Name: 盲肠结扎穿孔致脓毒症作为模型小鼠中自噬研究 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-09T22:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 40 s
Description: 学习使用盲肠结扎穿孔法在小鼠中诱导脓毒症以研究自噬过程。该方法通过结扎并穿刺盲肠建立中重度腹膜炎模型，24小时后采集肺、肝、肾组织，利用电子显微镜观察自噬体形成，为研究感染期间组织应激反应提供可靠的实验方案。

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本工作获得了美国国立卫生研究院（NIH）基金 P01 HL108801、R01-HL60234、R01-HL55330、R01-HL079904 对 A. M. K. Choi 的资助。S. Ryter 获得了洛夫莱斯呼吸系统研究所的薪金支持。

注意：&#160; 布莱根妇女医院/哈佛医学院地区的机构动物护理和使用委员会已批准以下实验程序。
1. 盲肠结扎穿刺
使用相同遗传背景（C57Bl/6）的雄性小鼠，8-10周龄。雌性小鼠对脓毒症诱导的致死性抵抗力强于雄性。在盲肠结扎穿刺（CLP）后的生存率方面，8周龄以上小鼠的结果比年轻小鼠更稳定。每组比较组用于生存分析的小鼠数量应约为 N=10。自噬检测则 N=3-5 只小鼠即可满足要求。
<ol>
	<li>使用无菌的小型外科手术器械（即手术刀、剪刀和钝头解剖镊），应适用于啮齿类动物手术。</li>
	<li>制备麻醉混合液：向7.95 ml PBS中加入150 μl 赛拉嗪（AnaSed注射液）&#160;100 mg/ml）和 700 μl 氯胺酮（Ketaset）&#160;CIII，100 mg/ml</li>
	<li>为确保操作过程中无菌，需佩戴手套、口罩和手术服。</li>
	<li>称重动物。通过腹腔注射麻醉动物（i.p.）步骤3中提到的混合物，以μl为剂量&#160;（剂量为体重克数的10倍，单位为μl）。例如，对于体重为22 g的小鼠，给予10×22 = 220 μl麻醉混合液。因此，赛拉嗪和氯胺酮的最终剂量分别为17 mg/kg和80 mg/kg体重。确保麻醉充分；夹捏脚趾时不应引起肢体屈曲反应。 注意：使用眼科用&#160;涂抹眼膏以防止麻醉期间眼睛干燥。</li>
	<li>将动物仰卧放置于清洁的工作台面上，尾巴和后肢朝向操作者。使用酒精（70% EtOH 溶液）对腹部皮肤进行消毒。 注意： 手术区域应完全剃毛，以避免毛发接触导致伤口污染。&#160;此外，理想情况下，手术过程中应使用循环温水垫以维持麻醉小鼠的正常体温。</li>
	<li>使用解剖刀，在中线左侧约1厘米处，平行于中线做一小的纵行皮肤切口。切勿穿透至腹腔。用小剪刀将初始切口向两端延伸。</li>
	<li>识别腹肌并进行解剖以进入腹膜腔。</li>
	<li>使用钝性解剖镊识别盲肠，并将其移出腹腔。注意避免损伤肠系膜血管（以免引起致死性出血）。</li>
	<li>结扎盲肠的60%以建立中度脓毒症模型。结扎盲肠75%或以上通常导致重度脓毒症，而结扎25%或以下则导致轻度脓毒症。注意避免结扎回盲瓣，以免阻断肠道连续性。</li>
	<li>通过使用21&#160;用G号针在结扎处附近对盲肠进行一次贯穿穿刺（形成两个孔），穿刺方向应从盲肠的系膜侧至对系膜侧。注意避免穿刺到系膜血管。</li>
	<li>移除针头。轻轻挤压结扎的盲肠，以确认两个孔的通畅性；仅应有少量粪便从孔中挤出。</li>
	<li>将结扎并穿刺的盲肠移入腹腔。 注意： 对于假手术小鼠，跳过步骤 1.10–1.12。</li>
	<li>使用6-0带切割针的丝线缝合腹肌层。使用6-0带切割针的丝线缝合腹部皮肤。</li>
