Name: 冲击波应用细胞培养 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-08T18:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 39 s
Description: 了解体外冲击波细胞培养技术，通过水浴加热和超声凝胶耦合实现精准治疗定位。该方法利用实时PCR和细胞因子阵列分析基因表达变化，为再生医学研究提供可重复实验模型。

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作者感谢 Reiner Schultheiss 和 Wolfgang Schaden 为本模型提供的灵感。我们还要感谢 Christian Dorfmüller 始终如一地大力支持我们的研究工作。
非常感谢 Robert Göschl 和 Hans Hohenegger 对我们想法的细致技术实现！

伦理许可
在获得患者的书面知情同意后，从妇产科剖宫产手术中获取脐带，用于分离人脐静脉内皮细胞（HUVECs）。该研究已获得因斯布鲁克医科大学伦理委员会的批准（编号：UN4435）。
1. 准备IVSWT水浴
<ol>
	<li>在合适的容器中准备 3.5 L&#160;自来水。水需加热至 37 °C（参见方案 6）。</li>
	<li>将水注入水浴箱，直至水位距离边缘约 3 cm。注意确保水完全覆盖膜。这大约需要准备好的 3.5 L 水。</li>
	<li>将温度传感器连接至电源。</li>
	<li>将传感器插入水浴箱后壁的指定接口中。</li>
	<li>将加热装置连接至温度传感器的电源。切勿在水浴无水时进行此操作，否则加热器会熔化有机玻璃。</li>
	<li>等待水温达到稳定的 37 °C。定期用某种棒状物搅拌水，以确保水浴内温度均匀一致。</li>
</ol>
2. 准备细胞和培养瓶
<ol>
	<li>在T25培养瓶中以所需密度接种细胞，过夜培养；或直接在培养瓶中培养细胞，直至达到所需的汇合度。</li>
	<li>实验前，将培养瓶垂直放置。</li>
	<li>向培养瓶中加入培养基，液面加至瓶颈下方即可。切勿加入过多培养基，避免培养基接触瓶颈或封口帽导致污染。</li>
	<li>使用无滤膜的实心盖将培养瓶拧紧，以防止水污染。注意水浴中的水及水浴设备本身并非无菌。</li>
	<li>将培养瓶盖用Parafilm封口膜密封，然后再放入水浴中。</li>
	<li>将已密封的培养瓶固定在提供的支架上。</li>
	<li>将固定好的培养瓶放入水浴中。注意使细胞培养瓶的中部与冲击波施加装置的膜中心处于同一高度，水浴侧边的标记线可作为参考。</li>
</ol>
3. 定义处理参数
<ol>
	<li>确定冲击波源与样品之间的距离。通过开展参数探索预实验（如图6所示）来确定最佳处理参数。</li>
	<li>在冲击波设备上选择合适的处理参数（能量流密度、频率）。同样，请参考图6。</li>
</ol>
4. 冲击波应用
<ol>
	<li>在冲击波换能器以及水浴膜上涂抹足量的商品化超声传导凝胶，以确保良好的耦合。换能器与膜之间不得存在空气或气泡，否则会吸收冲击波。</li>
	<li>将换能器连接至膜上，并稳定地固定在膜的中央位置，注意保持其水平对齐。</li>
	<li>确保探头在水浴中的垂直位置与水浴侧壁所示标记对齐。</li>
	<li>保持换能器中心与培养瓶中心处于同一水平线上，并固定稳定。</li>
	<li>启动冲击波装置，并在操作全程中保持培养瓶和换能器位置稳定，同时施加脉冲。</li>
</ol>
5. 处理后
<ol>
	<li>将培养瓶从水浴中取出。</li>
	<li>用普通纸巾将其擦干。</li>
	<li>用消毒剂仔细擦拭培养瓶表面。</li>
	<li>移除封口的Parafilm膜和瓶盖。</li>
	<li>用移液器将培养瓶内的培养基转移至离心管中。</li>
	<li>进行适当离心。离心参数取决于所使用的细胞类型，e.g. 对于HUVECs，使用290 g室温离心。</li>
	<li>向培养瓶中加入5 ml细胞培养基。用2 ml细胞培养基重悬离心后的细胞沉淀，将细胞悬液移入培养瓶中。这样可避免在处理过程中脱落的细胞碎片或细胞丢失。</li>
</ol>
注意事项
<ol>
	<li>制备及处理过程均应在层流罩内的无菌条件下进行，以避免细胞培养污染。</li>
	<li>建议遵循良好的细胞培养操作规范，以避免探针污染。特别是将培养瓶放回培养箱前，强烈建议对其外表面进行消毒。水浴箱及其内部的水均非无菌！</li>
	<li>除非水浴箱已加水，否则请勿将加热器连接至电源，以免损坏由聚甲基丙烯酸甲酯（Plexiglas）制成的水浴装置。</li>
	<li>在冲击波施加器上使用足量的超声耦合凝胶，以确保与水浴之间良好耦合及冲击波的有效传播。空气甚至微小气泡均会吸收冲击波！</li>
	<li>检查探针在水浴中的位置与施加器的相对关系，以确保整个生长区域均被处理。</li>
	<li>切勿将探针浸入水中过深，以免造成污染。</li>
</ol>

