冲击波在细胞培养中的应用
2014年4月8日
如今，冲击波因其再生效应而广为人知。 体外 实验正受到越来越多的关注。因此，我们建立了一种模型 体外 体外冲击波治疗（IVSWT）试验，使我们能够模拟 体内 条件，从而避免干扰性的物理效应。
本实验方案的总体目标是避免体外冲击波治疗过程中产生干扰性的物理效应，以获得可重复的实验结果。实现该目标的第一步是将细胞培养瓶完全注满培养基，然后将培养瓶放入恒温水浴中。第二步是在将治疗头与水浴耦合时，使用足量的超声耦合凝胶。
接下来，将施用器水平放置于水浴的膜上。最后一步是确保冲击波源与细胞培养瓶的中心对齐，从而使细胞位于波的焦点范围内。最终，可对细胞进行分析，例如通过实时PCR和细胞因子阵列来检测目标基因和细胞因子的改变情况。
我们最初产生这一模型的想法，是因为注意到现有的将短波直接施加于细胞培养物的方法并未考虑培养基与周围空气交界处波反射的影响。本次实验操作将由我研究团队的博士生 Chante 博士演示。首先，将 3.5 升自来水加热至 37 摄氏度。
然后将加热的水转移至水浴中。水位应低于水浴顶部三厘米，并完全覆盖膜。接下来，将温度传感器连接至电源，并将温度传感器放入水浴后壁的接口中。
然后在搅拌水的同时，持续将加热器连接至电源，将水加热至稳定的 37 摄氏度。在无菌条件下，将细胞接种于 T25 培养瓶中。
因此，经过过夜培养后，细胞将达到90%的汇合度。随后将培养瓶垂直放置，并加入培养基至培养瓶颈部底部，以避免污染。注意不要让培养基接触培养瓶的颈部或瓶盖。
接下来，用不带滤膜的实心盖子盖紧锥形瓶，以防止水浴中的水造成污染。然后用聚甲醛密封瓶盖。密封完成后，将锥形瓶用夹子固定在支架上。
然后将固定的培养瓶插入水浴中，并使细胞培养瓶的中部与冲击波发生器膜的中心对齐。在冲击波发生器及其水浴膜表面涂抹足量的超声耦合凝胶，随后将发生器与膜连接，确保两者之间无气泡存在。
接下来，将冲击波治疗头置于膜的中心位置，并确保其在水平和垂直方向上与细胞培养瓶对齐，以保证整个细胞生长区域均得到处理。然后进行预实验，以确定冲击波治疗头与培养瓶之间的理想距离，以及设定正确的处理参数。在激活冲击波设备期间，务必保持培养瓶和治疗头处于稳定位置。
确定理想距离后，按照所需的冲击波处理参数进行实验。冲击波处理完成后，将细胞培养瓶从水浴中取出，用纸巾擦干，并对培养瓶外表面进行消毒。接着，将培养瓶中的培养基转移至离心管中。
在常规离心参数下收集细胞沉淀。将细胞沉淀重悬于两毫升细胞培养基中，然后将细胞悬液转移回含有五毫升细胞培养基的培养瓶中，培养细胞至细胞分析实验所需的汇合度。人脐静脉内皮细胞的实时PCR分析显示，经过冲击波处理后，tie2 mRNA水平上调。
这表明冲击波治疗可促进内皮细胞增殖并诱导血管生成。通过细胞因子阵列对脐静脉内皮细胞中的细胞因子水平进行定量分析。
两种炎症性细胞因子IL-6和IL-8也显著升高，二者均参与血管生成过程发展后的炎症反应。该技术为冲击波基础科学领域的众多研究人员探索体外实验中单细胞类型的影响铺平了道路。我们希望说服更多研究人员采用此模型，以在冲击波科学研究中获得可重复且可比较的结果。
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概述
本研究提出了一种体外冲击波实验（IVSWT）模型，旨在模拟体内环境的同时，最大限度地减少干扰性的物理效应。该方法旨在提高冲击波治疗实验中结果的可重复性。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 生物学
- 再生医学
背景
- 冲击波因其再生效应而闻名。
- 体外实验 increasingly 被用于研究这些效应。
- 减少物理干扰对于获得准确结果至关重要。
- 模拟体内条件可提高实验的有效性。
研究目的
- 建立可靠的体外冲击波实验模型。
- 在治疗过程中避免物理干扰。
- 在细胞分析中获得可重复的结果。
使用的方法
- 用培养基填充细胞培养瓶。
- 将培养瓶放入恒温水浴中。
- 使用超声耦合凝胶以确保施加器有效耦合。
- 将冲击波源与培养瓶中心对齐。
主要结果
- 细胞被置于波焦点内以实现最佳治疗效果。