	<li>注射1 ml&#160;预热（37 °C）生理盐水 i.p. 以补充手术过程中流失的热量和水分。将小鼠置于加热灯下直至其恢复意识。&#160;注意： 理想情况下，可使用更安全的加热装置（如循环温水垫）替代加热灯。</li>
	<li>术后注射布托啡诺（0.05 mg/kg 体重） 皮下以实现镇痛效果。 注意： 动物在恢复足够的意识以维持胸卧姿势之前，不得无人看管。接受过外科手术的动物在完全康复之前，不得放回与其他动物共同饲养的环境中。</li>
	<li>将动物放回笼中，自由进食和饮水。当小鼠进入濒死状态（表现为被触碰时无法移动或出现发绀等临床症状）时实施安乐死。每4小时检查一次小鼠。&#160;以避免它们在实施安乐死之前死亡。</li>
</ol>
2. 组织采集与固定
<ol>
	<li>配制4%多聚甲醛（PFA）溶液：向889 ml磷酸盐缓冲液（PBS）中加入111 ml 37%多聚甲醛。</li>
	<li>使用高剂量CO2诱导麻醉或氯胺酮/赛拉嗪溶液处死小鼠。</li>
	<li>将小鼠固定于洁净的操作台面上，用70%乙醇（EtOH）溶液喷洒腹部和胸部皮肤进行消毒。</li>
	<li>使用手术刀和小剪刀去除腹部、胸部以及覆盖气管区域的皮肤。</li>
	<li>清除气管周围的组织（肌肉和结缔组织），暴露气管。</li>
	<li>在气管周围放置一根缝合线（不带切割针头），暂不收紧。</li>
	<li>使用小型外周静脉导管（20 G）进行“气管插管”。插入导管时需小心，避免气管撕裂。注意气管最大直径位于环状软骨下方。</li>
	<li>收紧气管及导管周围的缝合线，取出针头，仅将导管的塑料套管保留在气管内。针头仅作为引导钢丝用于插入塑料套管。</li>
	<li>确认塑料套管已牢固固定于气管后，剪开腹壁肌肉，打开腹腔，暴露膈肌。</li>
	<li>使用针头穿刺膈肌，造成气胸（i.e.&#160;向胸膜腔内注入空气），使肺组织塌陷。</li>
	<li>使用小剪刀切除膈肌，沿胸骨剪开（胸骨切开术），移除肋骨 cage，暴露心脏和肺脏。</li>
	<li>通过插入气管内的塑料套管，在30 cm H2O压力下用甲醛溶液灌注固定肺组织。</li>
	<li>取出肺组织，置于4% PFA溶液中固定24小时，随后转移至70%乙醇溶液中保存，直至后续处理。</li>
	<li>识别并取出心脏、肝脏和肾脏，同样置于4% PFA溶液中固定24小时，随后转移至70%乙醇溶液中保存，直至后续处理。</li>
</ol>
3. GFP 小鼠及 GFP 切片观察
<ol>
	<li>按照步骤1所述方法对GFP-LC3小鼠进行CLP及假手术，并按照方案中步骤2所述进行术后处理。</li>
	<li>将组织（即肺、心脏、肝和肾）包埋于石蜡中，并连续切片至5 μm厚度。</li>
	<li>准备进行GFP染色时，于60 °C孵育30–60分钟，直至石蜡完全融化且组织呈半透明状。</li>
	<li>使用标准梯度的二甲苯或二甲苯替代物进行脱蜡：依次在二甲苯1、二甲苯2和二甲苯3中各孵育5分钟，随后在梯度乙醇（EtOH）中分别孵育3分钟：100%、95%、75%，最后用蒸馏水冲洗。 
	注意：脱蜡后应避免组织干燥，以防样本背景信号增强。</li>
	<li>使用柠檬酸缓冲液（10 mM 柠檬酸钠，0.05% Tween 20，pH 6.0）进行抗原修复，微波处理10–20分钟。注意定期补充缓冲液，防止组织干燥。</li>
	<li>将溶液置于室温下冷却20分钟，以完成抗原修复过程。</li>
	<li>用PBS洗涤2–3次。去除多余缓冲液后，将载玻片从染色架转移至水平放置的染色盒或其他湿盒中，以防止干燥。</li>
	<li>在室温下用含10%正常驴血清（也可使用5%牛血清白蛋白，或优先选用与二抗同源动物的血清）的PBS封闭45–60分钟。</li>
	<li>在湿盒中，以PBS按1:100稀释GFP一抗，4 °C孵育过夜。轻轻覆盖小片Parafilm于组织表面，以促进抗体与组织均匀接触并防止蒸发。 
	注意：后续所有步骤均在室温下进行。</li>