<ol><li>Haupt, G., Haupt, A., Ekkernkamp, A., Gerety, B., Chvapil, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+shock+waves+on+fracture+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Urology%22%5BJournal%5D)">Influence of shock waves on fracture healing.</a> Urology. 39, 529-532 (1992).</li>
<li>Schaden, W., Fischer, A., Sailler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracorporeal+shock+wave+therapy+of+nonunion+or+delayed+osseous+union%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Orthop.+Relat.+Res%22%5BJournal%5D)">Extracorporeal shock wave therapy of nonunion or delayed osseous union.</a> Clin. Orthop. Relat. Res. 387, 90-94 (2001).</li>
<li>Schaden, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shock+wave+therapy+for+acute+and+chronic+soft+tissue+wounds%3A+a+feasibility+study%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Surg.+Res%22%5BJournal%5D)">Shock wave therapy for acute and chronic soft tissue wounds: a feasibility study.</a> J. Surg. Res. 143, 1-12 (2007).</li>
<li>Tepeköylü, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shock+wave+treatment+induces+angiogenesis+and+mobilizes+endogenous+CD31%2FCD34-positive+endothelial+cells+in+a+hindlimb+ischemia+model%3A+Implications+for+angiogenesis+and+vasculogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Thorac.+Cardiovasc.+Surg%22%5BJournal%5D)">Shock wave treatment induces angiogenesis and mobilizes endogenous CD31/CD34-positive endothelial cells in a hindlimb ischemia model: Implications for angiogenesis and vasculogenesis.</a> J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 146, 971-978 (2013).</li>
<li>Nishida, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracorporeal+cardiac+shock+wave+therapy+markedly+ameliorates+ischemia-induced+myocardial+dysfunction+in+pigs+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Extracorporeal cardiac shock wave therapy markedly ameliorates ischemia-induced myocardial dysfunction in pigs in vivo.</a> Circulation. 110, 3055-3061 (2004).</li>
<li>Fukumoto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracorporeal+cardiac+shock+wave+therapy+ameliorates+myocardial+ischemia+in+patients+with+severe+coronary+artery+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Coron.+Artery+Dis%22%5BJournal%5D)">Extracorporeal cardiac shock wave therapy ameliorates myocardial ischemia in patients with severe coronary artery disease.</a> Coron. Artery Dis. 17, 63-70 (2006).</li>
<li>Gotte, G., Amelio, E., Russo, S., Marlinghaus, E., Musci, G., Suzuki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short-time+non-enzymatic+nitric+oxide+synthesis+from+L-arginine+and+hydrogen+peroxide+induced+by+shock+waves+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Short-time non-enzymatic nitric oxide synthesis from L-arginine and hydrogen peroxide induced by shock waves treatment.</a> FEBS Lett. 520, 153-155 (2002).</li>
<li>Wang, F. S., Wang, C. J., Huang, H. J., Chung, H., Chen, R. F., Yang, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+shock+wave+mediates+membrane+hyperpolarization+and+Ras+activation+for+osteogenesis+in+human+bone+marrow+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Physical shock wave mediates membrane hyperpolarization and Ras activation for osteogenesis in human bone marrow stromal cells.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 287, 648-655 (2001).</li>
<li>Mittermayr, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracorporeal+shock+wave+therapy+%28ESWT%29+minimizes+ischemic+tissue+necrosis+irrespective+of+application+time+and+promotes+tissue+revascularization+by+stimulating+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Surg%22%5BJournal%5D)">Extracorporeal shock wave therapy (ESWT) minimizes ischemic tissue necrosis irrespective of application time and promotes tissue revascularization by stimulating angiogenesis.</a> Ann. Surg. 253, 1024-1032 (2011).</li>
<li>Baker, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+the+mouse+aortic+ring+assay+to+study+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Use of the mouse aortic ring assay to study angiogenesis.</a> Nat. Protoc. 22, 89-104 (2011).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

