Name: 样品漂移校正继4D共焦时间推移成像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-12T22:35:00.000+00:00
Duration: 10 min 4 s
Description: 学习使用开源图像处理软件Fiji进行三维样品漂移校正，实现四维共聚焦时间推移成像。该方法可准确追踪细胞运动，生成三维模型，适用于斑马鱼发育生物学研究。

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我们感谢 Gaby Martins 以及 EMBO2010 3D 发育成像研讨会的组织者，本工作的起点即在此；同时感谢所有为 Fiji 和 ImageJ 项目做出贡献的人员。

1.&#160;4D 时间序列成像实验
图像采集所使用的设置将根据所用设备的不同而有所差异。共聚焦显微镜对样品进行光学切片的能力取决于多个因素：激发光波长、针孔大小、物镜的数值孔径、样品本身的折射率以及样品所处介质的折射率。所选择的共聚焦针孔大小将决定所采集光学切片的厚度。较小的针孔可产生更薄的光学切片，从而提高z轴分辨率，但会减少捕获的光量；较大的针孔则会增加光学切片的厚度，降低z轴分辨率，但可增加捕获的光量。
在进行校正之前采集 4D 数据时，还需考虑以下因素：
<ol>
	<li>优化扫描速度，以消除或限制在单个时间点采集过程中的漂移。因此，图像采集所需时间应仅为时间点之间间隔的一小部分。</li>
	<li>完全重复的结构或网格不适合作为配准的参考结构，因为无法确定所需的校正量。随机分布的微珠或不规则结构可实现明确无误的配准。</li>
	<li>若预期存在漂移，应扩大扫描区域以及上下焦距范围，以确保感兴趣区域始终保留在图像序列中。</li>
	<li>除确保具备适当的空间分辨率以分辨目标结构外，还应设置采样率，以提供对所研究动态事件的时间分辨率。 
	注意：因此，图像时间点之间的时间间隔至少应为周期性重复事件时间间隔的一半，对于非周期性事件则应进一步缩短。</li>
</ol>
2.&#160;打开共聚焦图像数据集
开源软件 Fiji 是 ImageJ 程序的一个发行版本，其中包含预安装的插件，可用于对显微镜实验采集的数据执行多种处理操作。该软件提供了更便捷的插件更新架构，并内置了本实验方案所使用的 Correct 3D drift 插件。通过使用开放显微镜环境（Open Microscopy Environment）的 Bio-Formats 导入插件，该软件支持导入多种专有的显微镜图像格式。
<ol>
	<li>安装 Fiji 程序（http://fiji.sc/Downloads）。</li>
	<li>使用 LOCI Bio-Formats 导入插件加载获取的数据集。</li>
	<li>如果数据集大于程序分配的内存，请在内存管理部分中选择 &#34;使用虚拟堆栈选项&#34;。</li>
</ol>
3.&#160;在后期处理中校正三维物体的漂移
在长时间延时实验过程中，即使样品已被包埋，仍可能发生位移。为了校正任何移动，并使得所成像的迁移事件能够被分析，可对图像进行后期处理。所有图像后期处理步骤必须在基于本工作所开展的分析方法部分中予以明确描述。
<ol>
	<li>数据集加载完成后，运行“校正3D漂移”插件。</li>
	<li>如果存在多个图像通道，请选择用于图像配准的通道。理想情况下，该通道应代表样本中静态的结构，而非迁移性或可移动的成分。然而，若无法实现，则应选择移动最少的通道。</li>
	<li>如果用于分析的系统可用内存小于原始数据集大小的两倍，请勾选“使用虚拟堆栈”选项。这将使配准后的超堆栈以图像序列形式输出，而非保存在内存中。
	<ol>
		<li>选择插件输出单个校正后图像文件的文件夹。每个通道在每个z位置都将生成一个独立的图像文件。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>插件随后将对每个时间点进行两两相位相关分析，以确定所需的校正参数，并将其应用于整个数据集。</li>
</ol>