	<li>用PBS洗涤5次以去除未结合的一抗。随后加入二抗（PBS中1:500–1:1,000稀释），室温孵育1–2小时。</li>
	<li>用PBS洗涤5次以去除未结合的二抗。如需，可在本步骤对切片进行复染。</li>
	<li>若使用荧光二抗，需用含0.1%苏丹黑的70%乙醇溶液孵育15–20分钟以降低自发荧光。擦去组织周围多余的苏丹黑，并在20分钟内用PBS洗涤5次。</li>
	<li>加盖玻片封片，并水平存放，直至封片剂完全固化。</li>
</ol>
4. 替代方案：GFP-LC3 的直接检测
<ol>
	<li>用约 500 ml 的 50/50 v/v OCT 与 PBS 混合液灌注并充胀肺组织。</li>
	<li>在冷冻模具底部加入少量 OCT，将组织包埋其中。</li>
	<li>小心地将解剖好的肺组织复合体放入模具中。</li>
	<li>将模具置于干冰预冷的甲基丁烷中缓慢冷冻。</li>
	<li>继续添加 OCT，直至组织完全覆盖并完全冻结。保持在干冰上，并储存于 -80 °C。</li>
	<li>使用冷冻切片机切取 5–10 μm 厚的切片，并避免切片暴露于光线下。将切片及剩余组织储存于 -80 °C。</li>
	<li>准备成像用载玻片时，从冰箱中取出切片，立即滴加一滴 PBS 以防止干燥。</li>
	<li>用 4% 多聚甲醛固定 30 分钟，随后用 PBS 洗涤。</li>
	<li>加入 DAPI/Hoescht 染色 10 分钟，用 PBS 洗涤 3 次&#160;。</li>
	<li>用盖玻片封片，水平放置储存，直至封片剂完全凝固。</li>
	<li>使用落射荧光显微镜或共聚焦显微镜进行成像。&#160;样品可在 4 °C 下保存长达一个月。</li>
</ol>
5. 透射电镜样品制备
<ol>
	<li>将组织切成约 1 mm 的立方体用于固定。</li>
	<li>用含 2% 甲醛和 2.5% 戊二醛的 0.1 M 马来酸钠缓冲液（pH 7.4）固定组织。</li>
	<li>用 0.1 M 马来酸钠缓冲液洗涤 1–2 小时。 
	注意：固定后的组织可在 0.1 M 马来酸钠缓冲液中于 4 °C 保存。</li>
	<li>在含 1% 四氧化锇的 0.2 M 马来酸钠缓冲液中后固定 1 小时。</li>
	<li>用 0.2 M 马来酸钠缓冲液漂洗，每次 10 分钟，共 3 次。</li>
	<li>用 70% 乙醇脱水，每次 20 分钟，重复 2 次；用 90% 乙醇脱水，每次 10 分钟，重复 2 次；用 100% 乙醇脱水，每次 20 分钟，重复 2 次。</li>
	<li>用环氧丙烷（propylene oxide）孵育，每次 10 分钟，重复 2 次。</li>
	<li>用环氧丙烷与环氧树脂混合液（50:50）孵育 1 小时。环氧树脂混合液组成为：24 g Agar 100 树脂、13 g 十二烯基琥珀酸酐、13 g 甲基纳迪克酸酐和 1 ml N-苄基二甲基胺。使用木制刮刀在一次性烧杯中充分混合。</li>
	<li>在未加盖的小瓶中用环氧树脂孵育过夜（以使残留的环氧丙烷挥发）。</li>
	<li>将组织包埋于标记好的胶囊中，使用新配制的树脂。在 60 °C 下聚合 48 小时。</li>
	<li>使用透射电子显微镜在 80 或 60 kV 下将组织切片成像至电镜底片上。将图像打印至相纸或以数字介质形式保存。</li>
	<li>在含有细胞核的完整细胞中分析自噬体形成情况。可使用低倍视野（e.g. 2,000–4,000X）识别有核细胞。通常使用 6,800–10,000X 的图像进行自噬体定量。从 15–30 个视野中统计单位面积内的自噬体数量，以获得适当的统计代表性。自噬体具有双层膜结构，晚期自噬体类似充满内容物的液泡。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明无竞争性财务利益