所提出模型的重要性在于 体外 冲击波治疗的优势在于，与现有模型不同，声波在穿过细胞培养物后仍可继续传播，从而避免了张力等干扰性物理效应。该模型更接近于 体内 比其他直接将波应用于细胞培养瓶的方法具有更温和的条件。
另一个优势在于可以调节冲击波源与细胞之间的距离。如果直接处理培养瓶，则无法实现这一点。然而 体内 根据目标组织所处的深度，施加器与目标区域之间的距离存在一定差异。同时，可以研究细胞相对于波焦点处于特定位置时所受到的影响。
开展初步实验
根据我们对心肌细胞、内皮细胞、成纤维细胞和干细胞的操作经验，每种细胞类型都需要其特定的治疗参数。因此，我们强烈建议在开展目标实验之前，先进行预试验以确定合适的处理参数。该预试验应包括冲击波施加器与样品之间的不同距离、不同的能量流密度，以及确定最适宜的脉冲次数。冲击波应用频率的问题仍存在争议——即使 体内. 一项用于治疗参数探索性试验的合适方案作为补充材料提供 <st...

冲击波是由能量突然释放而产生的声压波，例如闪电时产生的雷声。在医学领域，冲击波已应用超过30年&#160;，用于体外冲击波碎石术（Lithotripsy）以粉碎肾结石。自20世纪80年代初偶然发现接受碎石术的患者髂骨增厚以来，研究人员首次开展了评估冲击波治疗（SWT）对骨愈合影响的研究1。观察到冲击波治疗显著改善了长骨骨不连的愈合效果2。随后，其适应证被扩展至软组织创面3。基础研究结果表明，冲击波可在不造成后续组织损伤的情况下，对靶组织产生生物学刺激作用。冲击波可诱导促血管生成生长因子（例如 VEGF、PlGF、FGF）的释放，进而引发显著的血管生成。这促使冲击波治疗的适应证进一步扩展至缺血性疾病。我们课题组及其他研究团队已在动物模型和临床试验中证实了SWT对缺血性心脏病具有积极治疗作用4-6。
然而，冲击波治疗（SWT）的物理刺激如何转化为生物信号（即机械转导）的具体机制仍 largely 未知。随着医学多个领域对 SWT 的兴趣持续增加，对其作用机制的探索也日益深入。因此， 在&#160;体外 冲击波实验正变得越来越重要。除了减少动物实验和具有成本效益外，其最大的优势在于 在&#160;体外 体外冲击波治疗（IVSWT）可能为研究特定细胞类型的特异性行为提供可能性。在冲击波介导的组织再生过程中，很可能所有被治疗组织中的细胞均参与其中，甚至存在系统性效应的讨论。然而，每种细胞类型均发挥特定作用并具有其固有的功能。IVSWT使我们能够识别这种特定功能，从而更深入地理解其复杂的内在机制。
目前关于冲击波对细胞培养影响的研究表明，冲击波可促进细胞增殖，改变细胞膜受体，增强并加速细胞分化，促进生长因子和趋化因子的释放，以及增加细胞迁移能力7-9。
大多数干扰性的物理效应 在&#160;体外 模型 已有多种将冲击波作用于细胞培养物的方法被报道。这一事实导致了一个问题，即由于不同模型中细胞刺激的物理条件差异较大，研究结果很难进行比较。总体而言，所有现有模型均致力于如何将冲击波最优地施加于细胞。
然而，仍有一个问题尚未解决：声波在穿过细胞培养物后会发生什么变化？主要问题在于，细胞培养基与周围空气的声阻抗差异极大，导致超过99%的冲击波被反射图1。
由于两种介质的声阻抗不同，声波不仅会发生反射，还会产生180°的相位偏移，从而对细胞施加强大的拉伸力图2。
声阻抗定义为材料密度与其声速的乘积，即 Z = ρ × c。水的声阻抗为 ZWater = 1,440,000 Ns/m3，对于空气则仅为 420 Ns/m3这两个数值的巨大差异会导致激波的反射和相位移动。这种相位移动使正压脉冲转变为拉伸波。
即使这种拉力对细胞无害，它也会干扰模拟的设想 体内 冲击波效应 体外. 在体 由于体型结构较大，这些拉伸力几乎不会产生。
此外，反射的行波甚至可能干扰入射波，从而引起干涉现象。目前已知有两种类型的干涉：相长干涉是指两列波叠加，导致振幅加倍&#160;图3；当两列波以完全相反的相位相遇时，则发生相消干涉，导致波被抵消（图3）。因此，体外冲击波治疗（IVSWT）需要一种模型，以允许冲击波在穿过细胞培养层后继续传播。
IVSWT 水浴
基于上述考虑，我们设计了一种水浴装置，以避免前述问题（见图4）。该装置主要由一个有机玻璃制成的容器构成，其上设有膜结构，可用于连接各种冲击波发生器。在该膜与发生器之间需使用超声耦合凝胶进行耦合。水浴中需填充脱气水，以防止水中溶解气体引发空化效应。容器底部配有加热器，并连接温度传感器和控制单元，可调节温度以模拟体内环境，避免实验过程中细胞培养物温度下降。温度可稳定维持在37摄氏度，与培养箱中的条件一致。样品支架可用于浸没各种类型的培养瓶或试管。需注意，样品容器必须完全充满培养基，因为气泡会阻碍冲击波的传播。水浴后壁设有楔形吸能材料，用于吸收并消除冲击波，防止其反射回传造成干扰。
与其他体外冲击波治疗（IVSWT）模型相比，另一个优势在于可以调节施加器与培养瓶之间的距离。我们团队及其他使用该模型的研究者的研究结果均明确表明，每种细胞类型对不同的处理参数均表现出高度特异性的反应。此外，明确定义波源与样品之间距离至关重要，因为这使我们能够控制细胞相对于冲击波施加器焦点的特定位置。

