Name: 使用一个调查益生素对肺炎球菌定植的影响体外粘附试验 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-28T13:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: 了解如何使用体外粘附试验评估唾液链球菌对肺炎链球菌的抑制作用。该方法利用CCL-23上皮细胞单层模型，为研究益生菌预防肺炎球菌定植的机制提供了可靠的实验手段。

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本工作由墨尔本儿童研究所和维多利亚州政府运营基础设施支持计划资助。

1. 上皮细胞与细菌细胞的制备
<ol>
	<li>CCL-23 上皮细胞的复苏
	<ol>
		<li>将含有 10% 胎牛血清（FBS）的最低必需培养基（MEM）在 37 °C 水浴中预热约 30 分钟。</li>
		<li>使用前，用紫外灯对经组织培养认证的生物安全柜灭菌至少 10 分钟，并用 70% 乙醇擦拭工作区域。用 70% 乙醇擦拭预热的培养基瓶外表面，并放入生物安全柜中。</li>
		<li>使用 25 ml 移液管将 14 ml 培养基转移至 T-75 培养瓶中。将培养瓶置于 37 °C 培养箱中，同时进行细胞复苏（见步骤 1.1.4）。</li>
		<li>按照适当的安全防护措施，从液氮储存中取出一支 CCL-23 细胞冻存管，在 37 °C 水浴中温育至约 80% 融化。</li>
		<li>将步骤 1.1.3 中准备好的培养瓶放回生物安全柜。用 70% 乙醇擦拭 CCL-23 细胞冻存管外表面，使用 P1000 移液枪将内容物（1 ml）转移至 T-75 培养瓶中。</li>
		<li>将培养瓶侧放，于 37 °C、5% CO2、95% 相对湿度的组织培养孵箱中过夜培养（16–20 小时）。</li>
		<li>在显微镜下检查细胞，确认细胞形态健康后，吸除旧培养基，更换为 15 ml 新鲜预热的 MEM + 10% FBS。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>CCL-23 上皮细胞的维持培养
	<ol>
		<li>当细胞融合度达到约 80%（1–2 天）时，使用 25 ml 移液管吸除培养基，并用 10 ml 移液管轻轻用 8–10 ml 预热的磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞两次。</li>
		<li>吸除 PBS，加入 1 ml 无菌的 0.25% 胰蛋白酶-EDTA（0.25% (w/v) 胰蛋白酶，0.1 mM EDTA）。将培养瓶侧放并轻轻旋转，确保胰蛋白酶覆盖细胞单层，然后在 37 °C、5% CO2 培养箱中孵育 2–3 分钟。</li>
		<li>将培养瓶放回生物安全柜，加入 9 ml 预热的 MEM + 10% FBS，上下吹打 6–8 次以重悬细胞，吹打时将液体沿瓶壁冲下以帮助细胞脱落。</li>
		<li>按 1:15（1 ml 细胞悬液 + 14 ml MEM + 10% FBS）或 1:30（0.5 ml 细胞悬液 + 14.5 ml MEM + 10% FBS）比例传代，弃去多余细胞，将培养瓶放回 37 °C、5% CO2 培养箱。</li>
		<li>在用于黏附实验前，至少传代两次。通常每 3–4 天传代一次。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>CCL-23 上皮细胞的接种（黏附实验前一天进行，方案&#160;2）
	<ol>
		<li>按照步骤&#160;1.2.1–1.2.3 所述方法对融合细胞进行传代，用预热的 MEM + 5% FBS 重悬细胞（降低 FBS 浓度以减少血清成分对实验的干扰）。取 20 μl 细胞悬液，使用台盼蓝染色和血细胞计数板进行细胞计数。</li>
		<li>在无菌 50 ml 管中，用预热的 MEM + 5% FBS 将细胞稀释至 1.5 × 105 个细胞/ml。</li>
		<li>在经组织培养处理的 24 孔板中，每孔接种 1 ml 细胞悬液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细菌的制备 
	本操作步骤适用于肺炎链球菌和S. salivarius的制备。细菌培养基通常在 37 °C 培养箱中过夜预热并检测无菌性（若被污染，培养基通常会变浑浊）。
	<ol>
		<li>在黏附实验前两天，将细菌划线接种于马血琼脂（HBA）平板上，在 35–37 °C、5% CO2 条件下培养 18–24 小时。可使用羊血琼脂作为替代。</li>
