Name: 一个单细胞消融从甲壳动物端足八细胞胚胎 Parhyale hawaiensis (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-16T23:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 55 s
Description: 学习从Parhyale hawaiensis八细胞胚胎中手动消融单个卵裂球的技术，用于研究甲壳类动物发育生物学和进化发育机制。该方法有助于探索生殖细胞谱系特化的分子基础。

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感谢 Rayhan Arif 和 Hassaan Shahawy 的摄像工作，Tripti Gupta 和 Frederike Alwes 在细胞消融技术优化方面的协助，以及 Extavour 实验室成员对数据、视频和稿件的反馈意见。本研究部分得到了哈佛干细胞研究所（种子基金编号 SG-0057-10-00）、艾里森医学基金会（新学者奖编号 AG-NS-07010-10，授予 CGE）以及哈佛大学本科生研究项目（授予 ARN）的资助。

对执行某些步骤可能有帮助的说明以斜体标出。
1. 第1天：材料准备
<ol>
	<li>准备以下材料（参见材料与设备列表）：
	<ul>
		<li>15 cm 和 22 cm 的巴斯德吸管</li>
		<li>金刚石刻刀</li>
		<li>含 1 mg/ml 两性霉素 B（取 100 mg/ml 储存液按 1:100 稀释）、100 单位/ml 青霉素和 100 mg/ml 链霉素（取含 5,000 单位/ml 青霉素和 5,000 mg/ml 链霉素的储存液按 1:50 稀释）的过滤人工海水（盐度介于 0.0018–0.0020 之间）</li>
		<li>不含添加剂的过滤人工海水（盐度介于 0.0018–0.0020 之间）</li>
		<li>用于饲养配对个体的大型塑料容器（至少 15 cm × 15 cm × 5 cm）</li>
		<li>内衬 Sylgard 的小型（3 cm 或 5 cm）培养皿</li>
		<li>小型（3 cm 或 5 cm）培养皿</li>
		<li>表面皿或玻璃多孔板</li>
		<li>镊子（我们使用由旧 Dumont #5 镊子改造而成的钝头镊子，这些镊子在其他实验操作中意外损坏后，通过镊子磨石进行修整，确保镊尖光滑、两侧尖端长度一致且无锐利尖端。极细的镊子，如新的 Dumont #5 镊子，不推荐使用，因其可能损伤胚胎和/或雌性个体）</li>
		<li>末端扩大的巴斯德吸管（见下文步骤 1.2）</li>
		<li>由细弯钨丝嵌入巴斯德吸管细端制成的胚胎回收工具（可用其他替代工具；见下文 1.3）</li>
		<li>具有小开口的口吸管（见下文步骤 1.4）</li>
		<li>由拉制玻璃毛细管制成的玻璃针（见下文步骤 1.5）</li>
	</ul>
	本实验方案中未使用对人类有毒的材料。然而，研究人员应根据所在机构的风险管理指南，佩戴手套或其他必要的防护装备。</li>
	<li>制作扩大的巴斯德吸管时，首先用金刚石刻刀在 15 cm 巴斯德吸管开始变细的位置周围划痕，用 Kimwipe 或纸巾包裹划痕区域以保护手指，然后小心地在划痕处折断管尖。将断口端在本生灯火焰上加热数秒以使边缘光滑。开口应略窄于吸管的最大宽度。</li>
	<li>制作钨丝解剖工具时，将一根钨丝插入 15 cm 玻璃巴斯德吸管的一端，并短暂置于本生灯火焰上加热玻璃，使玻璃熔化以固定钨丝。用镊子轻轻将钨丝末端弯成钩状。合适的工具形状示例见图 3。</li>
	<li>为口吸管制作小开口时，将 22 cm 巴斯德吸管的细端在火焰上拉成两段，折断细端的尖端，然后插入口吸管手柄末端。</li>
	<li>使用拉针仪 拉制用于消融过程中穿刺目标卵裂球的玻璃针。图 4展示了合适形状的针示例。该针使用 Sutter P97 拉针仪，按照程序参数 2×(加热 = 566，拉力 = 100，速度 = 20，时间 = 250) + 1×(加热 = 566，拉力 = 100，速度 = 100，时间 = 250) 拉制而成。拉针所用的具体程序和仪器可有所不同，但所制玻璃针必须具有精细的尖端，同时具备足够的强度，在接触胚胎绒毛膜时不会断裂。</li>
</ol>
2. 第1天：收集Parhyale&#160;交配对
<ol>
	<li>使用加宽的巴斯德吸管（如上文步骤1.2所述）从大培养容器中收集交配中的 P. hawaiensis 成对个体，并将其转移至另一个含有洁净人工海水的容器中。该人工海水无需经过过滤。最好在傍晚稍晚时收集正在交配的个体，并将这些成对个体在室温（20–23 ºC）下过夜培养，以便次日早晨大多数胚胎已处于刚受精并产出的状态，即适合进行消融操作的早期卵裂阶段。应至少收集20对交配个体，以确保次日早晨有一定数量的雌性个体携带处于早期卵裂阶段的胚胎。</li>