CLP 的主要优势在于允许研究人员研究不同严重程度的脓毒症即&#160;从低级到中级和高级）。诱导性脓毒症的严重程度受结扎盲肠长度（最重要的决定因素）、穿刺所用针头的大小以及穿刺孔数量的影响。15此外，小鼠品系和性别会影响脓毒症的严重程度；某些品系比其他品系更易感，且雄性通常比雌性更易感19,20上述因素&#160;综上所述&#160;确定CLP诱导的死亡率。
根据我们的经验，不同研究人员在实施 CLP 所致死亡率方面存在差异。例如，Rittirsch et al. 采用 50% 结扎、21 G 针、1 次“穿通”穿刺（两个孔）的方法，实现了 60% 的死亡率15；而我们研究组的一位研究人员需要采用稍更严重的模型（60% 结扎、21 G 针、1 次“穿通”穿刺）才能达到相同的死亡率；相比之下，我们研究组另一位研究人员使用更严重的模型（接近 100% 结扎、19 G 针、1 次“穿通”穿刺）却仅获得了较低的死亡率（仅为 25%）。鉴于上述情况，可以认为，CLP 严重程度（i....

脓毒症是一种由感染引发的全身性炎症反应，是危重患者死亡的主要原因之一1。腹腔内感染常导致多微生物性脓毒症，占所有脓毒症病例的20%，其病死率高达60%2。脓毒症相关死亡主要源于多器官功能障碍继而发展为器官衰竭3,4。迫切需要进一步研究该疾病的致病机制，以推动新型且更有效治疗方法的开发。
盲肠结扎穿刺（CLP）法是一种常用于建立脓毒症体内模型的实验方法。由于盲肠富含细菌，对其进行穿刺可导致多微生物性腹膜炎、细菌入血（菌血症）、感染性休克、多器官功能障碍，最终导致死亡5。目前普遍认为，与既往技术（如向啮齿类动物注射内毒素或纯化细菌）相比，CLP 更能准确反映临床实际情况。因此，CLP 被视为实验性诱导脓毒症并进而研究其发病机制的金标准（尽管该方法也存在局限性）6。在本专著中，我们描述了旨在评估脓毒症的致病机制是否涉及自噬的实验方案。
自噬是一种在进化上保守的细胞过程，可促进受损蛋白质和细胞器（如线粒体）的更新，并在清除包括细菌在内的细胞内病原体方面发挥重要作用7,8。在自噬过程中，细胞质中的蛋白质或细胞器被包裹进双层膜结构的囊泡（称为自噬体），随后被递送至溶酶体进行降解9。目前已鉴定出多种蛋白，它们是最初在酵母中发现的自噬相关基因（Atg）的哺乳动物同源物，可调控自噬过程。微管相关蛋白1轻链3B（LC3B，Atg8的同源物）从LC3B-I（游离形式）转化为LC3B-II（与磷脂酰乙醇胺共价结合的形式），是自噬体形成的关键步骤之一9。自噬功能障碍与衰老及多种人类疾病（如癌症和神经退行性疾病）相关10。此外，自噬还影响固有免疫和适应性免疫，例如抗原呈递、淋巴细胞发育以及免疫细胞的细胞因子分泌8。因此，自噬可能也在感染引发的全身性炎症反应（即&#160;脓毒症）中发挥作用，这一推测是合理的。
迄今为止，已有多种方法被用于评估自噬在组织损伤中的作用 体内包括使用表达绿色荧光蛋白（GFP）-LC3 的小鼠&#160;通过电子显微镜对组织中自噬体进行定量分析&#160;（这两种方法在本专著中有详细描述）。其他方法还包括组织匀浆中自噬相关蛋白表达的定量，以及自噬流的分析（详见其他文献）。11-13本文综述的目的是提供当前用于评估自噬的实验方案 体内 在实验性脓毒症的背景下。