		<li>次日，为每种细菌制备过夜培养物：向无菌 30 ml 管中加入 10 ml 含 0.5% 酵母提取物的 Todd-Hewitt 肉汤（THB+YE）。使用 10 μl 接种环，接种约 10–12 个分离良好的菌落。短暂涡旋混匀后，在 35–37 °C、5% CO2 条件下培养 14–16 小时。注意：肺炎链球菌在液体培养基中培养过久会发生自溶。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 黏附实验：将细菌加入上皮细胞单层
<ol>
	<li>肺炎链球菌对数中期细菌培养物的制备 S. salivarius
	<ol>
		<li>将10 ml预热的THB+YE移液至两个无菌30 ml试管中，每管各一，分别标记为pneumococci和另一管 S. salivarius.</li>
		<li>为达到对数中期，肺炎链球菌需要约3小时 S. salivarius 需要约2小时的孵育（参见 图1）。同时开始两种培养物。涡旋振荡（3-5 秒）过夜培养的细菌培养物，加入 100 μl 肺炎链球菌和 100 μl S. salivarius 转移到相应的试管中。</li>
		<li>短暂涡旋混匀，并在37 °C下孵育培养物约2小时 S. salivarius 肺炎球菌为3小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>CCL-23 细胞的黏附实验制备
	<ol>
		<li>使用倒置显微镜检查24孔板，观察是否形成融合的单层细胞以及细胞形态是否健康。单层细胞应 &#62;80% 汇合度，无细胞聚团或细胞病变效应（如细胞变圆或贴壁能力丧失）迹象（参见 图2).</li>
		<li>使用移液管吸取各孔中的培养基，倾斜培养板以避免扰动细胞单层。</li>
		<li>轻轻洗涤细胞，使用移液管向每个孔中加入约 500 μl 预热的 PBS，然后倾斜培养板，用移液器吸头吸去 PBS。弃去 PBS。重复洗涤一次。</li>
		<li>向每个孔中加入500 μl预热的MEM + 5% FBS。将24孔板放回CO2 孵育细菌培养物时。 
		注意：为了确定用于感染复数（MOI）的准确 CCL-23 细胞数量，可在感染当天对两个孔的细胞进行胰酶消化并计数。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 黏附实验
<ol>
	<li>以约 10:1 的 MOI 将肺炎链球菌加入 CCL-23 细胞中。在重复孔中测试表 1 中列出的条件。
	<ol>
		<li>测定 1 ml S. salivarius 培养物在 A600 处的光密度（OD），OD 值应在 0.3–0.6 之间。</li>
		<li>将 5 ml S. salivarius 培养物转移至 10 ml 离心管中，在 1,870 × g 条件下离心 4 分钟。</li>
		<li>弃去上清液，根据第 3.1.1 节中的 OD 读数，用 200–1,000 μl 的 0.85% NaCl 重悬 S. salivarius（终浓度约为 1.5 × 109 CFU/ml）。作为一般指导原则，OD 为 0.375 时应重悬于 260 μl 中。使用 0.85% NaCl 制备 S. salivarius 的 1:10 和 1:100 稀释液。 
		注：本实验中将测试三种浓度（代表高、中、低剂量）的 S. salivarius。高剂量为约 10 S. salivarius : 1 肺炎链球菌，中剂量为约 1 S. salivarius : 1 肺炎链球菌，低剂量为约 1 S. salivarius : 10 肺炎链球菌。</li>
		<li>从培养箱中取出 24 孔板。</li>
		<li>从肝素对照孔中移除 40 μl 培养基，并加入 50 μl 肝素（1,000 U/ml 储液），使终浓度为 100 U/ml。</li>
		<li>向仅含 CCL-23 细胞的孔以及含 CCL-23 细胞和肺炎链球菌（不含 S. salivarius）的孔中各加入 10 μl 0.85% NaCl。</li>
		<li>向相应孔中分别加入 10 μl 未稀释、1:10 和 1:100 稀释的 S. salivarius。 
		注：S. salivarius 也可与肺炎链球菌同时加入（共加）或在肺炎链球菌加入后 1 小时加入（后加），以考察益生菌给药时间的影响。</li>
		<li>将 24 孔板在 114 × g 条件下离心 3 分钟，以促进细菌与细胞层的接触，随后在 37°C、5% CO2 条件下孵育 1 小时。</li>
		<li>用 0.85% NaCl 对 S. salivarius 原液进行系列稀释，并在重复的 HBA 平板上涂布以进行活菌计数。首先将 50 μl 原液加入 450 μl 0.85% NaCl 中制成 10-1 稀释液，然后短暂涡旋（5 秒），更换枪头，再取 50 μl 10-1 稀释液加入 450 μl 0.85% NaCl 中制成 10-2 稀释液，依此类推至 10-7。</li>