</ol>
3. 第2天：Parhyale&#160;胚胎的收集
<ul>
	<li>次日早晨，用 CO2 饱和过滤的人工海水（FASW）。部分雌性个体在夜间会从雄性配偶中游离出来；收集这些分离的雌性个体，并将其麻醉于含 CO2 的 FASW 中。 未配对的雄性个体可从交配容器中移除，并放回大规模培养体系中。剩余的交配对可保留，用于当天晚些时候或次日收集胚胎。</li>
	<li>将一只携带胚胎的麻醉雌性个体转移至盛有含 CO2 的 FASW 的表面皿中。所有已分离的雌性个体很可能已完成产卵，卵可通过雌性透明的基节板肉眼观察到，呈淡粉色或紫色的球形结构（图1A）。为判断胚胎是否处于早期卵裂阶段，因而适用于胚裂球消融实验，研究人员需将胚胎从育卵囊中取出，并在显微镜下进行观察。</li>
	<li>在解剖显微镜下观察操作过程，用镊子夹住身体一侧的基节板。胚胎可见于这些基节板之间的腹侧育卵囊内（图1B）。</li>
	<li>将细而弯曲的金属丝工具（图3；见上文步骤1.3）插入育卵囊的后端，轻轻将金属丝向育卵囊前端提起，以分离育卵囊的覆盖结构（这些是称为育卵叶（oostegites）30 的特化腹侧附肢），从而打开育卵囊并松动其中的胚胎。产卵后约一小时内的胚胎均包裹在一层极薄且透明的膜中，该膜易被金属丝工具破坏；此膜在产卵后约2–3小时即消失，此后直至胚胎发育全程，胚胎彼此之间以及与母体之间均无任何连接。若研究人员发现使用弯曲金属丝工具从育卵囊中取出胚胎操作不便或困难，可选用其他替代工具，前提是操作动作轻柔，且不对胚胎或育卵囊施加剧烈压力。适用于从育卵囊中取出胚胎的其他工具包括钝头镊子或末端密封并磨光的玻璃毛细管。</li>
	<li>使用未经改造的15 cm巴斯德移液管，将液体冲入已打开的育卵囊，以冲出胚胎，胚胎应会沉降至表面皿底部。随后将雌性个体转移至清洁的FASW（不含CO2）中，使其恢复，再重新放回主培养体系。多个雌性个体可置于同一恢复皿中，但需确保其完全恢复后再放回主培养体系，否则若仍处于部分麻醉状态，可能被其他动物捕食。</li>
	<li>使用未经改造的15 cm巴斯德移液管将胚胎转移至盛有清洁FASW的培养皿中，在显微镜下观察以确定其胚胎发育阶段。挑选处于第三次卵裂（第4阶段&#160;5）的胚胎用于本实验。本方案也可应用于原肠胚盘形成前的任何卵裂阶段（第7–8阶段&#160;5）。</li>
</ul>
4. 第2天：单细胞消融
<ol>
	<li>在铺有Sylgard的培养皿中加入一层浅海水中。使用未经修改的15 cm巴斯德移液管将单个胚胎转移至培养皿中。</li>
	<li>使用钝头镊子轻轻滚动胚胎，以识别需要消融的细胞（图2A和&#160;2B）。生殖系前体细胞g可被识别为最小的微裂球，位于最小的大裂球Mav之上。此外，g不直接与细胞en接触，因为中胚层前体微裂球ml和mr在胚胎中央共享一条细胞边界。mr是位于g右侧的裂球，而ml是位于g左侧的微裂球。mr、ml和en的姐妹大裂球分别为外胚层前体Er、El和Ep。</li>
	<li>若研究者为右利手，则用左手持镊子（若为左利手则用右手），将胚胎调整方向，使目标细胞位于右侧（左利手者则位于左侧），并用镊子轻轻夹住胚胎以固定。</li>
	<li>使用拉制的玻璃针（见步骤1.5；图4）轻轻刺穿目标细胞。切勿将针插入过深，以免刺入目标细胞邻近或下方的细胞。针只需穿透绒毛膜及下方的细胞膜，无需深入细胞内部即可完成消融。</li>
	<li>将用于刺穿胚胎的玻璃针更换为带有精细拉制巴斯德移液管尖端的口控移液管玻璃端（见步骤1.4）。将移液管尖端靠近目标细胞上所形成的孔洞，并施加极轻微的负压吸力。</li>
	<li>用镊子非常轻柔地挤压胚胎。当裂球内容物通过步骤4.4中形成的孔洞被挤出绒毛膜时，用口控移液管将其吸出，以便清晰观察胚胎。若孔洞足够大，可能还会看到被刺穿细胞的细胞核被挤出，这有助于确认整个细胞内容物已被完全清除，无法再生。</li>
	<li>在移除目标裂球的过程中仔细观察胚胎。被刺穿细胞的边界会向绒毛膜上的孔洞方向回缩，使下方细胞的交界变得可见。持续施加压力，直至目标裂球完全被移除。使用镊子将胚胎左右轻轻翻滚，目视确认目标裂球已彻底清除。</li>
	<li>使用未经修改的15 cm巴斯德移液管，将胚胎转移至洁净的FASW+培养液中（FASW + 1 mg/ml两性霉素B、100单位/ml青霉素和100 mg/ml链霉素）。</li>
	<li>将裂球消融后的胚胎置于洁净的48孔板的各个独立孔中，用FASW+培养，每日更换50%含抗生素的FASW+。在我们的实验条件下，即使经过消融处理，胚胎在18–28 ºC温度范围内仍能良好存活并正常发育。研究者应根据自身条件选择适宜的培养温度，确保拥有清洁（不一定无菌）且干扰最小的培养表面。为了能够将裂球消融胚胎的发育事件时间点与对照组进行比较，我们建议读者参考已在18 ºC4、25 ºC4和26 ºC5,6条件下建立的详细胚胎发育分期资料。</li>
</ol>

