Name: 在幼虫馈电电路的功能分析果蝇 /i (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-19T16:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: 了解黑腹果蝇幼虫摄食行为与神经环路的关系，通过行为学检测和免疫荧光显微镜技术，研究神经结构变化如何影响摄食功能。该方法为神经发育与行为研究提供重要模型。

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作者谨此致谢圣路易斯大学授予 W.S.N. 的校长研究基金。

1. 种群笼具的维护
<ol>
	<li>在标准实验室环境中，将种群培养笼维持在25 °C、12小时光照-12小时黑暗的循环条件下。只要对照组和实验组暴露于相同的光照条件，该技术即可在标准实验室条件下进行。</li>
	<li>让雌虫在苹果汁-琼脂培养板上过夜产卵。</li>
	<li>将带有新产卵的培养板在25 °C下孵育24小时，以收集新孵化的幼虫。在培养板中央放置少量酵母糊，以吸引孵化出的幼虫聚集。</li>
	<li>收集已迁移到苹果汁培养板中央酵母糊中的1st 龄幼虫。使用金属刮刀将其转移至新的苹果汁培养板。可额外添加酵母糊，以确保在进行实验前有充足的食物供应。也可使用葡萄汁培养板替代苹果汁培养板。</li>
	<li>将1st 龄幼虫培养40–48小时，以获得晚期2nd 龄至早期3rd 龄幼虫。在此时间段内，幼虫的摄食速率保持恒定13。可通过观察口钩结构来确认幼虫龄期，因为每次蜕皮后口钩形态均有明显变化。</li>
	<li>通过用水轻轻且充分地冲洗苹果汁培养板，并用滤网收集幼虫，以获取用于行为实验的晚期2nd 龄至早期3rd 龄幼虫。随后将幼虫转移至琼脂培养板。</li>
	<li>所有分析均需平行使用对照组和实验组动物进行。</li>
</ol>
2. 行为范式——运动
<ol>
	<li>放置一个3rd 2% 琼脂基质上的一龄幼虫，在 100&#160;mm 组织培养皿中，让幼虫适应30秒。幼虫利用其头咽骨（口钩）推动身体在琼脂基质表面移动。此步骤需在单独的培养皿中进行，因为在酵母溶液中观察身体收缩较为困难，因幼虫体色与酵母几乎相同。</li>
	<li>观察并记录每只动物在基质上从后向前运动的情况，持续1分钟。每种基因型n = 20。每块培养板上检测的动物数量不得超过10只。</li>
</ol>
3. 行为范式——进食
<ol>
	<li>使用钝头 Inox #5 镊子，小心地将运动琼脂平板上的3rd 龄幼虫转移至铺有5&#160;ml 2%活化面包酵母溶液的琼脂平板中央。确保酵母溶液均匀，因为酵母会随时间沉降。幼虫在酵母溶液中通常保持静止并持续摄食，便于观察其行为。口钩收缩频率与摄食量呈直接正相关14。</li>
	<li>让幼虫适应环境30秒。</li>
	<li>观察并记录1分钟内口钩收缩次数。每种基因型n = 20。</li>
</ol>
4. 幼虫肠道解剖
<ol>