		<li>取 10-5、10-6 和 10-7 稀释液各 100 μl，分别涂布于重复的 HBA 平板上，用无菌涂布棒涂匀。将 HBA 平板倒置于 37°C、5% CO2 条件下过夜培养。</li>
		<li>在 1 小时孵育接近结束时，重复第 3.1.1–3.1.3 节操作处理肺炎链球菌。OD 值应在 0.2–0.7 之间。离心 1 ml 肺炎链球菌培养物，根据 OD 读数将菌体沉淀重悬于 300–2,000 μl 0.85% NaCl 中，使其浓度约为 1.5 × 108 CFU/ml。作为一般指导原则，OD 为 0.3 时应重悬于 500 μl 中。</li>
		<li>与 S. salivarius 共孵育 1 小时后，向除阴性对照孔（仅含细胞）外的所有孔中加入 10 μl 未稀释的肺炎链球菌。</li>
		<li>将 24 孔板在 114 × g 条件下离心 3 分钟，随后在 37°C、5% CO2 条件下孵育 3 小时。按照第&#160;3.1.9 节所述方法，用 0.85% NaCl 对肺炎链球菌原液进行系列稀释，并将 10-4、10-5 和 10-6 稀释液涂布于重复的 HBA 平板上进行活菌计数。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>3 小时后，在显微镜下检查细胞，确保单层细胞状态良好（见图 2）。吸去各孔中的培养基，按照第 2.2.3 节所述方法，使用不同的移液器对细胞进行 3 次&#160;轻柔洗涤。此步骤至关重要，用于去除未黏附的肺炎链球菌。洗涤过程中单层细胞不应脱落，可通过显微镜再次观察确认。</li>
</ol>
注意：此步骤中移除的培养基可保存于 -20 °C，用于后续分析（例如 细胞因子水平的测定）。
<ol>
	<li>向每个孔中加入 200 μl 的 0.1% 纤维素（一种温和的去污剂），在 37 °C、5% CO2 条件下孵育 7 分钟。</li>
	<li>向每个孔中加入 800 μl THB 培养基。通过移液器上下吹打裂解细胞，如有必要，用移液器吸头刮擦孔壁 3–4 次，以确保完全去除细胞单层。每孔之间更换吸头。&#160;</li>
	<li>使用 P1000 移液器将各孔中的内容物移出，并转移至已标记的微量离心管中。</li>
</ol>
4. 肺炎链球菌黏附的定量分析
可通过测定活菌数（连续稀释后在血琼脂平板上培养）或通过定量实时 PCR 来定量黏附的肺炎球菌。
<ol>
	<li>活菌计数法 
	该方法必须在黏附实验第3.5步完成后立即进行。
	<ol>
		<li>对于每个检测孔，将黏附实验第3.5步中收集的样品用0.85% NaCl进行系列稀释：取50 μl样品加入450 μl 0.85% NaCl中，短暂涡旋混匀，并按照第3.1.9节所述方法继续进行系列稀释，直至10-6 稀释度。</li>
		<li>将10-3、10-4、10-5和 10-6 稀释度的样品各取100 μl，分别涂布于血琼脂平板上（每个稀释度设两个重复），使用无菌涂布棒涂匀，倒置平板后于37 °C、5% CO2条件下过夜培养。注意：仅含CCL-23细胞的孔中不应含有任何细菌，可作为无菌对照直接涂布未稀释样品（100 μl原液）。</li>
		<li>次日，通过计数黏附实验第3.1.13节制备的适当稀释度平板上的菌落（应含有30–300个菌落）来确定肺炎链球菌接种量。根据两个重复平板的平均值计算接种物的CFU/ml。同样地，通过计数第3.1.10节制备的平板上的菌落来确定S. salivarius接种量。 
		注意：平板上应仅存在肺炎链球菌；若出现其他菌种，表明实验受到污染，结果无效。</li>
		<li>为测定肺炎链球菌的黏附水平，对第4.1.1节中制备的各样品的适当稀释度平板（含30–300个肺炎链球菌菌落）进行菌落计数。注意：S. salivarius菌落较小且呈白色，而肺炎链球菌因α-溶血表现为扁平、灰绿色菌落，如图3所示。计算肺炎链球菌黏附率时，将b条件（CCL-23细胞 + 肺炎链球菌）下的黏附菌数归一化为100%，并将其他条件下的黏附菌数与此条件进行比较。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>qPCR法 
	黏附实验第3.5步中收集的样品可在-20 °C保存，直至进行DNA提取。DNA提取使用商业试剂盒，操作详见第4.2.1–4.2.9节，qPCR检测详见第4.2.10–4.2.20节。
	<ol>
		<li>配制酶解裂解缓冲液（含50 mM磷酸盐缓冲液pH 6.7、1 mg/ml溶菌酶、0.075 mg/ml自溶素和2 mg/ml蛋白酶K）。以下配方可用于配制10 ml（足够50次提取使用）。酶解裂解缓冲液应在使用前新鲜配制。 
		 