<ol><li>Rehm, E. J., Hannibal, R. L., Chaw, R. C., Vargas-Vila, M. A., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+3%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Model+Organisms%3A+A+Laboratory+Manual+Volume%22%5BJournal%5D)">Chapter 3.</a> Emerging Model Organisms: A Laboratory Manual Volume. , CSHL Press. 373-404 Forthcoming.</li>
<li>Sander, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+formation+in+insect+embryogenesis%3A+the+evolution+of+concepts+and+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.Insect+Morphol.+Embryol%22%5BJournal%5D)">Pattern formation in insect embryogenesis: the evolution of concepts and mechanisms.</a> Int. J.Insect Morphol. Embryol. 25, 349-367 (1997).</li>
<li>Regier, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arthropod+relationships+revealed+by+phylogenomic+analysis+of+nuclear+protein-coding+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Arthropod relationships revealed by phylogenomic analysis of nuclear protein-coding sequences.</a> Nature. 463, 1079-1083 (2010).</li>
<li>Extavour, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fate+of+isolated+blastomeres+with+respect+to+germ+cell+formation+in+the+amphipod+crustacean+Parhyale+hawaiensis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The fate of isolated blastomeres with respect to germ cell formation in the amphipod crustacean Parhyale hawaiensis.</a> Dev. Biol. 277, 387-402 (2005).</li>
<li>Browne, W. E., Price, A. L., Gerberding, M., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+in+the+amphipod+crustacean%2C+Parhyale+hawaiensis%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development in the amphipod crustacean, Parhyale hawaiensis.</a> Genesis. 42, 124-149 (2005).</li>
<li>Gerberding, M., Browne, W. E., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+lineage+analysis+of+the+amphipod+crustacean+Parhyale+hawaiensis+reveals+an+early+restriction+of+cell+fates%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cell lineage analysis of the amphipod crustacean Parhyale hawaiensis reveals an early restriction of cell fates.</a> Development. 129, 5789-5801 (2002).</li>
<li>Rehm, E. J., Hannibal, R. L., Chaw, R. C., Vargas-Vila, M. A., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fixation+and+dissection+of+Parhyale+hawaiensis+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protoc%22%5BJournal%5D)">Fixation and dissection of Parhyale hawaiensis embryos.</a> Cold Spring Harbor Protoc. 2009, (2009).</li>
<li>Price, A. L., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+divergent+mechanisms+of+mesoderm+development+in+arthropods%3A+the+expression+of+Ph-twist+and+Ph-mef2+in+Parhyale+hawaiensis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+B.+Dev.+Evol%22%5BJournal%5D)">Investigating divergent mechanisms of mesoderm development in arthropods: the expression of Ph-twist and Ph-mef2 in Parhyale hawaiensis.</a> J. Exp. B. Dev. Evol. 310, 24-40 (2008).</li>
<li>Rehm, E. J., Hannibal, R. L., Chaw, R. C., Vargas-Vila, M. A., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+hybridization+of+labeled+RNA+probes+to+fixed+Parhyale+hawaiensis+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protoc%22%5BJournal%5D)">In situ hybridization of labeled RNA probes to fixed Parhyale hawaiensis embryos.</a> Cold Spring Harbor Protoc. 2009, (2009).</li>
<li>Browne, W. W., Schmid, B. G. M., Wimmer, E. A., Martindale, M. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+otd+orthologs+in+the+amphipod+crustacean%2C+Parhyale+hawaiensis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Genes+Evol%22%5BJournal%5D)">Expression of otd orthologs in the amphipod crustacean, Parhyale hawaiensis.</a> Dev. Genes Evol. 216, 581-595 (2006).</li>
<li>Prpic, N. M., Telford, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+homothorax+and+extradenticle+mRNA+in+the+legs+of+the+crustacean+Parhyale+hawaiensis%3A+evidence+for+a+reversal+of+gene+expression+regulation+in+the+pancrustacean+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Genes+Evol%22%5BJournal%5D)">Expression of homothorax and extradenticle mRNA in the legs of the crustacean Parhyale hawaiensis: evidence for a reversal of gene expression regulation in the pancrustacean lineage.</a> Dev. Genes Evol. 218, 333-339 (2008).</li>
<li>Kizil, G., Havemann, J., Gerberding, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germ+cells+in+the+crustacean+Parhyale+hawaiensis+depend+on+Vasa+protein+for+their+maintenance+but+not+for+their+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Germ cells in the crustacean Parhyale hawaiensis depend on Vasa protein for their maintenance but not for their formation.</a> Dev. Biol. 327, 320-239 (2009).</li>
<li>Liubicich, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knockdown+of+Parhyale+Ultrabithorax+recapitulates+evolutionary+changes+in+crustacean+appendage+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Knockdown of Parhyale Ultrabithorax recapitulates evolutionary changes in crustacean appendage morphology.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 13892-13896 (2009).</li>
<li>Pavlopoulos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+evolution+of+appendage+specialization+by+Hox+gene+misexpression+in+an+emerging+model+crustacean%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Probing the evolution of appendage specialization by Hox gene misexpression in an emerging model crustacean.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 13897-13902 (2009).</li>