<table><tbody><tr><td>GFP-LC3 转基因小鼠</td><td>Riken (日本)</td><td>RBRC00806</td><td>GFP-LC3#53</td></tr><tr><td>赛拉嗪</td><td>Henry-Schein</td><td>568-0606</td><td>盐酸赛拉嗪注射液（兽用）</td></tr><tr><td>氯胺酮</td><td>Henry-Schein</td><td>995-2949</td><td>凯他赛注射液 100 mg/ml</td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Fisher</td><td>A405-20</td><td>组织学级</td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Fisher</td><td>A407-1</td><td>用于消毒</td></tr><tr><td>6-0 丝线外科缝合线</td><td>Owens &amp; Minor</td><td>2300-0078OG, 017624</td><td></td></tr><tr><td>盐酸丁丙诺啡</td><td>Henry-Schein</td><td>614-5157</td><td>Buprenex 安瓿</td></tr><tr><td>多聚甲醛（37%）溶液</td><td>JT Baker</td><td>S898-09</td><td></td></tr><tr><td>二甲苯</td><td>Fisher</td><td>X3P-1GAL </td><td></td></tr><tr><td>抗 GFP 单克隆抗体</td><td>Life Technologies</td><td>G10362</td><td></td></tr><tr><td>霍伊歇特染料</td><td>Sigma</td><td>944403</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>OCT 包埋剂</td><td>VWR 科学</td><td>25608-930</td><td></td></tr><tr><td>苏丹黑</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-203760</td><td></td></tr><tr><td>电子显微镜级戊二醛（2.5% 溶于二甲胂酸钠缓冲液）</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15960</td><td></td></tr><tr><td>环氧丙烷</td><td>Sigma</td><td>240397</td><td></td></tr><tr><td>Agar 100 树脂</td><td>Agar Scientific</td><td>R1045</td><td></td></tr><tr><td>十二烯基琥珀酸酐</td><td>Sigma</td><td>46346</td><td></td></tr><tr><td>甲基内次甲基邻苯二甲酸酐</td><td>Sigma</td><td>45359</td><td></td></tr><tr><td>N-苄基二甲胺</td><td>Sigma</td><td>185582</td><td></td></tr></tbody></table>

盲肠结扎穿刺诱导脓毒症作为研究小鼠自噬的模型

Cecal Ligation and Puncture-induced Sepsis as a Model To Study Autophagy in Mice

可通过盲肠结扎穿刺（cecal ligation and puncture, CLP）法在小鼠中诱导实验性脓毒症，该方法可引发多微生物性脓毒症。本文提供了一种利用CLP技术在小鼠中诱导不同严重程度脓毒症的实验方案。自噬是组织应对应激和病原体侵袭的基本反应。目前有两种用于评估自噬的实验方案 体内 在实验性脓毒症背景下，本文还介绍了以下研究方法。（I）将表达绿色荧光蛋白（GFP）-LC3融合蛋白的转基因小鼠进行CLP处理。通过免疫组织化学或共聚焦显微镜检测，GFP信号（点状结构）的局部增强可用于检测自噬体形成的增加，从而反映自噬通路的激活状态改变。（II）利用透射电子显微镜可定量单位组织面积内自噬性空泡（自噬体）的形成数量（作为自噬激活的标志）。研究脓毒症中自噬反应对于理解组织应对感染的机制至关重要。该领域的研究成果最终可能有助于阐明脓毒症的发病机制，而脓毒症是重症医学中的一个重大难题。

在由CLP诱导的脓毒症发生后6小时，小鼠体内即可出现菌血症14。脓毒症的临床表现（包括寒战、呼吸急促和运动活动能力受损）大约在手术后12小时出现。接受CLP处理的小鼠通常在腹膜炎诱导后约18小时开始死亡。脓毒症越严重，死亡率越高15。具体而言，重度脓毒症在2至3天内导致100%的死亡率，而中度脓毒症在CLP术后7天时导致约60%的死亡率（超过此时间后不再预期有死亡）（图1）。相比之下，假手术小鼠的死亡率应为零
<img alt="生存分析图；脓毒症严重程度对CLP后生存率的影响；统计学比较。" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51066/51066fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51066/51066fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"><b...

