研究益生菌对肺炎球菌定植影响的实验方法 体外 黏附实验

本实验的总体目标是评估益生菌链球菌细胞勒瓦里乌斯（streptococcus cell levarius）抑制肺炎链球菌黏附于上皮细胞系的能力。首先制备CCL-23上皮细胞单层，随后在24孔板中依次将勒瓦里乌斯（slovar）和肺炎链球菌加入细胞单层中，并进行孵育。

最后一步中，清洗孔板以去除未黏附的细菌。裂解CCL 23上皮细胞并收集孔板内容物。最终，通过定量与细胞相关的肺炎链球菌数量，可评估唾液链球菌对肺炎链球菌黏附的影响。

该方法有助于回答感染性疾病领域中的关键问题，例如益生菌是否能够抑制肺炎链球菌等细菌病原体的黏附。当我们开始研究罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus hypnosis）、GG 菌株及其他益生菌在呼吸道中的潜在应用时，首次提出了该方法。本实验操作将由本实验室的博士生简·曼宁（Jane Manning）和 Zen 演示。在实验前一天，将汇合的 CCL-23 上皮细胞培养物进行传代，并将其用预热的培养基稀释至每毫升 150,000 个细胞的浓度，置于无菌的 50 毫升离心管中。

将细胞接种至经处理的24孔组织培养板中，每孔1毫升，过夜培养。然后用10微升接种环挑取每种细菌培养物中10至12个分离良好的单菌落，接种于含0.5%酵母提取物的10毫升Todd Hewitt肉汤中。短暂涡旋混匀，并在实验当天将培养物培养14至16小时。

将每种细菌培养物涡旋振荡3至5秒，然后向已标记的预热试管中分别加入100 µL肺炎链球菌和100 µL唾液链球菌，每支试管含10 mL培养基。将接种后的试管涡旋振荡3至5秒，并在37°C条件下孵育，使培养物生长至对数中期。在确认CCL-23细胞培养物汇合度至少达到80%后，使用移液管将24孔板各孔中的培养基移除，轻微倾斜培养板以避免扰动细胞单层；随后加入约500 µL预热的PBS洗涤两次，每次均用移液管轻柔吸去液体。

在洗涤过程中倾斜培养板，以帮助在第二次洗涤后维持单层细胞结构。向每个孔中加入500微升预热的培养基，并在准备细菌培养物时将培养板放回培养箱。首先，测定1毫升levarius菌液在600 nm吸光度下的光密度。

然后将5毫升的Sal Levarius培养物转移至10毫升离心管中，在室温下以1,870 ×g离心4分钟。弃去上清液后，根据OD读数，用200至1000微升0.85%氯化钠溶液重悬菌体沉淀，使其最终浓度约为每毫升1.5×10⁹个菌落形成单位。添加准确数量的细菌是本实验中最关键的步骤，因为实际加入的细菌数量需等到次日进行菌落计数后才能确定。

现在将重悬的唾液接种物转移至标记为“高”的微量离心管中。用0.85%氯化钠溶液将高浓度样品按1:10和1:100稀释，以制备用于检测的中浓度和低浓度alvar样品。每次稀释之间需涡旋混匀。为制备肝素对照孔，从每个对照孔中移除40微升培养基，并加入50微升肝素，使每孔终浓度为100单位/毫升。

仅向 CCL 23 细胞孔以及 CCL 23 细胞加肺炎链球菌孔中加入 10 µL 的 0.85% 氯化钠溶液，彻底涡旋混匀所有 SIV 区域的浓度。然后向相应的孔中加入 10 µL 未稀释的 SIV 原液及 1:10 和 1:100 稀释度的 SIV 溶液，以促进细菌与细胞的接触。将培养板在室温下以 114 ×g 离心 3 分钟，随后孵育培养板 1 小时。在细胞孵育的同时，用 0.85% 氯化钠溶液对唾液储备液进行系列稀释，并使用无菌涂布棒将 10⁻⁵、10⁻⁶ 和 10⁻⁷ 三个稀释度的样品各取 100 µL，分别涂布于马血琼脂平板上，每个稀释度设两个重复。

在单层培养接近尾声时，将培养板倒置培养过夜，作为药敏试验的孵育步骤。测定肺炎链球菌培养物的光密度，然后离心1毫升菌液。根据OD读数，将菌体沉淀重悬于300至2000微升0.85%氯化钠溶液中，最终浓度约为每毫升1.5亿个菌落形成单位。

然后向除阴性对照孔外的所有孔中加入10 µL未稀释的肺炎链球菌，再次离心24孔板，随后将共培养物孵育3小时。在孵育期间，以与唾液链球菌相同的方法对肺炎链球菌菌液进行连续稀释并涂板。孵育3小时后，在显微镜下观察细胞是否存在任何细胞病变效应。

现在从每个孔中移除培养基，并用 1×PBS 轻轻洗涤共培养物三次，以去除未黏附的细菌，注意不要破坏单层细胞。然后在 37 摄氏度、5%二氧化碳条件下，加入 200 微升 0.1% 脱氧胆酸钠孵育 7 分钟以裂解细胞。接着，向每孔中加入 800 微升 THB。

用移液器反复吹打数次，将各孔中的细胞悬液收集至已标记的微量离心管中。最后，对贴壁的肺炎链球菌进行系列稀释，并于次日计数适当稀释度平板上的菌落数。为定量本表中的肺炎链球菌和alvar，展示了一次代表性实验的结果，其中在加入slovar一小时后将肺炎链球菌接种至CCL 23细胞。

肺炎球菌的黏附通过活菌计数和发光法进行定量。在细菌绝对数量和黏附百分比方面，A-Q-P-C-R结果在两种方法之间具有一致性。数据已根据仅含肺炎球菌孔中黏附的肺炎球菌数量进行归一化处理。

肝素用作对照，因为它已知可抑制肺炎链球菌的黏附。因此，与单独肺炎链球菌相比，肺炎链球菌加肝素样本中黏附率降低约40%或更多，表明实验成功。唾液以剂量依赖的方式抑制肺炎链球菌的黏附，其中高浓度的唾液链球菌（约10个唾液链球菌对1个肺炎链球菌）导致最低的肺炎链球菌黏附。

这些移植实验表明，当在肺炎球菌接种前一小时、同时或后一小时加入唾液链球菌时，肺炎球菌对 CCL-23 细胞的黏附情况。Alvar 在肺炎球菌接种前加入时，抑制肺炎球菌黏附的效果更强，因为在预处理实验中，Alvar 的高剂量和中剂量均显著降低了肺炎球菌的黏附。而在同时处理和后处理实验中，仅高剂量的 Slovar 抑制了肺炎球菌的黏附。

观看本视频后，您应能够充分理解如何开展体外实验，以检测益生性链球菌细胞组分对肺炎链球菌黏附的抑制作用。