<li>Vargas-Vila, M. A., Hannibal, R. L., Parchem, R. J., Liu, P. Z., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+prominent+requirement+for+single-minded+and+the+ventral+midline+in+patterning+the+dorsoventral+axis+of+the+crustacean+Parhyale+hawaiensis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A prominent requirement for single-minded and the ventral midline in patterning the dorsoventral axis of the crustacean Parhyale hawaiensis.</a> Development. 137, 3469-3476 (2010).</li>
<li>Simanton, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conservation+of+arthropod+midline+netrin+accumulation+revealed+with+a+cross-reactive+antibody+provides+evidence+for+midline+cell+homology%5BTitle%5D)+AND+%22Evol.+Dev%22%5BJournal%5D)">Conservation of arthropod midline netrin accumulation revealed with a cross-reactive antibody provides evidence for midline cell homology.</a> Evol. Dev. 11, 260-268 (2009).</li>
<li>Rehm, E. J., Hannibal, R. L., Chaw, R. C., Vargas-Vila, M. A., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+staining+of+Parhyale+hawaiensis+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protoc%22%5BJournal%5D)">Antibody staining of Parhyale hawaiensis embryos.</a> Cold Spring Harbor Protoc. 2009, (2009).</li>
<li>Pavlopoulos, A., Averof, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+genetic+transformation+for+comparative+developmental+studies+in+the+crustacean+Parhyale+hawaiensis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Establishing genetic transformation for comparative developmental studies in the crustacean Parhyale hawaiensis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 7888-7893 (2005).</li>
<li>Kontarakis, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+strategy+for+gene+trapping+and+trap+conversion+in+emerging+model+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A versatile strategy for gene trapping and trap conversion in emerging model organisms.</a> Development. 138, 2625-2630 (2011).</li>
<li>Zeng, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+assembly+and+characterization+of+a+maternal+and+developmental+transcriptome+for+the+emerging+model+crustacean+Parhyale+hawaiensis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genom%22%5BJournal%5D)">De novo assembly and characterization of a maternal and developmental transcriptome for the emerging model crustacean Parhyale hawaiensis.</a> BMC Genom. 12, 581 (2011).</li>
<li>Zeng, V., Extavour, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ASGARD%3A+an+open-access+database+of+annotated+transcriptomes+for+emerging+model+arthropod+species%5BTitle%5D)+AND+%22Database%22%5BJournal%5D)">ASGARD: an open-access database of annotated transcriptomes for emerging model arthropod species.</a> Database. , (2012).</li>
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<li>Alwes, F., Hinchen, B., Extavour, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterns+of+cell+lineage%2C+movement%2C+and+migration+from+germ+layer+specification+to+gastrulation+in+the+amphipod+crustacean+Parhyale+hawaiensis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Patterns of cell lineage, movement, and migration from germ layer specification to gastrulation in the amphipod crustacean Parhyale hawaiensis.</a> Dev. Biol. 139, 110-123 (2011).</li>
<li>Ewen-Campen, B., Schwager, E. E., Extavour, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+machinery+of+germ+line+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Reprod.+Dev%22%5BJournal%5D)">The molecular machinery of germ line specification.</a> Mol. Reprod. Dev. 77, 3-18 (2010).</li>
<li>Price, A. L., Modrell, M. S., Hannibal, R. L., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesoderm+and+ectoderm+lineages+in+the+crustacean+Parhyale+hawaiensis+display+intra-germ+layer+compensation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Mesoderm and ectoderm lineages in the crustacean Parhyale hawaiensis display intra-germ layer compensation.</a> Dev. Biol. 341, 256-266 (2010).</li>
<li>Fraser, S. E., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+metamorphosis+of+experimental+embryology%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The molecular metamorphosis of experimental embryology.</a> Cell. 100, 41-55 (2000).</li>
<li>Olsson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clash+of+traditions%3A+the+history+of+comparative+and+experimental+embryology+in+Sweden+as+exemplified+by+the+research+of+G%C3%B6sta+J%C3%A4gersten+and+Sven+H%C3%B6rstadius%5BTitle%5D)+AND+%22Theory+Biosci%22%5BJournal%5D)">A clash of traditions: the history of comparative and experimental embryology in Sweden as exemplified by the research of Gösta Jägersten and Sven Hörstadius.</a> Theory Biosci. 126, 117-129 (2007).</li>
<li>Rehm, E. J., Hannibal, R. L., Chaw, R. C., Vargas-Vila, M. A., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injection+of+Parhyale+hawaiensis+blastomeres+with+fluorescently+labeled+tracers%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protoc%22%5BJournal%5D)">Injection of Parhyale hawaiensis blastomeres with fluorescently labeled tracers.</a> Cold Spring Harbor Protoc. 2009, (2009).</li>
<li>Chaw, R., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Independent+migration+of+cell+populations+in+the+early+gastrulation+of+the+amphipod+crustacean+Parhyale+hawaiensis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Independent migration of cell populations in the early gastrulation of the amphipod crustacean Parhyale hawaiensis.</a> Dev. Biol. 371, 94-109 (2012).</li>
<li>Schmitz, E. H. Crustacea Microscopic Anatomy of Invertebrates. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSchmitz%2C+EH+%22Microscopic+Anatomy+of+Invertebrates%22">Microscopic Anatomy of Invertebrates</a>. Harrison, F. W. 9, Wiley-Liss, Inc.. 443-528 (1992).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