可通过盲肠结扎穿刺（CLP）法在小鼠中诱导实验性脓毒症。目前评估自噬的方案 体内 在此介绍了在CLP诱导的脓毒症背景下使用的两种方法：一种是利用(GFP)-LC3小鼠检测自噬的方案，另一种是通过透射电子显微镜检测自噬体形成的方案。

可通过盲肠结扎穿刺（cecal ligation and puncture, CLP）法在小鼠中诱导实验性脓毒症，该方法可引发多微生物性脓毒症。本文介绍了一种实验方案……

本实验的总体目标是通过在小鼠中进行盲肠结扎与穿刺以诱导脓毒症，从而研究组织自噬——一种促进受损蛋白质和细胞器更新的稳态过程。该过程首先确定小鼠的盲肠位置，并将其从麻醉小鼠的腹腔中移出。在隔离后，结扎盲肠的60%，随后进行穿刺，以诱发中度腹膜炎。将结扎并穿刺的盲肠重新放回腹腔，让动物恢复。最后一步是在24小时后从脓毒症动物体内采集肺、肝和肾组织。最终，通过电子显微镜观察从脓毒症动物组织中获取的完整细胞内自噬体的形成情况。我们将介绍结扎回盲部或盲肠穿刺结扎术（CLP）作为一种诱导脓毒症并研究自噬的方法。与既往使用内毒素注射等方法相比，该技术的主要优势在于其临床相关性。CLP可导致腹膜炎，而腹膜炎是人类多微生物性脓毒症的明确病因之一。自噬是一种组织中普遍存在的应激反应，可由饥饿或细菌感染等条件激活。在自噬过程中，细胞质成分（包括蛋白质和细胞器）被包裹进双层膜结构的自噬体中，随后被运送至溶酶体进行降解。实验开始前，需准备操作区域，并摆放手术所需的无菌外科器械。麻醉给药后，通过脚趾夹捏反射确认动物是否进入镇静状态。准备就绪后，将动物置于洁净的操作台面上，并在眼睛表面涂抹眼膏。去除毛发后，使用碘伏和乙醇反复消毒手术区域。用手术刀在腹中线左侧约一厘米处，平行于腹中线做一小段纵向皮肤切口。注意不要刺入腹腔，用小剪刀小心延长初始切口。接下来，识别腹肌并切开以进入腹膜腔。使用镊子识别盲肠，并将其移出腹腔。注意不要损伤肠系膜血管，以免引起致命性出血。分离后，根据所需脓毒症程度对盲肠进行结扎。此处结扎60%以产生中度脓毒症。使用21号针头在结扎处附近的盲肠壁上穿孔，穿孔方向应从肠系膜侧至对侧肠系膜侧。接着，取出针头，轻轻挤压已结扎的盲肠，以确认两个孔道通畅。仅应有少量粪便从孔中挤出。将结扎并穿刺的肠段移入腹腔内，使用丝线外科缝合线缝合腹壁肌肉层和皮肤。注射温热的生理盐水后，将小鼠置于加热灯下直至其恢复意识。术后动物在返回饲养笼前给予镇痛剂，并可自由获取食物和水。安乐死后，将小鼠固定在洁净的工作台面上，用70%乙醇溶液消毒腹部和胸部皮肤。使用手术刀和小剪刀去除腹部和胸部的皮肤。接下来，通过分离周围肌肉和结缔组织来分离气管。分离后，在气管周围放置缝线但暂不收紧。使用小型外周静脉导管小心地进行气管插管。收紧缝线并移除缝针，保留套管原位。在分离心脏和肺组织后，通过气管使用该套管灌注固定液，直至肺组织充分固定。取出心脏和肺组织，并将其置于4% PFA中以进行后续处理。接下来，以相同方式移除肝脏和肾脏。用于电子显微镜检测的样品可用于分析完整细胞中自噬体的形成。从15到30个视野中计数单位面积内的自噬体，以获得适当的统计学代表性。自噬体具有双层膜结构，其中晚期自噬体类似于充满内容物的自噬泡（VAEs）。这些生存曲线显示了不同结扎尺寸后脓毒症的严重程度。60%结扎会导致中度脓毒症，约60%的个体在