<ol><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Abramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image+Processing+with+ImageJ%5BTitle%5D)+AND+%22Biophotonics+International%22%5BJournal%5D)">Image Processing with ImageJ.</a> Biophotonics International. 11 (7), 42-42 (2004).</li>
<li>Collins, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ImageJ+for+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">ImageJ for Microscopy.</a> BioTechniques. 43 (S1), 25-30 (2007).</li>
<li>Linkert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metadata+matters%3A+access+to+image+data+in+the+real+world%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Metadata matters: access to image data in the real world.</a> The Journal of Cell Biology. 189 (5), 777-782 (2010).</li>
<li>Thévenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+transactions+on+image+processing+%3A+a+publication+of+the+IEEE+Signal+Processing+Society%22%5BJournal%5D)">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE transactions on image processing : a publication of the IEEE Signal Processing Society. 7 (1), 27-41 (1998).</li>
<li>Kuglin, C. D., Hines, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+phase+correlation+image+alignment+method%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+IEEE%2C+International+Conference+on+Cybernetics+and+Society%22%5BJournal%5D)">The phase correlation image alignment method.</a> Proceedings of the IEEE, International Conference on Cybernetics and Society. , 163-165 (1975).</li>
<li>Preibisch, S., Saalfeld, S., Tomancak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Globally+optimal+stitching+of+tiled+3D+microscopic+image+acquisitions%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Globally optimal stitching of tiled 3D microscopic image acquisitions.</a> Bioinformatics. 25 (11), Oxford, England. 1463-1465 (2009).</li>
<li>Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multilayer+mounting+enables+long-term+imaging+of+zebrafish+development+in+a+light+sheet+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope.</a> Development. 139 (17), Cambridge, England. 3242-3247 (2012).</li>
<li>Andersen, E., Asuri, N., Clay, M., Halloran, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+cell+motility+and+actin+cytoskeleton+of+individual+neurons+and+neural+crest+cells+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J+VIs.+Exp%22%5BJournal%5D)">Live imaging of cell motility and actin cytoskeleton of individual neurons and neural crest cells in zebrafish embryos.</a> J VIs. Exp. (36), (2010).</li>
<li>Eisenhoffer, G. T., Rosenblatt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+cell+extrusion+from+the+epidermis+of+developing+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Live imaging of cell extrusion from the epidermis of developing zebrafish.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (52), (2011).</li>
<li>Benard, E. L., vander Sar, A. M., Ellett, F., Lieschke, G. J., Spaink, H. P., Meijer, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infection+of+zebrafish+embryos+with+intracellular+bacterial+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (61), (2012).</li>
<li>Nguyen-Chi, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenesis+and+Cell+Fate+Determination+within+the+Adaxial+Cell+Equivalence+Group+of+the+Zebrafish+Myotome%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Morphogenesis and Cell Fate Determination within the Adaxial Cell Equivalence Group of the Zebrafish Myotome.</a> PLoS Genetics. 8 (10), (2012).</li>
<li>Moore, C. A., Parkin, C. A., Bidet, Y., Ingham, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+the+Myoblast+city+homologues+Dock1+and+Dock5+and+the+adaptor+proteins+Crk+and+Crk-like+in+zebrafish+myoblast+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A role for the Myoblast city homologues Dock1 and Dock5 and the adaptor proteins Crk and Crk-like in zebrafish myoblast fusion.</a> Development. 134 (17), Cambridge, England. 3145-3153 (2007).</li>
<li>Higashijima, S., Okamoto, H., Ueno, N., Hotta, Y., Eguchi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-frequency+generation+of+transgenic+zebrafish+which+reliably+express+GFP+in+whole+muscles+or+the+whole+body+by+using+promoters+of+zebrafish+origin%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">High-frequency generation of transgenic zebrafish which reliably express GFP in whole muscles or the whole body by using promoters of zebrafish origin.</a> Developmental Biology. 192 (2), 289-299 (1997).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

我们利用后期处理软件校正长时间延时显微镜实验所获得数据集的样本漂移的能力，受到多种因素的限制。区分漂移与样本迁移运动的能力取决于所使用的细胞标记物。在样本中广泛表达、或在图像采集过程中不参与迁移事件的细胞标记物，是进行漂移校正的最佳依据。该插件使用单一通道来比对不同时间点之间的运动，并将此比对结果应用到所采集图像的所有其他通道中。因此，在感兴趣样本中使用两种荧光标记物可能更具优势：一种用于标记需要追踪的细胞或结构，另一种用于标记在实验过程中预期不会发生迁移（仅随整体漂移）的结构。虽然该配准方法也可应用于单通道数据集，但在这种情况下，图像中的大部分信号应为静止的，仅有小部分信号预期会发生移动。如果在不同时间点之间图像中有较大比例的区域发生移动，则这些移动将与漂移一同被校正，从而导致所测得的运动量被低估。
本方案假设在每个单独时间点的首尾光学切片之间不存在任何移动。若单个时间点内发生漂移，则无法在不假设被扫描物体形状的前提下进行校正。理想情况下，用于图像采集的实验参数应尽可能限制每个时间点内发生的移动。因此，采集图像序列所需的时间应尽可能短。单个时间点采集的总时长应远小于相邻时间点之间...