我们描述了一种手动消融并完全物理移除端足类动物P. hawaiensis早期卵裂阶段单个卵裂球的实验方案。通过在八细胞期胚胎中移除唯一的生殖系前体细胞g，我们展示了该方案的应用，并通过确认在后续胚胎发育过程中不存在g的子代细胞，验证了消融的成功。该方案可用于在早期卵裂阶段移除胚胎中的任意一个小型卵裂球（micromere）。若需利用此方案在该阶段移除大型卵裂球（macromere），或在第一次或第二次卵裂阶段移除卵裂球，使用者只需在步骤4.4中制作稍大的卵膜切口，并在步骤4.6中施加更长时间的压力和吸力，以移除体积更大的细胞内容物即可。我们发现，采用本方案进行消融后，剩余卵裂球的发育在卵裂模式和细胞运动行为方面均未受到影响，至少可维持至原肠胚形成时期23。
该方案可能有助于进一步研究这种端足类动物早期卵裂期分裂球的发育潜能。该领域仍有许多问题有待解答，包括为何某些细胞能够改变其命运以替代被消融的分裂球，而其他细胞则不能，以及这些调节性变化的精确时间与机制。此外，该方案也可稍作...

近十年来，端足类甲壳动物Parhyale hawaiensis 已成为进化发育生物学研究中极具潜力的模式生物1。在节肢动物中，大多数模式生物属于昆虫，其中研究最为深入的是果蝇Drosophila melanogaster。D. melanogaster 属于昆虫纲双翅目，因此其胚胎发育特征相较于基部分支的昆虫已发生较多衍生性变化2。此外，昆虫嵌套于泛甲壳动物亚门（Pancrustacea）3 内，这意味着昆虫在系统发育上最接近被称为“泛甲壳类”的传统自然类群，而该类群为并系群。这表明，除了基部分支的昆虫模型外，还需研究其他甲壳类动物，以更全面地理解在D. melanogaster 中已被广泛研究的发育性状及分子机制的进化历史。然而，目前可用于实验性实验室发育分析的甲壳类动物极为有限。Parhyale hawaiensis 是一种实验操作性极强的实验室模式系统，适用于多种实验技术。端足类在其所属的高等端足总目（Peracarida，包括跳虾、钩虾和井虾）中表现出许多独特特征，因此被认为在该甲壳类群中属于较晚衍生的类群。尽管如此，Parhyale 所具备的胚胎学操作与功能遗传学操控的相对便利性，使其成为当前模式生物体系中极为宝贵的补充。
作为一种实验动物， P. hawaiensis 具有诸多优势。该动物对广泛的温度和盐度范围具有耐受性，并能在大量人工海水中良好存活。1根据明显的形态学差异可以轻松区分雄性和雌性，最显著的特征是雄性具有大型钩状的前部躯干附肢，用于在交配期间抓住雌性。对于胚胎学和发育研究， P. hawaiensis 具有多个非常吸引人的特点。胚胎发育持续约10天，在28 ºC条件下约六周达到性成熟（但需注意 帕拉哈尔 在约 20–30 ºC 的温度范围内具有良好的存活率，且在 18 ºC 条件下培养的胚胎已有详细的发育分期信息可供参考4，25 ºC4，以及 26 ºC5,6）。成虫在实验室条件下全年均可交配，因此一年中任何时候均可获得胚胎。雌性将2-20枚受精卵（数量取决于雌性个体的年龄）产入位于前几对附肢之间的腹面育卵囊中。图1A 和&#160;1B），并且可以在胚胎发育的早期无创地采集这些胚胎，而不会导致雌性个体死亡或对胚胎造成损伤（图1C胚胎可在过滤的人工海水中存活至孵化，并可用于后续的基因表达或组织学分析7，详细的分期表可准确识别发育进程的各个阶段5. 采用稳健的实验方案进行基因表达分析 原位 杂交8-15 或免疫染色4,16,17，通过RNA干扰实现功能敲低13,15 或吗啉寡聚核苷酸12，以及稳定的种系转基因18. 利用转基因系统，实现可诱导表达14 和增强子捕获19 方法也可用于研究基因在 P. hawaiensis尽管目前尚无公开可用的基因组序列，但已获得包含卵子发生和胚胎发生期间转录产物的转录组数据 从头合成 组装并注释20，并存入可搜索的数据库中21，促进基因发现。总之， P. hawaiensis 是一种高度易于操作的模式生物，适用于多种实验和遗传学方法来研究发育过程。
与黑腹果蝇（D. melanogaster）早期的合胞体卵裂不同，夏威夷短臂虾（P. hawaiensis）的胚胎在受精后进行全裂式卵裂（图2A）。谱系追踪分析表明，到第三次卵裂时，每个第三次卵裂的卵裂球已特异地决定其发育命运，分别形成三个胚层之一或生殖系6（图2B）。这些数据，结合微阵列数据22、细胞谱系分析6,23以及卵裂球分离实验4，提示发育潜能通过细胞命运决定因子的不对称遗传，已被分配至至少部分第三次卵裂的卵裂球中。因此，在卵裂球消融实验中，若在八细胞期移除生殖系前体细胞（在Parhyale细胞谱系命名法中称为“g”6），胚胎在后续发育阶段将缺乏生殖细胞4，表现为缺乏表达Vasa蛋白的细胞——该蛋白是大多数后生动物中生殖系的标志物24。相反，体细胞卵裂球消融实验表明，P. hawaiensis胚胎也具有显著的调节能力，八细胞期被消融的中胚层或外胚层前体卵裂球的命运可由其余卵裂球的后代细胞所取代25。目前尚不清楚这种调节性细胞命运替代是如何发生的，以及体细胞卵裂球自主决定其命运的程度。诸如卵裂球消融等实验胚胎学技术有助于理解细胞命运决定的相对自主性与非自主性26,27&#160;，因此在研究P. hawaiensis胚胎发生过程中具有重要意义。
在证明外胚层和中胚层谱系具有调节性替代能力的实验中，通过显微注射28并随后激发光毒性染料25来实现卵裂球消融。尽管该技术能够有效杀死被注射的卵裂球，但并不能将死亡细胞完全从胚胎中清除。此外，通过向卵裂球注射荧光谱系示踪剂获取原肠胚形成阶段的细胞谱系数据28,29，与通过追踪未受干扰卵裂球在相同胚胎发育阶段的发育过程所获得的数据之间也观察到了差异23。因此，完全物理性移除特定卵裂球可能是某些应用中更理想的消融方法。
我们此前发表了对单个细胞被人工消融的胚胎进行细胞谱系分析的结果23。然而，从早期卵裂阶段胚胎中去除单个卵裂球所需的精细操作尚未被完整描述。本文中，我们提供了一种收集P. hawaiensis胚胎以及从八细胞期胚胎中人工消融单个卵裂球的实验方案。该方法的目标是将细胞本体完全从胚胎中移除，从而观察胚胎发育及胚后发育过程中剩余细胞的细胞行为和细胞命运潜能。我们的方案展示了生殖系前体细胞g的移除过程（图2C），但该方法可适用于八细胞期的任意细胞，也可用于更早卵裂阶段的卵裂球。原则上，本方案还可推广应用于其他全裂型卵裂的海洋无脊椎动物的早期卵裂阶段胚胎中单个细胞的去除。