	<li>配制4%电子显微镜级甲醛固定液于1x缓冲液中&#160;磷酸盐缓冲液（PBS）并置于三孔玻璃板中。</li>
	<li>仔细解剖出游走期三龄幼虫rd 在3孔玻璃培养皿中使用1x处理二龄幼虫肠道&#160;PBS 溶液，每次操作均需确保前胃保持完整。用一把镊子夹住后端，另一把镊子夹住口钩。在固定后端不动的同时，轻柔地牵拉口钩以暴露肠道。去除相关联的组织（唾液腺、脑、脂肪体， 等等。），然后将每根肠道转移至含有甲醛固定液的3孔板中。游走3rd 使用该龄期幼虫是因为在此发育阶段，幼虫为化蛹做准备而停止进食，前胃中的酵母已被清除。</li>
	<li>在避光的组织培养盒中，于 4 °C 过夜孵育肠道组织。</li>
	<li>在移除孔板中的甲醛固定液之前，先去除胃盲囊，并在距中肠约150 µm处剪切2 从腺胃分离，以便清晰无阻碍地观察其投射结构。</li>
	<li>去除孔中的甲醛固定液，并替换为1x&#160;PBT (1×&#160;PBS、0.1% 无蛋白酶牛血清白蛋白、0.1% Triton X-100 缓冲液。彻底清洗肠道，每次 10 分钟，共洗 6 次&#160;在1x&#160;PBT。洗涤时将组织样本置于机械旋转仪上。</li>
	<li>4 °C 下孵育 1 小时，体积为 10-6 M 5-HT 以增强血清素信号传导。将肠道彻底清洗 6 次，每次 10 分钟&#160;在 1x&#160;PBT。先前的研究表明，外源性5-HT的这一浓度在免疫组织化学分析中不会影响神经元结构或曲张体密度，仅能提高信噪比。15-16.</li>
	<li>4 °C 下用抗 5-羟色胺一抗（小鼠来源的单克隆抗体或兔来源的多克隆抗体）孵育过夜。用缓冲液彻底清洗肠道，每次 10 分钟，共洗 6 次&#160;在1x&#160;PBT。洗涤时将组织样本置于机械旋转器上。</li>
	<li>4 °C 下孵育 90 分钟&#160;二抗孵育（Alexa Fluor 568 标记的山羊抗小鼠或抗兔 IgG；1:400 稀释）。充分清洗肠道，每次 10 分钟，共洗 6 次&#160;在1x&#160;PBT。洗涤时将组织样本置于机械旋转器上。</li>
	<li>在 4 mM 碳酸钠中孵育 10 分钟&#160;在机械旋转器上孵育后，用4%没食子酸正丙酯/20 mM碳酸钠封片，然后在荧光显微镜下观察。碳酸钠用于将样品转换至封片介质所用的缓冲液和pH条件。</li>
	<li>在400倍放大倍数下拍摄免疫染色组织样本的图像用于分析。</li>
</ol>
5. 神经环路分析
<ol>
	<li>使用 Neuroleucida 和 Neuroexplorer 对神经突纤维进行量化（包括曲张体的数量和大小以及分支程度）。然而，此操作也可通过手动完成，或使用 Simple Neurite Tracer（一种可在线下载的免费应用程序）进行。</li>
	<li>追踪从脑部至前胃的单根纤维投射，并量化单位长度内的曲张体数量、分支数量以及大曲张体的数量。从脑部发出的轴突纤维汇集成返神经，在到达前胃之前无法进行分析，因为只有在前胃区域这些纤维才会分散并形成束状结构。</li>
</ol>