共聚焦成像技术广泛应用于细胞生物学和发育生物学中，用于追踪细胞运动及形态变化。通过在不同焦平面上获取一系列光学切片，可构建样本的三维（3D）模型，并进一步通过生成一系列时间推移的3D数据集，扩展为四维（4D）图像。4D数据集的建立使得对细胞运动和行为的详细测量成为可能。在长期的时间推移实验中，常可观察到样本发生位移。这种位移可能由控制载物台和焦平面位置的硬件存在微小误差所致；而在其他情况下，则可能是由于样本生长或封片介质本身的柔韧性所引起的移动。目前已有一些方法可用于补偿或限制此类位移，例如改进硬件聚焦系统或提高封片介质的刚性。然而，在许多情况下，这些方法无法应用，因为成像系统需满足维持样本生存和生长所需的特定条件。已有开源软件可通过ImageJ或Fiji中的StackReg和TurboReg（http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/）5插件实现对时间序列中二维图像的运动校正，但这些方法无法应用于4D数据集。
为了校正样本漂移，我们开发了一个插件（Correct 3D drift），用于开源图像处理平台Fiji1。该插件能够执行相位相关配准，以校正三维延时实验中因样本漂移引起的运动。相位相关6是一种计算效率较高的方法，用于确定图像之间的平移关系。本文所述插件采用了Preibisch et al.&#160;7开发的相位相关算法库。在多通道实验中，该插件利用一个通道来确定所需的校正参数，然后将该参数应用于其他所有通道，从而实现对四维数据集的配准。&#160;
在斑马鱼模型系统中，可以进行持续数小时甚至数天的延时成像8。一种常用的斑马鱼样品固定方法是将麻醉后的活体胚胎包埋于低熔点琼脂糖（0.8–1.5%）中，以限制其运动9–11。尽管运动受到限制，样品仍会继续生长，导致视野中的细胞发生位置偏移。为了追踪胚胎内细胞的运动，必须首先校正整个样品的整体位移。本方案最初针对斑马鱼样本开发，已用于体节发育的成像研究12，但也可应用于任何4D共聚焦成像数据集。

<table><tbody><tr><td>甲磺酸三卡因（Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate, Tricaine）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>低凝胶温度琼脂糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9414-25G</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #4 镊子</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>0208-4-PO</td><td></td></tr><tr><td>一次性 3 ml 刻度移液管</td><td>Samco</td><td>212</td><td></td></tr><tr><td>聚乙烯转移移液管</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>9 cm 细菌级培养皿</td><td>Greiner Bio One</td><td>632180</td><td></td></tr><tr><td>氟化乙烯丙烯（Fluorinated ethylene propylene, FEP）管</td><td>Bola</td><td>S1815-04</td><td></td></tr><tr><td>蔡司 LSM-710 共聚焦显微镜</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>W Plan-Apochromat 20x/1.0 DIC 物镜</td><td>Zeiss</td><td>421452-9600-000</td><td></td></tr></tbody></table>

4d 共聚焦延时成像后的样本漂移校正

Sample Drift Correction Following 4D Confocal Time-lapse Imaging

生成四维（4D）共聚焦数据集（即随时间变化的三维图像序列）是一种用于捕捉发育过程中细胞行为的优秀方法学。&#160; 对细胞运动进行追踪的能力受限于样本在成像过程中因漂移或某些情况下的生长所引起的移动。在受漂移和/或生长影响的数据集中追踪细胞，会将这些样本运动引入对细胞位置的任何分析中，可能导致样本中静态结构出现虚假移动的假象。因此，在进行细胞追踪之前，应先校正样本漂移。利用开源的 Fiji 版本 1 &#160;ImageJ 2,3 及其集成的 LOCI 工具 4，我们开发了 Correct 3D drift 插件，用于消除共聚焦数据集中的错误样本移动。该方案通过相位相关法对四维共聚焦数据集的每个时间点进行配准，有效补偿样本的平移或焦平面位置的变化，同时保持在长时间延时实验中可视化和测量细胞运动的能力。