<table><tbody><tr><td>15 厘米巴斯德吸管</td><td>Wheaton</td><td>53499-630 VWR</td><td>用于将完整胚胎和单卵裂球消融后的胚胎在培养皿之间转移。</td></tr><tr><td>22 厘米巴斯德吸管</td><td>Wheaton</td><td>53499-632 VWR</td><td>用于制作口吸管尖端。</td></tr><tr><td>3 厘米培养皿</td><td>Thermo Scientific</td><td>25382-334 VWR</td><td>部分保持未处理状态，用于收集和储存胚胎；部分涂覆一层Sylgard（见下文），以创建用于卵裂球消融的操作表面。</td></tr><tr><td>48 孔板</td><td>Greiner Bio-One</td><td>82051-004 VWR</td><td>用于消融后胚胎的培养。</td></tr><tr><td>瓶顶滤器 0.2 &amp;micro;m</td><td>Nalge Nunc International</td><td>28199-296 VWR</td><td>用于制备FASW（见下文）。</td></tr><tr><td>本生灯</td><td>VWR</td><td>89038-530 VWR</td><td>用于制作钨丝工具以及口吸管的精细尖端。</td></tr><tr><td>金刚石刻线笔</td><td>Musco Sports Lighting</td><td>52865-005 VWR</td><td>用于制作宽口巴斯德吸管，以收集交配中的个体。</td></tr><tr><td>镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11050-10 Fine Science Tools</td><td>用于在从麻醉雌体的育卵囊中取出胚胎时固定个体。无需使用尖端极细的Dumont镊子——其尖端可至少与目录编号所列镊子一样钝。</td></tr><tr><td>抗真菌剂-两性霉素B（Fungizone-Amphotericin B）</td><td>Sigma</td><td>A2942 Sigma Aldrich</td><td>加入FASW中，终浓度为1 mg/ml，并用此溶液培养单卵裂球消融后的胚胎。</td></tr><tr><td>玻璃毛细管，长4英寸，外径/内径1/0.58（mm）</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100-4 World Precision Instruments</td><td>用于制作穿刺待消融卵裂球的针头。</td></tr><tr><td>玻璃表面皿，直径300 mm</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>70543-30 Electron Microscopy Sciences</td><td>用于从麻醉雌体的育卵囊中取出胚胎。</td></tr><tr><td>Instant Ocean人工海水（ASW）</td><td>Instant Ocean</td><td>IS160 Aquatic EcoSystems</td><td>将盐溶解于去离子水中，配制盐度为1.022–1.024的人工海水。</td></tr><tr><td>Instant Ocean过滤人工海水（FASW）</td><td>Instant Ocean</td><td>IS160 Aquatic EcoSystems</td><td>使用0.2 &amp;micro;m滤器对ASW进行灭菌。根据需要配制小量（&amp;lt; 250 ml）使用。</td></tr><tr><td>Kimwipes吸水纸</td><td>Kimberly-Clark</td><td>21905-026 VWR</td><td>用于安全折断为收集交配个体而改装的巴斯德吸管的精细末端。</td></tr><tr><td>口吸管连接适配器</td><td>Drummond Labware</td><td>A5177-5EA Sigma Aldrich</td><td>将拉制精细的巴斯德吸管尖端插入此端，用于在消融过程中吸除挤出的细胞内容物。</td></tr><tr><td>口吸管用软管</td><td>Aldrich</td><td>Z280356 Sigma Aldrich</td><td>剪成适当长度，以便在消融操作期间舒适地挂在颈部。</td></tr><tr><td>拉针仪</td><td>Sutter Instrument Company</td><td>P97 Sutter Instrument Company</td><td>用于从玻璃毛细管拉制穿刺待消融卵裂球的针头。</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素溶液</td><td>Mediatech</td><td>45000-650 VWR</td><td>加入FASW中，使青霉素终浓度为100单位/ml，链霉素终浓度为100 mg/ml，并用此溶液培养单卵裂球消融后的胚胎。</td></tr><tr><td>橡胶吸球</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>100488-418 VWR</td><td>配合巴斯德吸管使用，用于在培养皿之间转移胚胎。</td></tr><tr><td>Sylgard 184</td><td>K. R. Anderson, Inc.</td><td>NC9659604 Fisher Scientific</td><td>按制造商说明配制。倒入3 cm培养皿中，形成2–5 mm厚的涂层，作为卵裂球消融的操作表面。</td></tr><tr><td>钨丝，直径0.004英寸</td><td>A-M Systems</td><td>719000 A-M Systems</td><td>用于制作从麻醉雌体育卵囊中取出胚胎的工具。</td></tr></tbody></table>

八细胞期端足类甲壳动物parhyale hawaiensis单细胞消融

Ablation of a Single Cell From Eight-cell Embryos of the Amphipod Crustacean Parhyale hawaiensis

