精子发生的细胞学分析：Live和固定制剂果蝇睾丸
January 20th, 2014
方法分离和制备果蝇睾丸样品（住和固定的），用于成像由相衬和荧光显微术在本文中描述。
该程序的总体目标是解剖和准备用于显微镜检查的 oph 睾丸。这是通过首先从雄性果蝇的腹部解剖出睾丸对来完成的。第二步是在适当的发育水平撕裂睾丸，并挤压睾丸以释放其中的细胞。
接下来，固定压扁的睾丸，然后在一抗和二抗中孵育。最后一步是将组织安装在载玻片上进行成像。最终，相差或免疫荧光显微镜用于观察处于精子发生不同阶段的细胞缺陷和形态，并观察各种蛋白质的亚细胞定位。
这种方法可以帮助回答发育生物学领域的关键问题，例如确定蛋白质在精子发生过程中的关键作用。RAs 睾丸解剖的视觉演示至关重要，因为该程序的新手最初可能难以在苍蝇腹部内找到睾丸。此外，演示而不是用语言描述执行组织挤压的最成功方法更容易。
开始解剖时，使用二氧化碳流麻醉瓶子或小瓶中的果蝇。然后将麻醉的苍蝇转移到苍蝇垫上。使用小画笔在解剖显微镜下对果蝇进行分类，以收集大约 6 到 8 只所需基因型的 oph 雄性。
接下来，用镊子从每只苍蝇上取下翅膀。这将防止苍蝇漂浮在液体中。在解剖过程中，将 500 微升磷酸盐缓冲盐水或 PBS 一滴加入到黑色背景的硅胶涂层解剖皿上。
然后将镊子指向其中一只有翅膀的苍蝇的前端。抓住它的胸部并将其浸入 PBS 滴剂中。识别位于腹侧后端的深棕色结构，并使用另一对镊子抓住并向后拉动外生殖器，直到它与腹部分离。
在大多数情况下，睾丸、精囊和副腺将与外生殖器一起从腹部取出。但是，如果不是，请将一对镊子插入腹部并梳理出睾丸。使用两对镊子将睾丸与副腺和外生殖器分开。
通过黄色区分野生型睾丸和邻近的白色组织。为了准备用于实时成像的样品，使用一对镊子将两到三对睾丸轻轻放入方形玻璃盖玻片上的 4 到 5 微升 PBS 液滴中。接下来，撕裂。
用一对镊子在适当的水平位置打开每个睾丸，以最大限度地增加制剂中所需种系细胞类型的存在。睾丸的内容物将从撕裂区域流出到载玻片上。在挤压步骤中，为了丰富精原细胞和精母细胞，撕开与其顶端相邻的睾丸以丰富。
对于精母细胞和精子细胞，在略基部至第一水平的位置撕开睾丸，以丰富更成熟的生殖细胞。在靠近弯曲开始位置的地方撕开睾丸。下一步是通过将显微镜载玻片轻轻地放在盖玻片上来压扁睾丸。
请勿手动施加压力，避免捕获气泡。在制备后 15 分钟内使用样品观察活细胞。通过相差显微镜检查，使用清洁抹布轻轻吸走盖玻片下方的多余液体，使制剂变平，直到生殖细胞清晰聚焦。
用一对金属钳将含有南瓜睾丸的载玻片浸入液氮中，直到液体停止冒泡，从而快速冷冻制备的载玻片。立即用剃须刀片取下盖玻片。然后用金属钳将玻片转移到装有冰冷的 95% 乙醇的预冷载玻片架上，并将样品在零下 20 摄氏度下储存 10 分钟。
将平衡玻片转移到装有 4% 甲醛的 PBS 溶液和 0.1%Triton X 100 或 PBST 的载玻片架上，并在室温下储存 7 分钟。然后将载玻片转移到装满 PBS 的架子上。将玻片架中的溶液丢弃在架子上，用新鲜的 PBS 溶液替换，在 PBS 中洗涤玻片 5 分钟。
重复洗涤一次。弃去 PBS，在室温下将玻片浸入 PBST 中 30 分钟，以渗透细胞膜。然后在 PBS 中洗涤玻片 3 次，持续 5 分钟在室温下，用疏水屏障笔在玻片上的南瓜组织周围画一个圆圈，以限制抗体溶液并在进行免疫染色时始终保持组织湿润。
然后将 30 至 40 微升在 PBST 中稀释的一抗添加到圆圈内的组织中。在一抗中孵育后，将玻片在潮湿的暗室中室温孵育 2 小时，或在 4 摄氏度下孵育过夜。在室温下用 PBS 洗涤玻片 3 次，每次 5 分钟。
然后向组织中加入 30 至 40 微升地板、四种用 PBS 稀释的偶联二抗，并在室温下避光孵育 1 至 2 小时。接下来，在室温下用 PBS 洗涤玻片 3 次，每次 5 分钟。然后将 30 至 40 微升 dappy 溶液添加到圆圈内的组织中。
轻轻地将玻璃盖玻片盖在纸巾上，格外小心，以免捕获任何气泡。如果出现气泡，请小心移动盖玻片，不要破坏样品，直到气泡从盖板侧面逸出。用清洁布从载玻片边缘吸干多余的 dapp。
然后在 3 到 4 小时内使用指甲油 view immuno 染色细胞密封盖玻片。这幅漫画描绘了果蝇睾丸内各种细胞成熟水平的位置。第一级包含处于精子发生早期阶段的年轻细胞，第三级包含更成熟的精子细胞。
第二级包含有丝分裂和后有丝分裂种系细胞的混合群体。相应的相差图像显示了当睾丸在第一级撕裂时，精原细胞以及早期和晚期原代精母细胞的释放。黄色箭头还指向两个或多个相互连接的细胞因不完全胞质分裂而融合。
此处显示的挤压过程的伪影是相应的相差图像，显示了当睾丸在第二级撕裂时，晚期原代精母细胞和后肌细胞的释放，包括圆形精子细胞、细长精子细胞和成熟精子。南瓜睾丸的相差成像也可用于轻松识别丰度圆形中的缺陷。精子细胞：具有一相轻核的野生型精子细胞，这里显示了附着在大致相等大小的相暗单线粒体聚集体上。
相比之下，来自 Aun 睾丸的精子细胞包含多个小细胞核和一个大线粒体聚集体，这是胞质分裂失败和染色体分离错误的结果。此处显示的灰度图像来自用试剂染色的南瓜睾丸制备物，这些试剂可识别彩色微管 DNA 和中心体。组合的图像显示了一个分裂的精母细胞、大面积的圆形精子细胞和一束成熟的精子一旦掌握了相差样品的制备，显微镜检查就可以在 20 到 30 分钟内完成。
如果作得当，免疫荧光显微镜检查样品的制备可以在 6 小时内完成。除了用于显微镜检查的 oph 睾丸处理外，解剖的睾丸还可以用于蛋白质的生化分析。
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概述
本文介绍了分离和准备果蝇睾丸样本以进行显微镜观察的方法。这些技术包括解剖、固定和抗体孵育以观察细胞结构。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 生物学
- 显微镜学
背景
- 果蝇是生物学研究中的模式生物。
- 睾丸发育对理解精子发生至关重要。
- 显微镜技术允许详细的细胞观察。
- 免疫荧光可以揭示蛋白质定位。
研究目的
- 解剖并准备睾丸以进行显微镜观察。
- 观察精子发生各个阶段的细胞。
- 识别发育中细胞的缺陷和形态。
使用的方法
- 解剖雄性果蝇的睾丸对。
- 撕裂和压碎睾丸以释放细胞。
- 固定压碎的睾丸以便进一步分析。
- 用一抗和二抗孵育。
主要结果
- 成功分离睾丸以进行成像。
- 观察不同发育阶段的细胞结构。
- 识别精子发生中的缺陷。
- 细胞内蛋白质的定位。
结论
- 这些方法提供了一种可靠的方法来准备果蝇睾丸进行显微镜观察。
- 研究结果有助于理解精子发生。
- 这些技术可以应用于研究其他发育过程。
常见问题
Executive Industry Relevance
This protocol enables detailed visualization of germline cell development in a genetically tractable model, supporting target validation in reproductive biology and mechanistic studies of cell division. By providing reproducible preparation of Drosophila testes for phase-contrast and immunofluorescence microscopy, it facilitates phenotypic screening of mutants affecting spermatogenesis. The approach aids in de-risking hypotheses about protein function during gametogenesis through direct observation of subcellular localization and developmental defects.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by visualizing protein localization during spermatogenesis stages.
