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Functional Analysis of the Larval Feeding Circuit in Drosophila

在幼虫馈电电路的功能分析果蝇

Full Text

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09:23 min

November 19, 2013

DOI: 10.3791/51062-v

Parag K. Bhatt¹, Wendi S. Neckameyer¹

¹Department of Pharmacological and Physiological Science,Saint Louis University School of Medicine

Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.

Summary

供电电路在果蝇幼虫提供了一个简单但功能强大的模型，它允许改变喂养率与在stomatogastric神经回路的改变相关。这个电路是由该发送突起的钩口以及前肠中央血清素能神经元。

Transcript

该程序的总体目标是利用果蝇模型系统将行为输出与神经结构的变化相关联。这是通过首先设置成年果蝇的种群笼来收集幼虫来实现的。该程序的下一步是评估晚期 2 龄至 3 龄早期幼虫的运动能力。

第三步是通过观察幼虫口钩的伸展和缩回来评估幼虫的摄食行为。最后一步是使用免疫组织化学技术从晚期 3 龄幼虫解剖和制备经过验证的脑室样本。最终，结果可以通过行为检测和免疫荧光显微镜的结合来显示发育过程中神经结构的畸变与行为变化的关系。

这项技术的影响延伸到更好地理解神经结构的发展，这使人们能够更好地了解神经系统疾病的进展。演示该程序的将是我实验室的研究生 prag bot。在 25 小时的明暗周期中将果蝇种群笼保持在 12 摄氏度。

只要对照组和实验组暴露在相同的照明条件下，那么这项技术就可以在标准的实验室环境中进行。利用已建立的种群，通过让雌性在苹果汁上产卵过夜来收集幼虫。琼脂板在早上更换板，并在收集的板的中心放置一小块酵母。

酵母会吸引孵化的幼虫，让卵在 24 摄氏度下发育 25 小时，第二天，从糊状物中收集第一龄幼虫。使用金属刮刀将幼虫转移到新鲜的苹果汁或葡萄汁盘中。可以添加额外的酵母糊来滋养幼虫，直到进行检测以收集第二龄和早期第三龄幼虫，让第一龄幼虫老化 40 至 48 小时。

在此期间，饲喂率是恒定的。晚期 3 龄幼虫在瓶子中饲养幼虫。由于体细胞胃系统中积聚的农业物质，在果汁盘上饲养晚期三龄幼虫可能是有害的。

幼虫年龄可以通过口钩形态来确认，因为这种结构有明显的变化。对于每个幼虫霉菌，通过用水轻轻而广泛地清洗果汁板并将幼虫倒入网状过滤器中来收集晚期第二龄和早期第三龄幼虫，然后进行行为分析。将单个晚二龄至早三龄幼虫放在 100 毫米组织培养皿中的 2% acer 基质上，让幼虫适应 30 秒，正好一分钟。

使用计数器统计基质上从后到前的运动，对动物身体四分之三以上发生的每次收缩进行评分。当幼虫左右摇晃，但实际上没有改变位置时，这些运动不会被评分。偶尔，完全前后收缩会产生向后运动，如向前运动。

向后运动也被评分。在总共测试 10 只动物后更换检测板。每个实验条件至少进行 20 次记录。

使用钝性 inox 对喂养测定中用于运动测定的每种幼虫进行评分。第五名，镊子。小心地将幼虫从运动 agri 板转移到覆盖有 5 毫升均质酵母溶液的 agri 填充板的中心。

在酵母溶液中，幼虫将大部分留在原地，饲料喂养与口钩收缩的速度直接相关，这被视为头咽部收缩权的伸展和收缩让幼虫适应 30 秒，然后 1 分钟，使用计数器记录口钩收缩的次数。首先将新鲜制备的 4% EM 级甲醛 PBS 溶液加载到三孔点状玻璃杯中。然后将游荡的第三龄幼虫转移到含有 PBS 的解剖皿中。

用一个镊子握住后端，用另一个镊子握住嘴钩，同时保持后端不动。轻轻拉动口钩以进入内脏。去除任何相关组织，如唾液腺、大脑、脂肪体等。

然后将每个肠道转移到含有甲醛固定物的三孔培养皿中。将内脏在 4 摄氏度下在不透明的组织培养箱中孵育过夜。第二天，在取出固定溶液之前，取出胃 seca 并将中肠夹在经过验证的脑室附近，以便可以毫无阻碍地清楚地看到投影。

现在，用一个 XPBT 替换固定剂，让组织在轻轻摇动下孵育 10 分钟。进行此 PBT 洗涤六次。接下来，添加血清素，这将在不影响神经结构的情况下增强血清素信号传导。

然后将内脏在 4 摄氏度下孵育一小时，不要摇晃。一小时后，用 PBT 彻底清洗内脏 6 次，以去除一抗。然后将内脏在 4 摄氏度下与抗血清素一抗一起孵育过夜。

第二天，重复 6 次 PPT 洗涤，然后在 4 摄氏度下孵育二抗 90 分钟。使用 1 比 400 Alexa 地板 5 68 山羊抗 US，或 1 比 400 抗兔 IgG。使用 PBT 洗涤方案去除二抗，然后将内脏在 4 毫摩尔碳酸钠中孵育，轻轻摇动 10 分钟。

然后可以将内脏封固在 4% N 没食子酸丙酯中，以 20 毫摩尔碳酸钠作为缓冲液，并在 400 倍放大倍率的荧光下观察以进行分析。避免在经过验证的脑室的后端拍摄图像，因为这些纤维紧密捆绑在一起。中肠中更多的后纤维更分枝，因为它们一旦进入组织就会束缚。

神经突纤维可以通过使用 neuro lucita 和 neuro Explorer 等商业软件进行量化，也可以通过手动计算或使用免费提供的软件进行量化。不清晰的简单 nerite 示踪图像将难以区分纤维和静脉曲张，如果纤维结构与背景明显区分开来，则不应使用。如果可以沿 nerite 长度识别单个静脉曲张，则该制剂适合用于分析。

此外，如果可以从纤维的其余部分识别出单个静脉曲张，这是用于分析的高质量图像的另一个指标。从大脑伸出的轴突纤维被束缚在复发神经中，在它们到达已证实的心室并在那里分离和支配之前不适合进行分析。脂肪胃系统 分析所有纤维，除了那些超出焦点范围的纤维。

在某些情况下，纤维会在多个焦点平面之间弯曲，追踪从大脑到已证实的心室的单个纤维投射，并计算静脉曲张和分支，然后计算每单位长度大静脉曲张的频率。研究 5-羟色胺能喂养回路对于分析特定因素对神经系统发育的影响是有效的。通过定量进给速率，可以将进给回路的轴突结构与其功能输出联系起来。

运动测定显示对照基因型和突变基因型之间的运动反应没有差异。如果突变仅影响摄食回路，则突变椭球体打开。EBO 3 在中央复合体的椭球体中有一个结构缺陷。

野生型亲本菌株。CSWU 揭示，EO 3 导致喂养抑制，而运动不受影响。EO 3 突变体的发育缺陷影响了肠道的尿酸盐结构。

这些幼虫沿尿酸盐长度显示出更多的分枝和更多的静脉曲张，无论大小。请注意箭头处的分支节点、箭头处的静脉曲张和星号处的大静脉曲张。对神经分支的这些变化进行量化以进行统计分析。

尝试此程序时，请务必记住不要损坏幼虫或解剖的组织样本。

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