4D 共聚焦延时成像后的样本漂移校正

延时显微镜技术可实现对发育过程、生长或样本在图像采集期间发生的漂移现象进行可视化观察。图像采集可能导致无法持续追踪或监测细胞运动。以下方案中，我们采用开源图像处理软件来校正随时间发生的三维漂移。

在不同焦平面上捕获一系列光学切片，可实现样本三维模型的构建。通过创建一系列随时间变化的三维数据集，可进一步扩展为四维成像。在长期的时间序列实验中，常可观察到样本发生移动。

这可能是由于控制载物台的硬件存在滑动误差以及焦平面位置偏移所致；而在其他情况下，则是由于样品生长或封片介质内部的柔性所引起的漂移。目前已有方法通过改进硬件聚焦系统和提高封片介质的刚性来补偿并限制此类移动。然而，在许多情况下，这些方法无法应用，因为成像装置需要满足样品维持与生长所需的适宜条件，从而难以进行校正。针对样品漂移问题，我们开发了一款插件，可用于开源图像处理平台Fiji。

我们的正确3D漂移插件能够建立相位相关配准，以校正多通道实验中三维延时成像时因旋转或样本漂移所引起的运动。该正确3D漂移插件利用一个通道来确定所需的校正参数，然后将此校正应用于其他所有附加通道，从而实现对四维数据集的配准。

开源的免费网络软件包。Fiji 是 ImageJ 程序的一个发行版分支，包含预安装的插件，可用于对显微镜实验采集的数据执行多种处理操作。Fiji 提供了更简便的插件架构，并在默认安装中包含这些功能。

安装完成后，打开 Fiji。Fiji 支持导入大量专有的显微镜图像格式。这可以通过拖放操作或通过用户在开放显微镜环境（Open Microscopy Environment）中实现。我们将使用正确的三 EG 插件副本进行此分析。

生物格式导入插件。如果数据集超过系统安装内存的大小，请将图像文件作为虚拟堆栈打开，并选择内存管理选项。本分析所使用的数据集来自对ACTA1-GFP转基因斑马鱼进行的三维时间序列实验，其中GFP在骨骼肌中表达。

为了可视化细胞核，将该转基因品系注射了核定位的 M cherry，以更好地呈现这些荧光信号。我们可以通过颜色通道工具调整每个通道的查找表。在采集的时间序列过程中，该斑马鱼样本似乎在视野中发生了漂移。为校正此漂移，可在 Fiji 软件的插件菜单下的“注册”子菜单中打开“校正 3D 漂移”插件。

在样本中广泛表达或在图像采集期间不参与市场事件的标记物是进行漂移校正的最佳来源。在本示例中，通道一中的 ACTA1，即 GFP 荧光信号。如果您的系统内存有限，请选择虚拟堆栈选项，并运行 Correct 3D drift 插件。

校正后的数据集相比原始数据集将具有更大的画布尺寸，以适应样本的移动。生成光学切片的最大投影图像，可以比较校正前后样本中已被去除的漂移情况。

最大强度投影消除了数据集的维度，但作为一种快速检查漂移校正结果的有效方法。在此，我们看到了每个时间点在其校正后和未校正的数据集中的最大投影图像。当将该延时实验投影为单幅图像时，即使在短时间的延时实验中也可能发生的漂移量变得明显可见。

通过校正样本某一通道的漂移所进行的修正，将同时应用于该图像堆栈中包含的所有其他通道。若系统内存有限，漂移校正的流程会略有不同。请在“文件”格式的“导入”菜单以及“校正3D漂移”插件的弹出菜单中，选择“使用虚拟堆栈”选项。

选择此选项后，系统将提示您选择一个位置，插件可将延时实验中每个通道切片和时间点的单个图像文件导出到该位置。生成的虚拟堆栈包含与我们之前示例相同的漂移校正。如果打开所选的保存位置，您将看到生成的各个图像序列文件。

要打开此文件集合，请使用图像序列导入工具。生成的文件将不会分离通道、光学切片或时间点。为了可视化这些特征，请根据日志文件中的数据将图像堆栈转换为多维堆栈，并输入通道数、光学切片数以及采集的时间点数。我们可以再次调整查找表，以改变延时实验所显示的颜色。

本方案可校正不同时间点之间的漂移，但无法校正单个时间点采集过程中发生的漂移。我们建议采用优化的成像参数，以缩短每个时间点的采集时间。利用后期处理软件校正漂移的能力，可对原本因样品漂移而难以观测和测量的细胞运动进行分析与定量。