- 可采用实时PCR和细胞因子阵列进行分析。
- 可观察到目标基因和细胞因子的变化。
结论
- IVSWT 模型能有效模拟体内条件。
- 减少干扰可获得更可重复的实验结果。
- 该方法可增强对冲击波对细胞作用效应的理解。
常见问题
行业重要性概述
该模型通过实现可重复的体外研究，紧密模拟体内条件，解决了冲击波研究中的一个关键空白。通过采用水耦合系统消除波反射伪影，该模型可在早期发现阶段为冲击波疗法提供可靠的机制性风险评估。该方法提高了对心血管及伤口愈合相关适应症中血管生成和炎症通路靶点验证的预测可信度。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：能够探究将物理冲击波刺激与内皮细胞生物学反应相连接的机械转导通路。
- 操作价值：提供标准化平台，确保在不同实验中一致地施加物理刺激。
- 预测价值：支持对冲击波在血管生成和炎症相关基因表达及细胞因子释放方面作用的假设进行检验。
筛选与检测方法开发
- 科学价值：通过实时 PCR 和细胞因子阵列生成定量、可重复的读数，用于评估通路调控。
- 操作价值：建立了一个可扩展、可重复使用的冲击波暴露系统，技术变异性极小。
- 检测适用性：产生标准化的生物学响应，可在后续筛选中实现对化合物或刺激物的可靠评估。
转化与临床前研究
- 转化连续性：通过模拟生理条件下的波传播环境，将在体外获得的研究结果与在体内的实际意义联系起来。
- 机制性风险降低：阐明物理刺激强度与人源内皮细胞生物学响应之间的剂量-效应关系。
- 临床前建模：在开展动物研究之前，支持对冲击波诱导的促血管生成和抗炎信号进行早期评估。
流程与工作流整合
该方法适用于早期发现阶段，可在进入先导化合物筛选和临床前药效学测试之前，通过机制性研究支持靶点验证。
- Discovery Biology：促进对冲击波对内皮细胞基因表达及分泌谱影响的假设驱动型研究。
- Screening：提供可重复、定量的分子检测结果，对检测方法标准化及跨实验比较至关重要。
- Analytics：支持对基因上调（如 Tie2）和细胞因子升高（IL-6、IL-8）进行统计学分析，以确定显著的生物学响应。
- Translational Research：将体外力学转导观察结果与体内已知的血管生成和炎症过程相联系。
- Enterprise Reuse：提供一个可灵活调整的平台，适用于内皮模型以外的多种细胞类型，以拓展通路探索范围。
运营与企业影响
- 科学价值：通过减少冲击波递送过程中物理伪影带来的噪声，提高靶点验证的预测可信度。
- 操作价值：通过可控的波传播，增强不同实验室和实验之间的可重复性与标准化水平。
- 战略价值：通过明确物理刺激与细胞响应之间的机制关联，提升“推进/终止”决策的质量。
- 项目组合影响：通过阐明生物学效应的阈值，实现对基于冲击波策略的风险调整后优先排序。
实施注意事项
- 需要具备细胞培养维护、无菌操作技术和冲击波设备操作的专业知识。
- 依赖于冲击波源、温度控制水浴装置以及用于声学耦合的超声耦合剂的可及性。
- 为确保冲击波聚焦的一致性，必须对培养瓶定位、耦合剂涂抹及环境控制进行标准化。
- 在将该模型应用于不同细胞类型或培养容器时，需考虑相应的适应性调整。
- 由于需要在不同细胞系中验证生物学反应，以确认力传导研究结果的普适性，因此存在局限性。
生物制药常见问题
Chapters in this video
0:05
Title
1:22
Preparation of Water Bath for In Vitro Shock Wave Trials
1:59
Cell and Culture Flask Preparation
2:53
Application of Shock Waves to the Water Bath
3:47
Cell Analysis Post-shock Wave Treatment
4:27
Results: Shock Wave Treatment of Human Umbilical Vein Endothelial Cells
5:03
Conclusion