<table><tbody><tr><td>Orthogold 冲击波治疗仪</td><td>组织再生技术公司，伍德斯托克，佐治亚州 &amp;ndash; 由德国康斯坦茨 MTS-Europe GmbH 公司生产</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IVSWT 水浴锅 V2.0</td><td>约翰·霍亨内格 - 技术产品</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EBM-2 基础培养基 500 mL + EGM-2 SingleQuot 添加剂 &amp;和生长因子</td><td>Lonza</td><td>CC-3156 &amp;& CC-4176</td><td>该培养基用于图示实验中HUVECs的培养，以铺满细胞培养瓶。对于其他细胞类型，请使用推荐的培养基。</td></tr><tr><td>&lt;a href=&quot;http://www.labplanet.com/pechiney-parafilm-m-pm996.html">Pechiney&amp;nbsp;Parafilm M PM996&lt;/a&gt;</td><td>佩秦尼塑料包装</td><td>PH-LF-PM996-EA 在 labplanet.com</td><td>用于密封烧瓶</td></tr><tr><td>Falcon 血清移液管 25 ml</td><td>Becton Dickinson 实验室耗材</td><td>357525</td><td></td></tr><tr><td>CellMate II 血清移液管&amp;nbsp;</td><td>Matrix Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Skintact 超声耦合凝胶</td><td>Skintact</td><td>UL-01 250 ml</td><td></td></tr><tr><td>T25 细胞培养瓶</td><td>COSTAR</td><td>3056</td><td></td></tr><tr><td>Mikrozid 消毒剂</td><td>施&amp;uuml;lke</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3.5 L 脱气水</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>纸巾</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

冲击波在细胞培养中的应用

Shock Wave Application to Cell Cultures

如今，冲击波因其再生效应而广为人知。基础研究结果表明，冲击波可在不造成后续损伤的情况下，对靶细胞或组织产生生物学刺激。因此， 体外 实验正受到越来越多的关注。已有多种将冲击波施加于细胞培养物的方法被报道。总体而言，所有现有模型均聚焦于如何将冲击波最优地施加到细胞上。
然而，仍有一个问题尚未解决：冲击波穿过细胞培养物后会发生什么？由于细胞培养基与周围空气的声阻抗差异极大，超过99%的冲击波会被反射！因此，我们开发了一种模型，主要由一个聚甲基丙烯酸甲酯（Plexiglas）制成的容器构成，使冲击波在穿过细胞培养物后能在水中继续传播。该设计可避免空化效应，同时防止冲击波反射，从而干扰后续波形。利用此模型，我们能够模拟 体内 条件，从而逐步深入了解冲击波的物理刺激如何转化为生物细胞信号（“机械转导”）&#34;).

