。

第二层包含处于有丝分裂期和有丝分裂后阶段的生殖细胞混合群体。相应的相差显微图像显示，当睾丸在第一层撕裂时，会释放出精原细胞以及早期和晚期初级精母细胞。黄色箭头还指向因胞质分裂不完全而形成的两个或多个相互连接细胞的融合体。

此处展示的压片操作会产生一种人工假象，即相应的相差图像显示，当睾丸在第二层撕裂时，晚期初级精母细胞和减数分裂后细胞（包括圆形精子细胞、伸长中的精子细胞以及成熟精子）被释放出来。对压碎的睾丸进行相差显微成像也可用于快速识别大量圆形精子细胞中的异常。此处显示的是野生型精子细胞，其具有一个折光性较亮的细胞核，附着于一个折光性较暗、大小相近的单个线粒体聚集体上。

相比之下，Aun 睾丸中的精子细胞由于胞质分裂失败以及染色体分离错误，含有多个小型细胞核和一个大的线粒体聚集体。此处显示的灰度图像来自压片染色的睾丸样本，所用试剂可分别对微管、DNA 和中心体进行彩色标记。这些图像共同展示了一个正在分裂的精母细胞、一大片圆形的精子细胞以及一束成熟的精子。一旦熟练掌握样品制备技术，相差显微镜观察可在 20 至 30 分钟内完成。

如果操作得当，免疫荧光显微镜样品的制备可在六小时内完成。除了将睾丸组织用于显微镜检测外，解剖得到的睾丸组织还可用于蛋白质的生物化学分析。