<ol><li>Weiss, E., Maness, P., Lauder, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+do+neurotransmitters+act+like+growth+factors%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Perspect+Dev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Why do neurotransmitters act like growth factors?</a> Perspect Dev Neurobiol. 5, 323-335 Forthcoming.</li>
<li>Herlenius, E., Lagercrantz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotransmitters+and+neuromodulators+during+early+human+development%5BTitle%5D)+AND+%22Early+Hum.+Dev%22%5BJournal%5D)">Neurotransmitters and neuromodulators during early human development.</a> Early Hum. Dev. 65, 21-37 Forthcoming.</li>
<li>Budnik, V., Wu, C., White, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+branching+of+serotonin-containing+neurons+in+Drosophila+mutants+unable+to+synthesize+serotonin+and+dopamine%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Altered branching of serotonin-containing neurons in Drosophila mutants unable to synthesize serotonin and dopamine.</a> J. Neurosci. 9, 2866-2877 (1989).</li>
<li>Sodhi, M., Sanders-Bush, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serotonin+and+brain+development%5BTitle%5D)+AND+%22International+Review+of+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Serotonin and brain development.</a> International Review of Neurobiol. 59, 111-174 (2004).</li>
<li>Goldberg, J., Kater, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+function+of+the+neurotransmitter+serotonin+during+development+of+the+Helisoma+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Expression and function of the neurotransmitter serotonin during development of the Helisoma nervous system.</a> Dev. Biol. 131, 483-495 (1989).</li>
<li>Goldberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serotonin+regulation+of+neurite+outgrowth+in+identified+neurons+from+mature+and+embryonic+Helisoma+triyolvis%5BTitle%5D)+AND+%22Perspect+Dev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Serotonin regulation of neurite outgrowth in identified neurons from mature and embryonic Helisoma triyolvis.</a> Perspect Dev Neurobiol. 5, 373-387 (1998).</li>
<li>Haydon, P., McCobb, P., Kater, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serotonin+selectively+inhibits+growth+cone+motility+and+synaptogenesis+of+specific+identified+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Sci%22%5BJournal%5D)">Serotonin selectively inhibits growth cone motility and synaptogenesis of specific identified neurons.</a> Sci. 226, 561-564 (1984).</li>
<li>Neckameyer, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+trophic+role+for+serotonin+in+the+development+of+a+simple+feeding+circuit%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A trophic role for serotonin in the development of a simple feeding circuit.</a> Dev. Neurosci. 32, 217-237 Forthcoming.</li>
<li>De Vry, J., Schreiber, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+selected+serotonin+5-HT+1+and+5-HT+2+receptor+agonists+on+feeding+behavior%3A+possible+mechanisms+of+action%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Biobehav.+Rev%22%5BJournal%5D)">Effects of selected serotonin 5-HT 1 and 5-HT 2 receptor agonists on feeding behavior: possible mechanisms of action.</a> Neurosci. Biobehav. Rev. 24, 341-353 (2000).</li>
<li>Schoofs, A., Niederegger, S., van Ooyen, A., Heinzel, H., Spieß, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+brain+can+eat%3A+Establishing+the+existence+of+a+central+pattern+generator+for+feeding+in+third+instar+larvae+of+Drosophila+virilis+and+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Insect+Physiol%22%5BJournal%5D)">The brain can eat: Establishing the existence of a central pattern generator for feeding in third instar larvae of Drosophila virilis and Drosophila melanogaster.</a> J. Insect Physiol. 56, 695-705 (2010).</li>
<li>Spieß, R., Schoofs, A., Heinzel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy+of+the+stomatogastric+nervous+system+associated+with+the+foregut+in+Drosophila+melanogaster+and+Calliphora+vicin+third+instar+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Morphol%22%5BJournal%5D)">Anatomy of the stomatogastric nervous system associated with the foregut in Drosophila melanogaster and Calliphora vicin third instar larvae.</a> J. Morphol. 269, 272-282 (2008).</li>
<li>Neckameyer, W. S., Bhatt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotrophic+actions+of+dopamine+on+the+development+of+a+serotonergic+feeding+circuit+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Cent+NeuroSci%22%5BJournal%5D)">Neurotrophic actions of dopamine on the development of a serotonergic feeding circuit in Drosophila melanogaster.</a> Biomed Cent NeuroSci. 13, 26(2012).</li>
<li>Sewall, D., Burnet, B., Connolly, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+larval+feeding+behavior+in+Drosophila+melanogaste%5BTitle%5D)+AND+%22Genet.+Res%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of larval feeding behavior in Drosophila melanogaste.</a> Genet. Res. 24, 163-173 (1975).</li>
<li>Joshi, A., Mueller, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+higher+feeding+rate+in+Drosophila+due+to+density-dependent+natural+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Evolution%22%5BJournal%5D)">Evolution of higher feeding rate in Drosophila due to density-dependent natural selection.</a> Evolution. 42, 1090-1093 (1988).</li>
<li>Budnik, V., Wu, C., White, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+branching+of+serotonin-containing+neurons+in+Drosophila+mutants+unable+to+synthesize+serotonin+and+dopamine%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Altered branching of serotonin-containing neurons in Drosophila mutants unable to synthesize serotonin and dopamine.</a> J. Neurosci. 9, 2866-2877 (1989).</li>
<li>Sykes, P., Condron, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+sensitivity+to+serotonin+of+Drosophila+varicosities+in+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Development and sensitivity to serotonin of Drosophila varicosities in the central nervous system.</a> Dev. Biol. 286, 207-216 (2005).</li>
<li>Garrity, P. A., Goodman, M. B., Samuel, A. D., Sengupta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Running+hot+and+cold%3A+behavioral+strategies%2C+neural+circuits%2C+and+the+molecular+machinery+for+thermotaxis+inC.+elegansand+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Running hot and cold: behavioral strategies, neural circuits, and the molecular machinery for thermotaxis inC. elegansand Drosophila.</a> Genes Dev. 24, 2365-2382 (2010).</li>
<li>McKemy, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature+sensing+across+species%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Archives%22%5BJournal%5D)">Temperature sensing across species.</a> Pflugers Archives. 454, 777-791 (2007).</li>
</ol>

