小脑颗粒神经元的遗传操作体外和在体内为研究神经元形态和迁移

以下实验的总体目标是评估感兴趣的蛋白质对神经元迁移和形态的影响。这是通过电穿孔实现的，P 四只大鼠幼崽的小脑。作为第二步，对 GFP 阳性小脑切片进行免疫组织化学，这允许电穿孔神经元的可视化。

接下来，对免疫染色切片进行成像，以测量神经元迁移的距离和神经元过程的长度。获得的结果将显示感兴趣的蛋白质对发育中的小脑皮层神经元迁移和形态的影响。与现有技术（如子宫抽吸）相比，该技术的主要优点是产后小脑易于接近。

这种方法可以帮助回答神经发育领域的关键问题，因为它可以揭示神经元迁移和形态发生的潜在机制该技术的视觉演示至关重要，因为注射部位的可靠定位需要练习。在展示小脑的体内电穿孔之前，我们将首先演示使用培养的小脑颗粒神经元作为模型系统的形态学测定。通过收集条件培养基并使神经元在 DMEM 中饥饿来开始此过程。

然后将 DNA 溶液和氯化钙混合。加入两个 X-H-B-S-S，并通过制造气泡轻轻混合溶液。然后向每个孔中加入 40 μL DNA 沉淀物，并在 37 摄氏度的培养箱中孵育神经元 18 分钟。

之后，去除 D-M-E-M-D-N-A 混合物，并用 500 微升 Prewarm DMEM 洗涤神经元两次。接下来，如果神经元将在培养中超过三天，则将收集的条件培养基添加回神经元中。在 1 到 5 天后，用 25 毫摩尔葡萄糖补充培养基以补充碳源。

使用 GFP 抗体对神经元进行免疫化学测试。使用荧光显微镜以盲法对每种情况至少 30 个单独的神经元进行成像，以测量轴突和树突。通过打开图像，将图像转换为带有图像 J 的 8 位图像。

然后选择图像，单击类型，然后单击八位并单击 保存 保存图像。现在运行 neuron J 插件并打开 8 位图像。使用 add tracings 选项首先跟踪轴突，在轴突的开头单击鼠标左键一次，然后沿着该过程移动鼠标。

然后双击轴突的尖端，如果轨迹与轴突形状匹配。如果建议的轨迹与轴突形状不同，请在轴突上单击一次以锚定轨迹。然后双击轴突的尖端。

接下来，单击 measure tracings（度量跟踪）。选择 Display trace measurements （显示轨迹测量） 选项，然后按 run axon measurements （运行轴突测量） 都会显示在新窗口中。将它们保存为可以在任何电子表格程序中打开的单独文件。

要测量树枝突总长度，请单击 测量跟踪.选择显示组测量值，然后按 run。枝晶总数测量值均显示在新窗口中。

将它们保存为单独的文件，在此过程中可以在任何电子表格程序中打开。用异氟麻醉 P 四大鼠泡芙后，用 70% 乙醇对其后脑勺进行消毒。接下来，在鹅颈灯下找到白化幼犬的小脑。

横窦将中脑与皮质半球清晰地分开，应该是可见的。小脑位于中脑附近，呈较深的阴影。将幼崽保持在固定位置，并使用永久性记号笔用点表示小脑。

然后插入针头，将 3 微升 DNA 缓慢注入小脑。如果在此过程中麻醉消失，请将幼崽暴露在异氟中 在注射 DNA 之前，让 DNA 溶液扩散 30 秒到 1 分钟。注射 DNA 后，将幼犬的头部放在镊子 TRO 之间，使负极与头部后部的小脑区域接触，而正极与头部的另一侧接触。

根据幼犬的体重调整电压，以确保良好的电穿孔效率，而不会影响它们的存活。然后让幼崽接受五个电脉冲。电穿孔后，让幼崽在加热垫上或红外灯下恢复，然后再将其送回母带。

为了进行深入分析，将 IGL 细分为两半，得到一个面向分子层的上部 IGL 和一个面向白质的下部 IGL，并计算驻留在每半中的 GFP 阳性神经元。要测量树突长度，请在 Amaris 中打开图像系列以生成树突的 3D 图像。接下来，单击 surpass 模式以 3D 形式查看神经元。

然后选择 add new filament 并单击 skip Automatic creation 开始半自动跟踪。之后，选择 绘制 选项卡和 自动路径。将鼠标光标移动到单元格体上，然后 Shift 加鼠标右键单击以选择要执行自动计算的单元格体。

然后使用 Shift 键和鼠标左键单击将路径添加到灯丝上，并实时可视化它们。最后，转到细丝统计窗口，然后单击详细的特定值和 F 螨树突长度总和，了解树突总长度总和。该图显示了小脑颗粒神经元中轴突和树突生长的分析。

编码 GFP 的质粒转染的 0 区小脑颗粒神经元在完全、中等或基础中培养 1 天、2 天或 3 天。固定后补充胰岛素的 Medium Eagle。使用 GFP 抗体对神经元进行免疫细胞化学检测，并测量轴突和树突长度。

在这里，白色箭头表示轴突，黄色箭头表示树突。本实验采用 psin GFP 质粒对 P 4 只大鼠幼崽的小脑进行电穿孔并分离。5 天后，使用 GFP 抗体对 40 微米冠状切片进行免疫组织化学评估小脑颗粒神经元在小脑中的定位，并使用 Mars 软件测量树突总长度。

箭头表示小脑颗粒神经元的细胞体，箭头表示掌握后树突。如果执行得当，这种技术可以在五分钟内完成对幼犬的探索。在尝试此过程时，重要的是要根据 P 的重量调整电压。

使用这种技术，可以同时纵几种感兴趣的蛋白质以描绘小脑发育过程中的通路。