		50 mM磷酸盐缓冲液（pH 6.7）7.25 ml 
		10 mg/ml溶菌酶母液1.00 ml（终浓度[1 mg/ml]） 
		1 mg/ml自溶素母液0.75 ml（终浓度[0.075 mg/ml]） 
		20 mg/ml蛋白酶K母液1.00 ml（终浓度[2 mg/ml]） 
		&#160;</li>
		<li>将样品置于冰上或4 °C解冻。涡旋混匀后，将每份样品取100 μl分装至已标记的微量离心管中。将原始样品放回-20 °C冰箱保存。</li>
		<li>以6,700 × g离心10分钟。</li>
		<li>弃去上清液。向沉淀中加入200 μl酶解裂解缓冲液，涡旋重悬。于56 °C孵育30分钟。短暂离心（5秒，6,700 × g）使液体沉至管底。</li>
		<li>加入10 μl 20% SDS以完成细胞裂解，室温下轻柔混匀2分钟。</li>
		<li>加入4 μl RNase A（100 mg/ml母液），室温下轻柔混匀（可通过摇床或翻转试管）2分钟。</li>
		<li>加入200 μl缓冲液AL（来自试剂盒），涡旋15秒。将样品于70 °C孵育10分钟。短暂离心（5秒，6,700 × g）使液体沉至管底。</li>
		<li>加入200 μl 100%乙醇，涡旋15秒。短暂离心使液体沉至管底，然后将混合物（包括任何沉淀物）转移至离心柱（置于2 ml收集管中），注意不要润湿柱边缘。后续洗涤步骤按照试剂盒说明书进行（此处未显示）。</li>
		<li>为洗脱DNA，将离心柱转移至已标记的微量离心管中，加入50 μl缓冲液AE（来自试剂盒），室温孵育2分钟。以4,300 × g离心1分钟。重复一次，最终洗脱体积为100 μl。DNA可于-20 °C保存至后续使用。</li>
		<li>进行qPCR前，建议先用紫外灯对操作台灭菌15分钟。建议预先准备96孔板布局工作表，用于记录各样品在板中的位置。</li>
		<li>使用10 ng/μl的肺炎链球菌基因组DNA母液（从参考菌株ATCC 6305提取）制备标准曲线。
		<ol>
			<li>解冻肺炎链球菌DNA母液，在台式离心机中短暂离心（5秒）。</li>
			<li>在6个预先标记的微量离心管中进行1:10系列稀释：将3 μl DNA加入27 μl无核酸酶水（nuclease-free H2O）中，每次稀释均更换枪头并涡旋混匀。最终得到6个稀释度：1、0.1、0.01、0.001、0.0001和0.00001 ng/μl。 
			注意：标准品可在4 °C保存最多一周。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>在无菌PCR操作台内的无菌15 ml锥形管中配制lytA主混合液（mastermix）。各组分需在冰上解冻，并在使用前立即涡旋混匀。
		<table border="0">
			<tbody>
				<tr>
					<td>组分</td>
					<td>每反应</td>
					<td>×102（整板）</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>lytA F</td>
					<td>0.25 μl（10 μM母液）</td>
					<td>25.5 μl</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>lytA R</td>
					<td>0.25 μl（10 μM母液）</td>
					<td>25.5 μl</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>lytA 探针</td>
					<td>0.5 μl（10 μM母液）</td>
					<td>51 μl</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>H2O</td>
					<td>9.5 μl</td>
					<td>969 μl</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>主混合液</td>
					<td>12.5 μl</td>
					<td>1,275 μl</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>终体积</td>
					<td>23 μl</td>
					<td>2,346 μl</td>
				</tr>
			</tbody>
		</table>
		注意：某些实时PCR仪器需要使用参比染料，该染料可能已包含在某些商业主混合液中，或需单独添加。本方案设计用于在96孔板中进行25 μl反应体系，但可根据不同实时PCR仪器进行调整。引物和探针序列最初由Carvalho et al.15发表，详见材料清单。</li>
		<li>涡旋混匀后，将23 μl/lytA混合液加入相应孔中。请参照板图。</li>
		<li>将PCR板转移至模板加样区域（建议为独立房间内的无菌操作柜）进行样品加载。</li>
		<li>使用P2移液器加样，每孔更换枪头。所有样品均设两个重复。请参照板图确定位置。</li>
		<li>对于标准曲线孔，每孔加入1 μl相应稀释度的标准品DNA和1 μl H2O，使终体积为25 μl。对于无模板对照孔，每孔加入2 μl H2O。</li>
		<li>向相应孔中每孔加入2 μl样品DNA。</li>
		<li>盖紧所有使用孔的封板膜，确保密封严密。在将PCR板放入实时PCR仪前，快速离心（5秒）。</li>
		<li>将PCR板放入仪器中，按照仪器制造商提供的说明运行qPCR程序。推荐使用以下水解探针扩增循环条件：
		<table>
			<tbody>
				<tr>
					<td>步骤1（1个循环）：</td>
					<td>95 °C下3分钟</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>步骤2（40个循环）：</td>
					<td>95 °C下20秒</td>
				</tr>
				<tr>
					<td></td>
					<td>60 °C下20秒</td>
				</tr>
			</tbody>
		</table>
		</li>
		<li>收集数据，并利用标准曲线定量肺炎链球菌DNA。细菌载量按先前方法17计算，估计1 pg基因组DNA相当于447.4个细胞，并以CFU/ml表示（假设每个CFU含一个基因组，每个基因组含一个lytA拷贝；见图4）。成功的实验应满足R2值≥0.98，所有阳性结果均应在标准曲线范围内（cT值高于0.00001 ng/μl标准点的结果视为背景/lytA阴性）。 
		注意：某些实时PCR系统配备分析软件，可用于构建标准曲线并计算未知样本浓度。否则，可在Excel或类似程序中完成计算。示例标准曲线见图4。</li>
		<li>计算肺炎链球菌黏附率时，将b条件（CCL-23细胞 + 肺炎链球菌）下的黏附菌数归一化为100%，并将其他条件下的黏附菌数与此条件进行比较。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