我们无任何利益冲突需要披露。

在晚期胚胎发育过程中，血清素能口胃神经回路的异常发育将影响其成熟后的功能。支配肠道的神经突结构改变可与该神经回路的功能输出（即摄食速率，通过酵母溶液中口钩收缩次数来测量）相关联 （图1）。在黑腹果蝇（Drosophila）中使用UAS-Gal4双组分系统，可实现对特定组织中某一转录本的上调或下调表达进行特异性靶向；在具备适当工具的前提下，可对特定蛋白表达水平的变化进行精确定量。该技术可用于阐明发育特定神经回路所必需的脑区甚至特定神经元亚群。
运动行为检测用于确认幼虫未出现其他生理功能受损；因此，每分钟体壁收缩次数等于或少于40次的幼虫应从分析中剔除（图2A）。这种情况可能由基因型导致的生理异常引起，也可能因个体动物在操作过程中受伤所致。此外，实验进行时所在房间的温度必须加以控制，因为温度过高或过低均可能影响实验数据。建议在24–26 °C的温度范围内进行该行为学检测。在测试室温较低的日子里，琼脂容易变硬；因此，每次完成运动检测后需重新润湿琼脂平板，以确保琼脂保持足够的柔软度。为使幼虫能够在表面移动...

Drosophila 是研究神经环路发育的极为强大的模式系统，因其世代周期短、实验成本低，且能够操控和控制遗传与环境因素。神经发生、神经元轴突导向及突触形成在人类与 Drosophila 之间是保守的；因此，构建、维持和修饰神经环路的机制也具有保守性。
经典神经递质（如5-羟色胺（5-羟基色胺，或5-HT））在发育早期可作为生长因子发挥作用，之后才在成熟的神经环路中承担信号分子的角色1-3 先前的研究表明，胚胎发育过程中5-HT水平的紊乱会改变成熟神经元的连接性4。其他研究发现，在培养的Helisoma神经元上异位施加5-HT会抑制神经突的生长以及突触形成5-7。在Drosophila中，发育期5-HT的水平与从中枢神经系统投射至前肠的神经突沿途的曲张体数量和大小以及分支程度呈负相关8。
血清素能神经传递已被证明可调节多种物种的摄食行为，包括Drosophila8-9。Drosophila的摄食神经回路相对简单，可作为模型用于将功能输出（摄食）与从脑部至前肠的轴突投射发育变化相关联。Schoofs et al. 已证明Drosophila幼虫的摄食行为由影响肌肉组织的中枢模式发生器所调控10。尽管具体的肌肉解剖结构尚未完全明确，但已有研究表明，触角神经、上颌神经和前胸附属神经负责支配参与摄食行为的肌肉靶点。目前有关无脊椎动物摄食的肌肉与神经解剖的研究数据主要局限于Calliphora幼虫。
通过观察二龄幼虫头咽骨（口钩）的回缩情况，可评估其摄食速率，该方法具有可重复性和高通量特点。头咽骨板由中枢5-HT神经元通过前神经发出的神经纤维支配。前胃（又称前肠）则由5-羟色胺能纤维（回返神经）支配，这些纤维在中肠处成束，并介导前胃的收缩活动（图1）11-12。沿神经突延伸的轴突分支形态，以及神经突上串珠样膨大的数量和大小，可通过免疫组织化学技术进行定量分析。在发育过程中对神经元5-HT进行直接或间接调控，可改变该摄食神经回路的功能输出，这种功能变化可被检测，并与神经突结构形态的改变相关联。

