植物蛋白复合体的翻译后修饰的鉴定

该程序的总体目标是鉴定植物蛋白复合物中涉及的蛋白质的翻译后修饰，这些蛋白质首先在目标标签蛋白的平面中瞬时或稳定表达。然后从植物组织中提取总蛋白，并免疫沉淀感兴趣的蛋白质。接下来，在丙烯酰胺凝胶上分离免疫沉淀的蛋白质，并从感兴趣的凝胶条带中提取和消化蛋白质。

现在提交蛋白质样品进行质谱分析。最终，质谱分析的结果可以检测翻译后修饰（如磷酸化）的动态变化。与激酶与底物的体外孵育等替代方法不同，该方法在种植器中表达蛋白质。

因此，您不必知道哪种激酶负责磷酸化。这种方法可以帮助回答植物生物学领域的关键问题，例如信号如何响应压力、环境变化或病原体识别而被转导。除了鉴定磷酸化、活化抗性蛋白复合物的位点外，该方法还可以广泛应用于任何植物蛋白复合物的任何翻译后修饰。

一般来说，刚接触这种方法的人会很挣扎，因为他们不习惯使用大量提取物并在一天内执行协议的更多步骤。对于瞬时表达，将农杆菌 tohin 菌株培养至固定相。以 3000 G 离心 5 分钟，收获农业细菌。

重悬沉淀和浸润缓冲液。缓冲区。现在渗透进来。4 周龄的 NCOA hamana 植物与农业细菌手动使用 1 毫升无针注射器或通过真空与 0.02% 表面活性剂，浸润后 2 至 5 天。

收获渗入的叶子、叶子，将它们冷冻在液氮中并储存在零下 80 摄氏度。接下来，使用研钵和研杵在 80 毫升冷缓冲液 C 中研磨 20 克植物组织和液氮至 20 克。充分混合并在冰上解冻。

现在全速进行三次爆发，每次 10 秒。过滤匀浆并在 4 摄氏度下以 30， 000 G 离心 30 分钟。同时，在 500 微升冷封闭缓冲液 D 中加入 100 微升合适的亲和基质，在 4 摄氏度下洗涤 5 分钟，然后用 1 毫升冷缓冲液 D 洗涤 3 次。接下来，去除叶提取物的上质，并将其通过 0.45 微米注射器。

过滤到冰上的新管中。分装粗提取物。用于免疫印迹。

加入 5 个 XSDS 页面加载缓冲液涡旋，将样品煮沸以变性。向每管中加入 50 微升悬浮在缓冲液 D 中的亲和基质。在 4 摄氏度下轻轻旋转孵育 2 小时，然后离心以沉淀亲和基质。

然后取等分试样的未结合提取物进行免疫印迹。丢弃剩余的 sane，在管底留下大约 500 μL。用宽口径尖端重悬浆液溶液。

将来自两个试管的混合浆液混合到一个 1.5 毫升的试管中。使用台式离心机脉冲 3 次，持续 5 秒，以沉淀亲和基质，并在用 1 毫升冷缓冲液洗涤 3 到 5 次后去除上级 D.用注射器针头去除多余的缓冲液 D，在持续摇动下用 200 微升适当的洗脱缓冲液洗脱。将三个 EIT 拉入一根管中。

然后使用 30 μL 吸收树脂涡旋浓缩蛋白质。让我们静置 5 分钟，沉淀树脂，丢弃 supernat。将 50 μL 单 XSDS 页面上样缓冲液添加到沉淀的亲和基质或吸收树脂涡旋中，并在 80 至 100 摄氏度下在加热块离心机中煮沸 10 分钟。

煮沸的亲和基质是树脂，在 10， 000 下放置 2 分钟。GS 分装 5 μL 上萃进行免疫封闭，并与其他组分一起在 10 厘米长的 SDS 页面上运行。用于通过质谱分离和鉴定磷酸化蛋白质的凝胶。

将剩余的 45 μL 加载到 SDS 页面凝胶染料上。SDS 页面凝胶具有胶体 kamasi 光彩蓝。然后用大量的洗涤剂和水保留凝胶，最好过夜。

现在用干净的手术刀从凝胶上切下感兴趣的条带，将凝胶切片切成 2 到 4 毫米的立方体，然后将样品转移到试管中。用 50% 乙基腈和 50 毫摩尔碳酸氢铵洗涤凝胶块直至脱色。然后吸出溶液。

注意不要去除凝胶块。用 100% 乙基丁腈将样品脱水 5 分钟，然后去除游离液体。然后，为了减少 10 毫摩尔 DTT 的蛋白质二硫键，并在 56 摄氏度下振荡孵育 30 至 45 分钟，现在去除游离液体以烷基化半胱氨酸残基。

在室温下避光加入 55 毫摩尔氯乙酰胺 20 至 30 分钟。取出游离液体，然后用 50% Aceto 丁腈洗涤凝胶块两次，持续 10 分钟。去除游离液体。

现在用 100% 乙腈将凝胶块脱水 5 分钟，并去除游离液体用于 Triptych Digest。在 40 μL 胰蛋白酶工作溶液中，让凝胶块在足够的消化缓冲液下再水化 10 分钟以覆盖凝胶块。在 37 摄氏度下孵育过夜以停止消化，并在 5% 甲酸超声处理液中从凝胶碎片中提取肽 5 至 10 分钟。

然后将 supernat 转移到新试管中，通过冻干或真空浓缩器干燥肽，并将样品储存在零下 20 摄氏度。本实验从 nacoa hamana 中纯化 P-R-F-P-T-O 激酶复合物，表达 35 SPTO 的转基因 NACOA hamana 用 35 SPRF 标志瞬时转化，并用 Anti-Flag M two aros 免疫沉淀该复合物。免疫印迹显示了靶向 PRF 蛋白的高效免疫沉淀，如抗体检测和质谱分析所示，PTO 和与 PRF 共纯化的相互作用效应蛋白。

在这里，策略是用 Anti-Flag 靶向 PTO 蛋白。策略发生了变化。为了鉴定 PTO 磷酸化位点。

用 Anti-Flag M two aros 免疫沉淀包含 PRF 复合物和游离形式的 PTO 蛋白总量，并进行 SDS 页面分级分离、ingel 三联消化和质谱分析，得到 PTO 肽跨越其序列的约 80%。有趣的是，鉴定出一组 PTO 肽的单个磷酸化位点。请注意，仅在任一效应蛋白存在的情况下才能鉴定出双磷酸化位点。

获得足够的植物蛋白数量非常重要，以便鉴定蛋白质复合物的组分并检测目标蛋白质的翻译后修饰。请记住，像磷酸化这样的映射修饰需要来自质谱分析的合理数量的蛋白质，因此凝胶上至少应该有一个明显的微弱条带。按照此程序。可以执行其他方法，如 I，鉴定复杂成分，以回答其他问题，例如免疫复合物激活如何导致功能性免疫。

不要忘记，使用有机缓冲液、细菌和剃须刀 BBL 可能非常危险，因此请采取预防措施，例如戴手套和穿搭腰大衣。