该实验的关键步骤是在第 3.1.7 和 3.1.12 节中加入适当浓度的 S. salivarius 和肺炎链球菌。浓度通过 OD 读数进行估算，但确切的接种量需等到次日平板计数后才能确定。因此，我们建议对实验中使用的所有菌株进行生长曲线测定，以测量 OD 值和活菌数（CFU/ml）随时间的变化，从而确定对数中期，并辅助通过 OD 值估算浓度。此外，不同肺炎链球菌菌株在黏附特性上可能存在显著差异。建议选用黏附能力较强的菌株（在 3 小时孵育后，超过 &#62;10% 的接种菌黏附于上皮细胞）用于研究益生菌抑制肺炎链球菌黏附能力的实验。即使由经验丰富的操作人员完成，不同实验之间的黏附水平仍可能存在差异，这一点从图 5中相对较大的误差条即可看出。因此，我们建议每个实验至少重复三次，每种实验条件设两个复孔。在使用大肠杆菌（Escherichia coli）进行的黏附实验中也已有类似变异性的报道18。本方案中，在加入肺炎链球菌后，细胞孵育时间为 3 小时。若进行黏附时间进程实验并发现大部分细菌在孵育第一小时内即已完成黏附，则可缩短孵育时间。
<p...

Streptococcus pneumoniae（肺炎链球菌）是一种革兰氏阳性细菌，可引起肺炎、中耳炎和脑膜炎等感染。在低收入国家，它是儿童疾病的主要病因，每年估计导致约80万名五岁以下儿童死亡1。肺炎链球菌常在幼儿的鼻咽部定植。尽管这种定植通常被认为是无症状的，但它先于肺炎链球菌感染的发生，并在人群中作为细菌的储存库2。肺炎链球菌结合疫苗可有效减少疫苗所含血清型的定植。然而，目前已知的肺炎链球菌血清型有90多种，接种疫苗可能导致血清型替代现象，即疫苗血清型被清除后，非疫苗血清型的定植率和致病率随之上升3。此外，在某些高风险人群中，肺炎链球菌的定植往往发生在生命早期，早于第一剂疫苗的接种时间4,5。近年来，益生菌的使用被提出作为抑制肺炎链球菌定植的另一种策略6,7。体外黏附实验已被用于研究肺炎链球菌的黏附能力8,9。这些实验方法已被改进，用于探究益生菌Lactobacillus rhamnosus GG（LGG）对肺炎链球菌黏附的影响10。
除了LGG和其他乳酸菌之外， Streptococcus salivarius一种常见的口腔定植菌，因其定植潜力以及抑制肺炎链球菌和其他呼吸道病原体的能力，已被研究作为呼吸道潜在的益生菌 体外11-13. 本文所述方案是一种用于研究黏附作用影响的黏附实验 S. salivarius K12 对肺炎链球菌黏附人上皮细胞系 CCL-23 的影响。在用于实验前，需对肺炎链球菌分离株的黏附能力进行评估，因为不同分离株在生长特性和黏附特性方面可能存在显著差异。10,14肺炎球菌的生长曲线及 S. salivarius 通过光密度（OD，测定对数中期并估算浓度（菌落形成单位或CFU/ml） 图1).&#160;建议在使用每种分离株进行检测前，通过活菌计数和光密度（OD）检测其生长情况。本实验可在具备标准组织培养设施和设备的任何实验室中进行。在本方案中，研究了三种剂量的 S. salivarius 在加入肺炎链球菌前1小时给药对黏附性的影响 S. pneumoniae PMP843 是一种血清型 19F 携带分离株，来源于鼻咽拭子，对其进行检测。本文介绍了两种定量黏附性肺炎链球菌的方法：在血琼脂平板上接种以测定活菌数，以及提取 DNA 并检测肺炎链球菌的 lytA 通过qPCR检测基因15基础黏附实验方案可轻松修改，以检测不同剂量或给定时间的益生菌作用，也可用于其他细菌菌株或物种。