<table><tbody><tr><td>尼康 E-800 显微镜</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Neuroleucida</td><td>MBF Biosciences</td><td>NL-15</td><td>用于分析肠道纤维结构，非必需设备</td></tr><tr><td>Northern Eclipse</td><td>Empix Inc</td><td></td><td>成像软件</td></tr><tr><td>G-2E/C TRITC EX 528-553</td><td>Nikon Instruments</td><td>96312</td><td>特异性二抗滤光片</td></tr><tr><td>N.A. 0.75；W.D. 0.72 mm；DIC 棱镜：40xI，40x I-C；弹簧加载</td><td>Nikon Instruments</td><td>MRH00400</td><td>用于成像的物镜</td></tr><tr><td>Simple Neurite Tracer</td><td>NIH Image J</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://fiji.sc/Simple_Neurite_Tracer">http://fiji.sc/Simple_Neurite_Tracer&lt;/a&gt;</td></tr></tbody></table>

drosophila 幼虫摄食神经回路的功能分析

Functional Analysis of the Larval Feeding Circuit in Drosophila

利用黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）幼虫的5-羟色胺能摄食神经环路，可研究该神经环路发育过程中具有关键作用的神经基础。通过检测环路的功能性输出——摄食行为，可以观察到口咽系统神经结构的变化。摄食行为可通过观察口钩回缩频率进行记录，口钩由脑部神经支配。运动行为被用作摄食的生理对照，因为幼虫会使用口钩在琼脂基质上移动。摄食行为的变化可与支配肠道的神经纤维轴突结构变化相关联。利用免疫组织化学方法，可以对这些神经结构变化进行可视化和定量分析。在行为实验范式中若对幼虫操作不当，可能因幼虫对操作极为敏感而影响实验数据。准确成像支配肠道的神经纤维结构对于精确量化突触膨体的数量和大小，以及分支节点的延伸程度至关重要。大多数神经环路的研究仅能实现神经纤维结构或行为效应的单独观察；然而，该模型能够将环路的功能性输出与神经结构的损伤直接关联起来。

黑腹果蝇（Drosophila）幼虫中的5-羟色胺能摄食环路可作为观察特定因素对神经系统发育影响的极为有效的模型。通过量化摄食速率，可将摄食环路的轴突结构与其功能输出相联系（图1）。运动能力检测被用作口钩回缩行为的生理对照，因为幼虫利用口钩在琼脂表面移动。如果突变仅影响摄食环路，则对照组与突变基因型之间的运动反应应无差异8 （图2A）。若出现显著差异，则可能是由于操作不当影响了幼虫行为。若幼虫在检测过程中停止运动并试图钻入琼脂基质，说明其可能已过老，正处于向游走龄期过渡的阶段。也有可能是琼脂基质过硬，导致幼虫口钩难以抓附琼脂表面；此问题可通过润湿琼脂表面来解决。
该实验可用于评估具有神经元解剖缺陷的黑腹果蝇（Drosophila）品系是否影响血清素能摄食环路的发育。椭球体开放突变体（ebo3）在中央复合体的椭球体中存在结构缺陷。与野生型亲本品系Canton-S（CSwu）相比，这...

Drosophila melanogaster 幼虫的摄食环路是一个简单而有效的模型，可用于将摄食速率的变化与口胃神经环路的改变相关联。该环路由中枢的5-羟色胺能神经元组成，这些神经元向口钩以及前肠发出投射。