端足类动物Parhyale hawaiensis是一种小型甲壳动物，广泛分布于全球潮间带海洋生境中。在过去十年中，Parhyale 已成为发育生物学实验室研究中一个极具前景的模式生物，可作为与已被深入研究的节肢动物模式生物Drosophila melanogaster进行有效外群比较的工具。与Drosophila的合胞体卵裂不同，Parhyale的早期卵裂为全裂型。通过向早期卵裂球中注射示踪染料进行命运图谱标记的研究表明，三个胚层以及生殖系在八细胞期时均已建立。在此阶段，有三个卵裂球注定发育为外胚层，三个注定发育为中胚层，其余两个卵裂球则分别为内胚层和生殖系的前体细胞。然而，卵裂球消融实验表明，Parhyale胚胎还具有显著的调控能力，即在八细胞期被消融的卵裂球的命运可由其余部分卵裂球的后代细胞所取代。此前，卵裂球消融主要通过两种方法实现：注射光毒性染料并随后激活，或手动消融。然而，光消融虽可杀死目标卵裂球，却无法从胚胎中清除死亡的细胞体。因此，对于某些研究应用而言，完全物理性地移除特定卵裂球可能是更优的消融方法。本文介绍了一种在Parhyale胚胎八细胞期手动移除单个卵裂球的实验方案，详细说明了完成细胞体完全移除所必需的仪器与手动操作步骤，同时确保其余卵裂球保持存活且结构完整。该方案可适用于Parhyale八细胞期的任意细胞，也可用于其他早期卵裂阶段的卵裂球。此外，原则上，该方法还可推广应用于其他进行全裂型卵裂的海洋无脊椎动物的早期卵裂阶段胚胎。

按照本方案所述，成功消融单个第三次卵裂的P. hawaiensis小裂球后，其余小裂球会逐渐轻微移动位置，以部分占据被消融裂球原先所处的空间。例如，当消融g裂球时，其相邻的裂球mr和ml会轻微移动，进而共享原先直接与g接触的侧向细胞边界（比较图2A与2C）。成功消融后，剩余裂球在进入第四次卵裂前可能会出现轻微延迟（不足一小时），但随后应恢复与未操作胚胎至少至原肠胚阶段相同的卵裂模式和时间进程23。在消融四个小裂球中的任何一个后，其余裂球的后代也应表现出正常的卵裂时序和细胞行为，包括形成一种称为“玫瑰花结”（rosette）的特征性细胞排列，以及启动原肠胚运动23。对于初次掌握该技术的研究人员而言，经消融处理后存活并完成胚胎发育直至孵化的胚胎比例最初可能约为10%，但随着经验积累，平均存活率应可达约50%，若操作熟练并仔细护理消融后的胚胎，存活率甚至可高达75%。<strong...

两栖类片脚类动物Parhyale hawaiensis 是研究甲壳动物胚胎学以及节肢动物比较发育与进化的理想模式生物。本实验方案描述了一种从Parhyale早期卵裂阶段胚胎中手动去除单个卵裂球的方法。