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

盲肠结扎穿孔致脓毒症作为模型小鼠中自噬研究

盲肠结扎穿刺小鼠模型作为研究人类脓毒症的重要工具。...

盲肠结扎穿刺术

脓毒症是指由微生物感染引发的全身性炎症反应综合征，可通过一种称为盲肠结扎穿刺（CLP）的手术技术进行模拟。本文介绍了一种利用CLP诱导的动物模型筛选具有治疗作用的药用植物的方法。...

利用脓毒症动物模型评价新型草药疗法

为了抑制病原体扩散，宿主细胞会重组其细胞骨架以区隔细菌并诱导自噬。使用 志贺氏菌 组织培养细胞感染过程中，宿主与病原体的相关决定因子被鉴定并表征。利用斑马鱼模型 志贺氏菌 感染，对所发现的分子和机制的作用进行研究 体内.

使用 Shigella flexneri 研究自噬-细胞骨架相互作用

本文介绍了一种模拟肠道屏障受损后细菌来源化合物进入机体的实验方案。向小鼠全身注射低剂量的亚致死浓度脂多糖，并在注射后连续监测24小时。在多个时间点检测脾脏、肝脏和结肠中促炎性细胞因子的表达水平。...

向小鼠注射脂多糖以模拟肠道屏障受损后微生物来源产物的进入

本文介绍了一种在哺乳动物细胞中测量整体自噬捕获活性的简单且经过充分验证的实验方案。该方法基于定量分析可沉淀细胞组分中乳酸脱氢酶（LDH）所占的比例，并将其与细胞总LDH水平进行比较。...

乳酸脱氢酶封存检测——一种测定哺乳动物细胞大分子自噬封存活性的简单可靠方法

本方案描述了在免疫抑制状态下测量继发性医院获得性感染相关传染性结局的技术，首先通过建立盲肠结扎/穿刺小鼠模型，然后对其进行鼻内感染攻击，以构建具有临床相关性的免疫抑制脓毒症模型。...

脓毒症诱导免疫抑制的盲肠结扎穿刺联合鼻内感染双模型设计

本方案介绍了在脓毒症小鼠模型中进行盲肠结扎穿刺（CLP）的操作细节。CLP是建立脓毒症动物模型最常用的实验技术之一。因此，为获得可靠的研究结果，需要采用标准化的CLP操作流程。...

脓毒症小鼠盲肠结扎穿刺模型中可靠生物标志物的评估

本方案描述了在小鼠模型系统中诱导革兰氏阴性单菌性败血症的方法。该模型可用于研究败血症期间的炎症反应及致死性宿主反应。...

表征 沙门氏菌 小鼠中由伤寒沙门菌诱导的败血性腹膜炎

该小鼠模型结合了脓毒症损伤与后肢肌肉失用，以模拟典型脓毒症患者长期卧床的特征。此模型显著区别于以往研究脓毒症中肌肉功能障碍的模型，是一种可重复用于探索治疗策略以应对该病症的方法。...

小鼠脓毒症诱导性失用性肌病的临床前模型

在此，我们介绍一种通过鼻内滴注建立小鼠脓毒症免疫抑制模型的实验方案 肺炎克雷伯菌...

通过鼻内滴注细菌建立小鼠脓毒症诱导的免疫抑制模型

学习使用盲肠结扎穿孔法在小鼠中诱导脓毒症以研究自噬过程。该方法通过结扎并穿刺盲肠建立中重度腹膜炎模型，24小时后采集肺、肝、肾组织，利用电子显微镜观察自噬体形成，为研究感染期间组织应激反应提供可靠的实验方案。

盲肠结扎穿刺诱导脓毒症作为研究小鼠自噬的模型

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