Drosophila 幼虫摄食神经回路的功能分析

黑腹果蝇幼虫的5-羟色胺能摄食环路可用于研究关键神经元底物在……期间的重要作用

本实验的总体目标是利用果蝇模型系统，将行为学输出与神经结构的变化相关联。首先建立成年果蝇的群体培养笼以收集幼虫，随后评估晚期二龄至早期三龄幼虫的运动能力。第三步是通过观察幼虫口钩的伸展和收缩来评估其摄食行为。最后一步是利用免疫组织化学技术解剖并制备晚期三龄幼虫的已证实的心室样本。最终，通过行为检测与免疫荧光显微镜的结合使用，结果可揭示发育过程中神经结构的异常如何与行为变化相关联。该技术的意义在于增进对神经结构发育的理解，从而有助于更深入地认识神经疾病的发展进程。本实验操作将由我实验室的一名研究生 prag bot 演示。将果蝇种群饲养于 25 °C、12 小时光照与 12 小时黑暗交替的环境中。只要对照组和实验组处于相同的光照条件下，该技术即可在标准实验室环境中进行。利用已建立的种群，通过让雌蝇在苹果汁琼脂板上过夜产卵来收集幼虫。每天早晨更换琼脂板，并在收集幼虫的琼脂板中央放置少量酵母。酵母会吸引孵化的幼虫，在25摄氏度下让卵发育24小时，第二天从酵母糊中收集一龄幼虫。使用金属刮刀将幼虫转移至新鲜的苹果汁或葡萄汁培养板上。可添加额外的酵母糊以滋养幼虫，直至进行实验以收集二龄和早期三龄幼虫；让一龄幼虫继续生长40至48小时。在此时间段内，摄食速率保持恒定以进行收集。将晚期三龄幼虫在瓶中培养。由于体壁胃系统中会积累代谢废物，将晚期三龄幼虫培养在果汁平板上可能对其造成伤害。幼虫的龄期可通过口钩形态来确认，因为该结构在不同龄期具有明显变化。每次蜕皮后，用清水轻轻且彻底地冲洗果汁培养板，收集晚期二龄和早期三龄幼虫，并转移至筛网过滤器中，随后进行行为学分析。将一只晚期二龄至早期三龄的幼虫放置于直径100毫米的组织培养皿中的2%琼脂培养基上，使其适应环境30秒，精确持续一分钟。使用计数器记录幼虫在基质上从后向前的每一次移动，对发生在动物体长四分之三以上的每一次收缩进行评分。当幼虫左右摆动但并未实际改变位置时，此类运动不予计分。偶尔，一次完整的从前向后的收缩会产生类似向前运动的向后移动。也需对倒退运动进行评分。每测试完最多10只动物后，更换检测培养板。每种实验条件至少进行20次记录。使用钝头不锈钢镊子，在摄食实验中对用于运动能力检测的每只幼虫进行评分。编号五，镊子。小心地将一只幼虫从运动能力检测琼脂平板转移至已覆盖五毫升均匀酵母溶液的琼脂平板中心。在酵母溶液中，幼虫将基本保持静止，其摄食行为与口钩收缩频率直接相关，口钩收缩表现为头部咽部骨化结构的伸展和回缩。让幼虫适应环境30秒，随后使用计数器记录一分钟内口钩收缩的次数。首先，将新配制的4%电子显微镜级甲醛PBS溶液加入三孔玻片中。然后，将一只自由爬行的三龄幼虫转移至含有PBS的解剖皿中。用一把镊子夹住幼虫后端，另一把镊子夹住口钩，同时保持后端固定不动。轻轻牵拉口钩以暴露肠道。去除与之相连的组织，如唾液腺、脑、脂肪体等。然后

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神经科学

在幼虫馈电电路的功能分析果蝇</i

同时记录黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）中已鉴定神经元的钙信号与摄食行为

Drosophila 幼虫的趋性关联性嗅觉学习

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微孔板喂食实验提供了一种经济、高通量的方法，用于定量果蝇（Drosophila）的液体食物摄入量。该方法使用一个3D打印装置，将饲养果蝇的96孔微孔板与另一个含有含示踪染料喂食溶液的1536孔微孔板连接。通过分光光度法测量溶液的体积减少量。...

一种用于定量摄食行为的高通量微孔板饲喂检测法 果蝇

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本方案介绍了一种高通量、低成本的方法，通过量化果蝇运动功能障碍来评估其神经毒性，作为传统哺乳动物模型的替代方案。该方法旨在利用一种灵敏、可重复且符合伦理要求的模型，评估药物化合物、环境因子或基因修饰的神经毒性效应。...

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