在发育中的斑马鱼中，快肌细胞从受精后19小时（20体节期）开始融合形成多核肌纤维13。为了观察细胞核的移动及肌细胞的融合过程，我们利用一种转基因品系进行4D共聚焦延时成像，该品系在骨骼肌α-肌动蛋白启动子的驱动下表达绿色荧光蛋白（GFP），以标记所有肌细胞14，同时注射编码红色荧光蛋白mCherry并携带核定位序列的RNA，以标记细胞核。将注射后的转基因胚胎包埋于低熔点琼脂糖中，每隔20分钟采集一次图像，每次获取71个光学切片，切片间隔为2.0 µm，持续成像2小时。在延时实验过程中观察到约7 µm的样本漂移，导致重叠图像模糊（图1A），并使细胞核在时间序列中呈现明显的位移（图1B）。应用该插件后可得到校正后的图像序列（图1C和图1D）。
<img alt="肌肉纤维的共聚焦显微镜图像；荧光染色，细胞结构分析。" fo:content-width="5in" fo...

延时显微镜可实现对发育过程的可视化观察。在图像采集过程中，样品的生长或漂移会降低准确追踪和测量发育期间细胞运动的能力。本文介绍了利用开源图像处理软件对样品随时间发生的三维漂移进行校正的方法。

4D 共聚焦延时成像后的样本漂移校正

四维（4D）共聚焦数据集的生成，即随时间变化的三维图像序列，提供了一种捕获……的优良方法

延时显微镜技术可实现对发育过程、生长或样本在图像采集期间发生的漂移现象进行可视化观察。图像采集可能导致无法持续追踪或监测细胞运动。以下方案中，我们采用开源图像处理软件来校正随时间发生的三维漂移。在不同焦平面上捕获一系列光学切片，可实现样本三维模型的构建。通过创建一系列随时间变化的三维数据集，可进一步扩展为四维成像。在长期的时间序列实验中，常可观察到样本发生移动。这可能是由于控制载物台的硬件存在滑动误差以及焦平面位置偏移所致；而在其他情况下，则是由于样品生长或封片介质内部的柔性所引起的漂移。目前已有方法通过改进硬件聚焦系统和提高封片介质的刚性来补偿并限制此类移动。然而，在许多情况下，这些方法无法应用，因为成像装置需要满足样品维持与生长所需的适宜条件，从而难以进行校正。针对样品漂移问题，我们开发了一款插件，可用于开源图像处理平台Fiji。我们的正确3D漂移插件能够建立相位相关配准，以校正多通道实验中三维延时成像时因旋转或样本漂移所引起的运动。该正确3D漂移插件利用一个通道来确定所需的校正参数，然后将此校正应用于其他所有附加通道，从而实现对四维数据集的配准。开源的免费网络软件包。Fiji 是 ImageJ 程序的一个发行版分支，包含预安装的插件，可用于对显微镜实验采集的数据执行多种处理操作。Fiji 提供了更简便的插件架构，并在默认安装中包含这些功能。安装完成后，打开 Fiji。Fiji 支持导入大量专有的显微镜图像格式。这可以通过拖放操作或通过用户在开放显微镜环境（Open Microscopy Environment）中实现。我们将使用正确的三 EG 插件副本进行此分析。生物格式导入插件。如果数据集超过系统安装内存的大小，请将图像文件作为虚拟堆栈打开，并选择内存管理选项。本分析所使用的数据集来自对ACTA1-GFP转基因斑马鱼进行的三维时间序列实验，其中GFP在骨骼肌中表达。为了可视化细胞核，将该转基因品系注射了核定位的 M cherry，以更好地呈现这些荧光信号。我们可以通过颜色通道工具调整每个通道的查找表。在采集的时间序列过程中，该斑马鱼样本似乎在视野中发生了漂移。为校正此漂移，可在 Fiji 软件的插件菜单下的“注册”子菜单中打开“校正 3D 漂移”插件。在样本中广泛表达或在图像采集期间不参与市场事件的标记物是进行漂移校正的最佳来源。在本示例中，通道一中的 ACTA1，即 GFP 荧光信号。如果您的系统内存有限，请选择虚拟堆栈选项，并运行 Correct 3D drift 插件。校正后的数据集相比原始数据集将具有更大的画布尺寸，以适应样本的移动。生成光学切片的最大投影图像，可以比较校正前后样本中已被去除的漂移情况。最大强度投影消除了数据集的维度，但作为一种快速检查漂移校正结果的有效方法。在此，我们看到了每个时间点在其校正后和未校正的数据集中的最大投影图像