八细胞期端足类甲壳动物Parhyale hawaiensis单细胞消融

片脚类动物帕氏拟虾（Parhyale hawaiensis）是一种小型甲壳动物，广泛分布于全球潮间带海洋生境中。在过去十年中，帕氏拟虾已逐渐成为……

本演示展示了在豆荚中从早期胚胎去除生殖细胞前体细胞的技术。甲壳类动物 Parhyale hawaiensis 是一种新兴的模式生物，在进化和发育研究中具有广阔的应用潜力。大多数模式节肢动物属于昆虫，其中研究最为深入的是果蝇 Drosophila melanogaster。昆虫隶属于泛甲壳动物（Pancrustacea）这一亚门，研究昆虫以外的其他甲壳类动物，可以更全面地了解在果蝇中已被深入研究的发育特征及分子机制的进化历史。然而，目前适合作为实验性实验室发育分析的甲壳类动物种类极少。Parelli 是一个高度易于操作的实验室模式体系，因此为模式生物资源库提供了一个宝贵的补充。作为一种实验动物，parli 非常易于饲养和操作。它能够在大量的人工海水中良好存活，并且基于明显的形态学差异易于区分雌雄个体。最显著的特征是雄性在交配过程中用于抓住雌性的大型钩状前附肢，这对发育研究非常有利。帕氏虫具有多个极具吸引力的特点，雌雄个体全年均可交配，因此可以随时收集胚胎。雌性将胚胎产入前几对附肢之间的育卵囊中，可在胚胎发育早期无须杀死雌性或损伤胚胎的情况下收集胚胎。胚胎可在过滤的人工海水中存活并孵化，且存在详细的发生分期表，可准确判断其发育进程。图中展示的是从八细胞期发育阶段至孵化前的副节肢动物部分发育时期。旁胚中的每个细胞均特异性地分化为三个胚层之一或原始生殖细胞。本演示特别关注生殖细胞群体的特化过程。已知细胞名称G（germline，生殖系）是旁胚系谱追踪实验中唯一的生殖系前体细胞，实验表明G的后代将形成全部的生殖细胞，且不参与任何其他胚层的发育。此外，已有实验在不损伤其他细胞的情况下，将胚胎中的G细胞移除。在这些实验中，移除了G细胞的胚胎在整个后续胚胎发育过程中均缺乏生殖细胞，这通过缺乏表达Vasa蛋白的细胞得以证实；Vasa是一种在后生动物多种模式生物中广泛使用的生殖系标记蛋白。接下来，我们将演示如何收集卵裂球胚胎，并在八细胞期胚胎中手动消融G细胞。本视频演示了去除G细胞的操作，但该方法可应用于八细胞期的任何细胞。在本实验步骤中，我们需要一支末端加宽的巴斯德吸管、一支未经改动的巴斯德吸管、过滤的人工海水、一个用于饲养成对生物的大容器、若干小型培养皿、玻璃凹孔板、镊子，以及一种解剖工具——该工具由一根细的弯头金属丝固定在巴斯德吸管末端构成。本演示中未使用吸管手套，但请记住，应根据所在机构的风险管理要求添加适当的防护装备。制作加宽的巴斯德吸管时，首先使用金刚石笔在吸管末端周围划痕，然后小心折断尖端。在火焰上灼烧数秒以使边缘光滑。开口应略窄于移液管的最大宽度。制作钨丝解剖工具时，将钨丝插入玻璃移液管的一端，并在火焰上灼烧，使玻璃熔化固定钨丝。用镊子将导线固定到位，并轻轻弯曲导线末端，以便于使用工具进行操作。钩状末端的长度应略长于半厘米。使用加宽的巴斯德吸管收集配对的样本，并将其转移至另一装有人工海水的容器中。将配对的个体在室温下放置过夜。次日早晨，用二氧化碳饱和过滤的人工海水。收集分离后的雌性个体，并将其浸入该海水中进行麻醉。在解剖显微镜下，将一只雌性个体转移至含有过滤人工海水并通入二氧化碳的玻璃孔板中，用镊子夹住其身体一侧的基节板。胚胎可见于育卵囊内。将金属解剖针插入育卵囊的后端，轻轻将针向前端提起，以分离覆盖的育卵囊组织，打开育卵囊并暴露其中的胚胎。使用移液管将水冲洗通过打开的育儿囊，以推出胚胎。将雌性个体转移至不含二氧化碳的过滤人工海水中，使其恢复，然后再重新引入主培养环境。将胚胎转移至含有过滤人工海水的培养皿中，在显微镜下观察以确定其发育阶段。由于在将胚胎从雌性个体中取出前通常难以准确判断其发育阶段，因此我们常常需要收集多个雌性个体的胚胎，以获得足够数量的目标阶段胚胎。通常获得八细胞期胚胎的最简便方法是收集较早阶段的胚胎，并等待其发育至目标阶段。除了我们已为消融实验收集的胚胎外，还需要牧场移液管、镊子、过滤的人工海水、底部铺有一层石蜡的培养皿、由拉制玻璃毛细管制成的针头、带有小开口的口吸移液管、洁净的培养皿，以及含有两性霉素和青霉素-链霉素的过滤人工海水用于口吸移液管的尖端。将长尖端的移液管在火焰上拉制，然后折断其细端的尖端，并将其插入到口吸移液管的末端。此尖端的尺寸非常适合该实验操作。用于消融过程中穿刺G细胞的玻璃针必须具有精细的尖端，同时具备足够的强度，以避免在接触绒毛膜时折断。图中展示了我们实验室常用的一种针形。进行消融前，我们必须首先确定哪个细胞是G；左侧的胚胎图像中，G细胞以黑色轮廓标出。在接下来的部分中，我们将学习如何将G细胞与其他微镜细胞区分开来。右侧的胚胎显示了成功消融后预期得到的结果。在此胚胎中，G细胞已被消融（以黑色圆圈标示），仅用镊子保留了三个小分裂球。轻轻滚动胚胎以观察并比较细胞。G 可被确定为位于最小的大裂片（macro mere）上方的最小微裂片（microme），而最小的大裂片可通过翻转胚胎来识别。此外，G 不与细胞 EN 接触，EN 是位于其对侧的微裂片。由于该胚胎中细胞 el 和 er 在 G 与 EN 之间共享一条边界，我们可以观察到最小的微裂片位于左侧，并且可以看到它未与对侧的微裂片相接触。通过翻转胚胎，我们可以确认该微镜正位于最大的宏镜之上。现在它位于胚胎的左下角，我们可以明确将其称为G，并继续进行消融操作。简而言之。进行此操作时，我们将使用镊子固定胚胎，同时用拉制的玻璃针刺穿G。然后对胚胎施加轻微压力，使G的内容物通过我们制造的小孔排出胚胎外。当G的内容物排出后，我们使用口吸管将其吸除，以便观察G是否已完全去除。接下来详细描述该操作步骤：在丝网防护板中加入一层浅层的过滤人工海水。使用移液枪和镊子将一个八细胞期胚胎转移至板中。用左手将胚胎调整为G极朝右，并用拉制的玻璃针轻轻夹住胚胎以固定；随后轻轻刺穿G极，注意不要将针插入过深，以免刺入G极下方的大核。然后，将右手中的玻璃针更换为带有拉制毛细移液枪头的口吸管。将移液管尖端靠近G中的孔洞，并施加非常轻微的吸力。当G的内容物被推出卵壳时，用镊子轻轻挤压胚胎。将其吸入移液管口中，以便无遮挡地观察胚胎。仔细观察胚胎。随着G的去除，G的边缘会向卵壳上的孔洞方向回缩，使下方细胞的交界处变得可见。持续施加压力，直到G完全被去除，并用镊子轻轻滚动胚胎，目视确认G已全部清除。使用移液管将胚胎转移至含有两性霉素和青霉素-链霉素的过滤人工海水中。每天更换一半的胚胎培养液，以防止感染。以下是消融前和消融后的胚胎。如您所见，原来 G 的位置现在是一片空腔。如果操作轻柔，并且在操作后对胚胎进行良好护理，大部分胚胎能够存活至孵化。在我们的实验室中，平均存活率略高于 50%

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Biology

生物学

一个单细胞消融从甲壳动物端足八细胞胚胎<em&gt; Parhyale hawaiensis</em

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八细胞期端足类甲壳动物Parhyale hawaiensis单细胞消融

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