<table><tbody><tr><td>最低必需培养基（MEM）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SH30244.01</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SH30084.03</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>T-75 培养瓶</td><td>Nunc</td><td>156472</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>CCL-23 细胞</td><td>ATCC</td><td>CCL-23</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>胰蛋白酶（Trypsin）</td><td>Life Technologies</td><td>15090046</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>24 孔细胞培养板</td><td>Nunc</td><td>142475</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>马血琼脂（HBA）平板</td><td>Oxoid</td><td>PP2001</td><td>羊血琼脂平板也可接受</td></tr><tr><td>托德-休伊特肉汤（Todd-Hewitt Broth）</td><td>Oxoid</td><td>CM0189</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>酵母提取物</td><td>Beckton Dickinson</td><td>212750</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>皂苷（Digitonin）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D141-100MG</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>一次性比色皿</td><td>Kartell</td><td>1938</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>肝素（Heparin）</td><td>Pfizer</td><td>2112105</td><td>以无菌安瓿包装，每 5 mL 含 5,000 IU/&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>无菌涂布棒</td><td>Technoplas</td><td>S10805050</td><td>也可使用玻璃涂布棒，每次使用前浸入 96% 乙醇并火焰灭菌</td></tr><tr><td>溶菌酶（Lysozyme）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6876</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>突变溶素（Mutanolysin）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9901</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>蛋白酶 K（Proteinase K）</td><td>Qiagen</td><td>19133</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>20% SDS 溶液</td><td>Ambion</td><td>AM9820</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>RNase A</td><td>Qiagen</td><td>19101</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>QIAamp DNA mini-kit (250)</td><td>Qiagen</td><td>51306</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>LytA F 引物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>定制合成</td><td>5' -&gt; 3' 序列 ACGCAATCTAGCAGATGAAGCA</td></tr><tr><td>LytA R 引物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>定制合成</td><td>5' -&gt; 3' 序列&amp;nbsp; TCGTGCGTTTTAATTCCAGCT</td></tr><tr><td>LytA 探针</td><td>Eurogentec</td><td>定制合成</td><td>5' -&gt; 3' 序列 Cy5-TGCCGAAAACGCTTGATACAGGGAG-BHQ3，可使用其他荧光染料</td></tr><tr><td>无核酸酶水</td><td>Ambion</td><td>AM9906</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Brilliant III Ultra Fast QPCR 预混液</td><td>Agilent Technologies</td><td>600880</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Thermo-Fast 96 检测板&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AB-1100</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Ultraclear qPCR 封板条</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AB-0866</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Mx3005 QPCR 系统</td><td>Agilent Technologies</td><td>401449</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>*所列大多数/全部产品均有其他可选来源</td><td></td><td></td><td>&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