sample-drift-correction-following-4d-confocal-time-lapse-imaging

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生物工程

样品漂移校正继4D共焦时间推移成像

我们描述了三种测试样品的制备方法，以及如何利用它们优化和评估STORM显微镜的性能。通过这些示例，展示了如何采集原始数据，并进一步处理以获得分辨率为约30-50...

优化STORM超分辨率显微镜的测试样品

我们展示了如何利用荧光光激活定位显微技术（FPALM）同时对细胞内多种荧光标记的分子 进行成像。所述技术可在单个细胞内实现数千至数十万个荧光标记蛋白的定位，精密度达到数十纳米 。...

同时多色成像生物结构的荧光光激活定位显微技术

生物膜与其周围环境之间存在复杂的相互作用。为了全面研究生物膜与环境之间的相互作用，本文介绍了一系列方法，用于构建有利于生物膜生长的异质化学环境，量化局部流速，以及分析生物膜菌落内部及周围的物质传输过程。...

生物膜与生境异质性协同发育的表征方法

本文介绍了一种干涉光激活定位显微镜（iPALM）的技术方案，该方法是一种基于单分子定位的三维超分辨率显微成像技术，用于贴壁哺乳动物细胞中肌动蛋白细胞骨架的成像。该技术能够通过光学手段实现纳米尺度结构特征的可视化，而这些结构在传统受衍射极限限制的光学显微镜下无法分辨。...

通过干涉光激活定位显微镜（iPALM）对F-actin丝进行三维超分辨率成像

本文介绍了一种在活细胞细胞器中对单个膜蛋白进行多色定位的实验方案。通过使用自标记蛋白来连接荧光染料，可对同一细胞器不同膜区室中分布的蛋白质实现约18...

活体哺乳动物细胞器中单个膜蛋白的多色定位显微成像

本方案描述了使用纤维蛋白凝块固定样品的应用，可限制样品漂移，并允许在活体成像过程中添加和洗去试剂。将样品转移至盖玻片表面含有纤维蛋白原的培养基液滴中，随后通过加入凝血酶诱导聚合反应。...

固定化技术的应用 果蝇 用于活体成像的含纤维蛋白凝块的组织

本文介绍了用于可视化和分析小鼠胚胎在体轴伸长和体节形成过程中三维和四维图像数据的计算工具与方法，这些图像数据通过整体光学投影断层成像技术、活体成像以及基于多光子显微镜的全胚免疫荧光染色获得。...

三维与四维可视化及分析方法在脊椎动物体轴伸长与分节研究中的应用

本方案描述了一种对斑马鱼早期眼部发育进行整体标记和多维成像的方法。我们介绍了利用激光扫描共聚焦显微镜进行标记、包埋和四维（4D）成像的操作步骤，并讨论了优化数据采集的注意事项，以深入解析视杯形态发生机制。...

斑马鱼视杯形态发生的四维成像

本研究展示了一种在原子分辨率透射电子显微镜成像中进行原子位置追踪的工作流程。该工作流程使用一款开源的 Matlab...

通过电子显微镜实现皮米级精度的原子位置追踪

本方案介绍了进行黏附足迹实验以成像快速细胞滚动黏附过程中黏附事件的实验步骤。...

成像细胞滚动过程中分子黏附的黏附足迹检测法

近紫外光刻技术与牵引力显微镜相结合，用于测量细胞在微图案化水凝胶上的作用力。通过靶向光诱导单个细胞释放，可在同一样本上进行大量测量。...

利用水凝胶图案化技术调控细胞黏附在牵引力显微镜中的应用

学习使用开源图像处理软件Fiji进行三维样品漂移校正，实现四维共聚焦时间推移成像。该方法可准确追踪细胞运动，生成三维模型，适用于斑马鱼发育生物学研究。

4D 共聚焦延时成像后的样本漂移校正

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