采用所述方法，我们将冲击波作用于人脐静脉内皮细胞（HUVECs），这些细胞系此前从脐带中分离获得。脐带来源于择期剖宫产手术。
在T25细胞培养瓶中，当HUVECs细胞融合度达到90%时，使用电液冲击波治疗系统进行处理。治疗参数为能量流密度0.1 mJ/mm2，频率5 Hz。从冲击波源至细胞层距离为5 cm处施加300次脉冲。
通过实时PCR分析检测了Tie-2（含免疫球蛋白样和EGF样结构域的酪氨酸激酶2）mRNA的基因表达。与对照组（CTR: 100.03±7.5）相比，Tie-2表达在冲击波治疗（SWT）后随时间显著上调（SWT后2小时：156.75±14.49；4小时：141.03±9.71；6小时：166.68±2.15；p&lt;0.05）图5B。该血管生成素受体可直接提示内皮细胞增殖，并作为其血管生成能力的指标。作为阳性对照，我们使用了Poly (I:C)（聚肌苷酸-聚胞苷酸），其作为一种RNA结构类似物，已知可刺激内皮细胞（SWT后2小时：125.7±10....

如今，冲击波因其再生效应而广为人知。 体外 实验正受到越来越多的关注。因此，我们建立了一种模型 体外 体外冲击波治疗（IVSWT）试验，使我们能够模拟 体内 条件，从而避免干扰性的物理效应。

如今，冲击波因其再生效应而广为人知。基础研究结果表明，冲击波确实能够引起一种生物刺激，从而……

本实验方案的总体目标是避免体外冲击波治疗过程中产生干扰性的物理效应，以获得可重复的实验结果。实现该目标的第一步是将细胞培养瓶完全注满培养基，然后将培养瓶放入恒温水浴中。第二步是在将治疗头与水浴耦合时，使用足量的超声耦合凝胶。接下来，将施用器水平放置于水浴的膜上。最后一步是确保冲击波源与细胞培养瓶的中心对齐，从而使细胞位于波的焦点范围内。最终，可对细胞进行分析，例如通过实时PCR和细胞因子阵列来检测目标基因和细胞因子的改变情况。我们最初产生这一模型的想法，是因为注意到现有的将短波直接施加于细胞培养物的方法并未考虑培养基与周围空气交界处波反射的影响。本次实验操作将由我研究团队的博士生 Chante 博士演示。首先，将 3.5 升自来水加热至 37 摄氏度。然后将加热的水转移至水浴中。水位应低于水浴顶部三厘米，并完全覆盖膜。接下来，将温度传感器连接至电源，并将温度传感器放入水浴后壁的接口中。然后在搅拌水的同时，持续将加热器连接至电源，将水加热至稳定的 37 摄氏度。在无菌条件下，将细胞接种于 T25 培养瓶中。因此，经过过夜培养后，细胞将达到90%的汇合度。随后将培养瓶垂直放置，并加入培养基至培养瓶颈部底部，以避免污染。注意不要让培养基接触培养瓶的颈部或瓶盖。接下来，用不带滤膜的实心盖子盖紧锥形瓶，以防止水浴中的水造成污染。然后用聚甲醛密封瓶盖。密封完成后，将锥形瓶用夹子固定在支架上。然后将固定的培养瓶插入水浴中，并使细胞培养瓶的中部与冲击波发生器膜的中心对齐。在冲击波发生器及其水浴膜表面涂抹足量的超声耦合凝胶，随后将发生器与膜连接，确保两者之间无气泡存在。接下来，将冲击波治疗头置于膜的中心位置，并确保其在水平和垂直方向上与细胞培养瓶对齐，以保证整个细胞生长区域均得到处理。然后进行预实验，以确定冲击波治疗头与培养瓶之间的理想距离，以及设定正确的处理参数。在激活冲击波设备期间，务必保持培养瓶和治疗头处于稳定位置。确定理想距离后，按照所需的冲击波处理参数进行实验。冲击波处理完成后，将细胞培养瓶从水浴中取出，用纸巾擦干，并对培养瓶外表面进行消毒。接着，将培养瓶中的培养基转移至离心管中。在常规离心参数下收集细胞沉淀。将细胞沉淀重悬于两毫升细胞培养基中，然后将细胞悬液转移回含有五毫升细胞培养基的培养瓶中，培养细胞至细胞分析实验所需的汇合度。人脐静脉内皮细胞的实时PCR分析显示，经过冲击波处理后，tie2 mRNA水平上调。这表明冲击波治疗可促进内皮细胞增殖并诱导血管生成。通过细胞因子阵列对脐静脉内皮细胞中的细胞因子水平进行定量分析。两种炎症性细胞因子IL-6和IL-8也显著升高，二者均参与血管生成过程发展后的炎症反应。该技术为冲击波基础科学领域的众多研究人员探索体外实验中单细胞类型的影响铺平了道路。我们希望说服更多研究人员采用此模型，以在冲击波科学研究中获得可重复且可比较的结果。

Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

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冲击波在细胞培养中的应用

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