研究益生菌对肺炎球菌定植影响的实验方法 体外 黏附实验

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae，又称肺炎球菌）黏附于鼻咽部上皮衬里可导致定植，并被认为是引发肺炎和中耳炎等肺炎球菌感染的前提条件。体外黏附实验可用于研究肺炎球菌对上皮细胞单层的黏附作用，并可用于探索潜在干预措施（例如使用益生菌）以抑制肺炎球菌&#160;定植。&#160;本文所述方案用于研究益生菌唾液链球菌（Streptococcus salivarius）对肺炎球菌黏附人上皮细胞系CCL-23（有时称为HEp-2细胞）的影响。该实验包括三个主要步骤：1）上皮细胞和细菌的制备；2）将细菌加入上皮细胞单层；3）通过活菌计数（连续稀释和平板接种）或定量实时PCR（qPCR）检测黏附的肺炎球菌。该技术相对简单，除细胞培养设备外无需特殊仪器。该实验可用于测试其他益生菌种类和/或潜在的肺炎球菌定植抑制剂，并可轻松修改以探讨有关肺炎球菌黏附与侵袭的其他科学问题。

来自一个代表性实验的结果，其中肺炎链球菌（pneumococci）S. pneumoniae PMP843（一种定植性19F分离株）在加入CCL-23细胞1小时后被添加至其中 S. salivarius，通过活菌计数和 lytA qPCR 结果如图所示 表2结果在两种方法之间具有一致性，包括细菌的绝对数量（以CFU/ml表示）和黏附率（% adherence），后者以仅含肺炎链球菌孔中的黏附肺炎链球菌数量为基准进行归一化。肝素作为对照使用，因其已知可抑制肺炎链球菌的黏附，因此在肺炎链球菌 + 肝素条件下黏附减少（通常） &lt;与单独的肺炎球菌相比降低40%表明实验成功。 S. salivarius 以剂量依赖的方式抑制肺炎链球菌的黏附，如所示 表2，其中高浓度的 S. salivarius （约10） S. salivarius 1 型肺炎链球菌）导致最低的肺炎链球菌黏附。
图5</stro...

体外黏附实验可用于研究肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）对上皮细胞单层的黏附作用，并可用于探索潜在的干预措施，例如使用益生菌抑制肺炎链球菌的定植。