- Operational Value: Supports functional target validation through direct observation of cellular phenotypes in mutant backgrounds.
- Predictive Value: Assists in mechanistic de-risking by linking molecular perturbations to observable defects in germ cell development.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Produces standardized biological samples suitable for quantitative imaging-based screening of genetic or chemical perturbations.
- Reproducibility: Enables consistent preparation of testes squashes for reliable phase-contrast and fluorescence readouts across experiments.
- Scalability: Supports parallel processing of multiple genotypes for comparative analysis of spermatogenic defects.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Provides a disease-relevant system for studying conserved mechanisms of meiosis and cytokinesis applicable to infertility research.
- Translational Continuity: Bridges discovery findings in Drosophila to preclinical models through conserved spermatogenic pathways.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables early-stage phenotypic assessment to prioritize targets with measurable developmental impact.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery workflows, supporting hypothesis testing in target validation and generating quantitative imaging data for lead identification in reproductive biology pathways.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing and pathway clarification by enabling visualization of germline cell progression and defects.
- Screening: Delivers assay-ready samples with quantitative outputs for evaluating genetic or pharmacological modifiers of spermatogenesis.
- Analytics: Generates measurable imaging readouts (e.g., cell morphology, localization patterns) to compare experimental conditions.
- Translational Research: Supports preclinical continuity by modeling conserved mechanisms of gametogenesis.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for developmental biology screening across multiple mutant lines or treatment conditions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target roles by reducing ambiguity in mechanistic interpretations through direct cytological observation.
- Operational Value: Enhances standardization and reproducibility of germline sample preparation across laboratories.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing phenotypic evidence to de-risk targets early in discovery.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on observable developmental phenotypes in a high-throughput compatible system.
Implementation Considerations
- Requires expertise in Drosophila handling, dissection, and microscopy techniques.
- Dependent on dissection microscopes, fluorescence or phase-contrast imaging systems, and standard histology tools.
- Necessitates standardization of squash timing, fixation, and antibody incubation across users for consistent results.
- Adaptation considerations include adjusting tear position and squash pressure for different germline cell enrichment goals.
- Practical limitations include tissue fragility during squashing and the need for rapid live imaging within 15 minutes of preparation.