肺炎链球菌（肺炎球菌）对鼻咽部上皮衬里的黏附可导致定植，被认为是……

本实验的总体目标是评估益生菌链球菌细胞勒瓦里乌斯（streptococcus cell levarius）抑制肺炎球菌黏附于上皮细胞系的能力。首先制备CCL-23上皮细胞单层，随后在24孔板中依次将勒瓦里乌斯（slovar）和肺炎球菌加入细胞单层，并进行孵育。最后一步中，清洗孔板以去除未黏附的细菌。裂解 CCL 23 上皮细胞并收集孔板内容物。最终，通过定量与细胞相关的肺炎链球菌数量，可评估唾液链球菌对肺炎链球菌黏附的影响。该方法有助于回答传染病领域的一些关键问题，例如益生菌是否能够抑制肺炎链球菌等细菌病原体的黏附。当我们开始研究乳杆菌属的嗜酸乳杆菌、GG 菌株及其他益生菌在呼吸道中的潜在应用时，首次提出了这一方法。本实验的演示将由本实验室的博士生简·曼宁（Jane Manning）和 Zen 完成。在实验前一天，将培养至融合状态的 CCL-23 上皮细胞进行传代，并用预热的培养基稀释至每毫升 150,000 个细胞的浓度，置于无菌的 50 毫升离心管中。接下来，将每种细胞各1毫升接种到经处理的24孔组织培养板的每个孔中，过夜培养。然后用10微升接种环挑取每种细菌培养物中10至12个分离良好的单菌落，接种于含0.5%酵母提取物的10毫升Todd Hewitt肉汤中。短暂涡旋混匀，并在实验当天将培养物培养14至16小时。将每种细菌培养物涡旋振荡3至5秒，然后向已标记的预热试管中分别加入100 µL肺炎链球菌和100 µL唾液链球菌，每支试管内含10 mL培养基。将接种后的试管涡旋振荡3至5秒，并在37°C下孵育，使培养物生长至对数中期。在确认CCL-23细胞培养物汇合度至少达到80%后，使用移液管将24孔板各孔中的培养基移除，轻微倾斜培养板以避免扰动细胞单层；随后，加入约500 µL预热的PBS洗涤两次，每次均用移液管轻柔吸去液体。在洗涤过程中倾斜培养板，以帮助在第二次洗涤后维持单层细胞。向每个孔中加入500微升预温培养基，并将培养板放回培养箱中，同时准备细菌培养物。首先，取1毫升levarius菌液，在波长600处测定其光密度。然后将5毫升的Sal Levarius培养物转移至10毫升离心管中，在室温下以1,870 ×g离心4分钟。弃去上清液后，根据OD读数，将菌体沉淀重悬于200至1000微升的0.85%氯化钠溶液中，使其最终浓度约为1.5×10⁹个菌落形成单位/毫升。添加适量细菌是本实验中最关键的步骤，因为实际加入的细菌数量需等到次日进行菌落计数后才能确定。现在将重悬的唾液接种物转移至标记为“高”的微量离心管中。用0.85%氯化钠溶液将高浓度样品按1:10和1:100稀释，以制备用于检测的中浓度和低浓度alvar样品。每次稀释之间需涡旋混匀各管。为制备肝素对照孔，从每个对照孔中移除40微升培养基，并加入50微升肝素，使每孔终浓度为100单位/毫升。仅向 CCL 23 细胞孔以及 CCL 23 细胞加肺炎链球菌孔中加入 10 µL 的 0.85% 氯化钠溶液，彻底涡旋混匀所有 SIV 区域的浓度。然后向相应孔中加入 10 µL 未稀释的、1:10 和 1:100 稀释度的 SIV 不同浓度溶液，以促进细菌与细胞的接触。将培养板在室温下以 114 ×g 离心 3 分钟，随后将培养板孵育 1 小时。在细胞孵育的同时，用 0.85% 氯化钠溶液对唾液储备液进行连续稀释，并使用无菌涂布棒将 10⁻⁵、10⁻⁶ 和 10⁻⁷ 稀释度的样品各取 100 µL，分别涂布于马血琼脂平板上，每个稀释度设两个重复。在单层培养接近尾声时，将培养板倒置培养过夜，作为沙文氏孵育。测定肺炎链球菌培养物的光密度，然后离心1毫升菌液。根据OD读数，将菌体沉淀重悬于300至2000微升0.85%氯化钠溶液中，最终浓度约为每毫升1.5亿个菌落形成单位。然后，除阴性对照孔外，向所有孔中加入10 µL未稀释的肺炎链球菌，再次离心24孔板，随后将共培养物孵育3小时。在孵育期间，以与唾液链球菌相同的方式对肺炎链球菌菌液进行连续稀释并涂布平板。孵育3小时后，在显微镜下观察细胞是否存在任何细胞病变效应。现在移除每个孔中的培养基，并用 1×PBS 轻轻洗涤共培养物三次，以去除未黏附的细菌，注意不要破坏单层细胞。然后在 37 摄氏度、5%二氧化碳条件下，用 200 微升含 0.1% 脱氧胆酸钠的溶液裂解细胞，作用 7 分钟。接着，向每个孔中加入 800 微升 THB 培养基。用移液器反复吹打数次，将各孔中的细胞悬液收集至已标记的微量离心管中。随后对贴壁的肺炎链球菌进行连续稀释，并于次日在适当稀释度的平板上计数菌落。本表中肺炎链球菌与alvar的定量结果，展示的是一个代表性实验的数据，其中在加入slovar 1小时后将肺炎链球菌接种至CCL 23细胞。肺炎球菌的黏附通过活菌计数和荧光素酶检测进行定量。在细菌绝对数量和黏附百分率方面，A-Q-P-C-R 的两种方法结果一致。数据已根据仅含肺炎球菌孔中黏附的肺炎球菌数量进行标准化。肝素用作对照，因为它已知可抑制肺炎球菌的黏附。因此，与单独肺炎球菌相比，肺炎球菌加肝素样本中黏附率降低约40%或更多，表明实验成功。唾液以剂量依赖的方式抑制肺炎球菌的黏附，其中高浓度的唾液链球菌（约10个唾液链球菌对1个肺炎球菌）导致肺炎球菌黏附率最低。当在肺炎球菌接种前一小时、同时或接种后一小时加入唾液乳杆菌时，这些移植物显示了肺炎球菌对CCL 23细胞的黏附情况。阿尔瓦乳杆菌在肺炎球菌接种前加入时，抑制肺炎球菌黏附的效果更佳，因为在预处理实验中，阿尔瓦乳杆菌的高剂量和中剂量均显著降低了肺炎球菌的黏附。而在共处理和后处理实验中，仅高剂量的斯洛瓦乳杆菌抑制了肺炎球菌的黏附。因此，在观看本视频后，您应能充分理解如何开展体外实验，以测定益生性链球菌细胞组分对肺炎链球菌黏附的抑制作用。

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

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体外细菌黏附哺乳动物上皮细胞实验

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评估肺炎球菌在恒定培养基流动条件下对原代人内皮细胞的黏附作用

来源：Calatayud Arroyo, M., et al. 在体外肠道宿主-微生物界面评估合成细菌群落的存活能力。J. Vis. Exp.

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研究益生菌对肺炎球菌定植影响的实验方法体外黏附实验

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