植物蛋白质复合物翻译后修饰的鉴定

本实验的总体目标是首先在植物中瞬时或稳定表达目标蛋白的标签，以鉴定参与植物蛋白复合物的蛋白翻译后修饰。然后从植物组织中提取总蛋白，并对目标蛋白进行免疫沉淀。接着，将免疫沉淀的蛋白在丙烯酰胺凝胶上分离，并从目标凝胶条带中切取蛋白，进行提取和消化。

现在将蛋白质样品提交进行质谱分析。最终，质谱结果可检测翻译后修饰（如磷酸化）的动态变化。与体外激酶与底物孵育等替代方法不同，该方法在植株中表达蛋白质。

因此，您无需知道是哪种激酶负责磷酸化。该方法有助于回答植物生物学领域中的关键问题，例如植物如何在应对胁迫、环境变化或病原体识别时进行信号转导。除了可用于鉴定磷酸化位点以及激活的抗性蛋白复合物的位点外，该方法还可广泛应用于任何植物蛋白复合物的任何翻译后修饰研究。

通常，初次接触该方法的研究人员会遇到困难，因为他们不习惯处理大量提取物，并且需要在一天内完成实验方案中的多个步骤。进行瞬时表达时，将农杆菌的 tohin 菌株培养至静止期。通过在 3000 ×g 下离心 5 分钟收集农杆菌。

用浸润缓冲液重悬沉淀。现在进行浸润。使用1毫升无针注射器或含0.02%表面活性剂的真空法，对农杆菌手动浸润四周大的NCOA本氏烟草植株，在浸润后2至5天进行。

收获浸润的叶片，将其在液氮中速冻，并于负80摄氏度保存。随后，将20克植物组织与液氮一同放入研钵中研磨，加入80毫升预冷的缓冲液C至20克组织中。充分混匀后，在冰上解冻。

现在以全速进行三次，每次10秒的匀浆处理。过滤匀浆液，并在4°C下以30,000 ×g离心30分钟。同时，将100微升合适的亲和介质加入500微升预冷的封闭缓冲液D中，4°C孵育5分钟，并用1毫升预冷的缓冲液D洗涤三次。接下来，弃去叶片提取物的上清液，并通过0.45微米的注射器滤膜过滤。

将滤液收集至预冷的新离心管中。分装粗提物，用于免疫印迹实验。

加入五倍 XSDS 上样缓冲液，涡旋混匀后煮沸样品以使其变性。向每管中加入 50 微升悬浮于缓冲液 D 中的亲和介质。在 4 摄氏度下轻轻旋转孵育两小时，然后离心使亲和介质沉淀。

然后取一部分未结合的提取物进行免疫印迹。弃去其余的上清液，仅保留约 500 微升在离心管底部。使用宽口吸头重新悬浮沉淀的悬液。

将两根离心管中的混合浆液合并至一个1.5毫升离心管中。使用台式离心机短暂离心三次，每次5秒，以沉淀亲和基质，并用1毫升预冷的缓冲液D洗涤3至5次，去除上清液。用注射器针头去除多余的缓冲液D，然后在持续振荡条件下，加入200微升适当的洗脱缓冲液进行洗脱。将三个EITs收集至同一根离心管中。

然后使用30微升吸附树脂涡旋浓缩蛋白质。室温静置5分钟，使树脂沉淀，弃去上清液。向沉淀的亲和介质或吸附树脂涡旋中加入50微升1×SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳上样缓冲液，在加热块离心机中于80至100摄氏度煮沸10分钟。

将煮沸的亲和层析树脂在10,000 ×g条件下离心两分钟。取五微升上清液用于免疫印迹分析，并将其他组分一同上样至长度为10厘米的SDS-PAGE凝胶，用于磷酸化蛋白的分离，并通过质谱法进行鉴定。

将剩余的45微升上样至SDS-PAGE凝胶进行染色。使用考马斯亮蓝胶体染色液对SDS-PAGE凝胶染色。随后用大量水充分洗涤凝胶，最好过夜。

现在使用洁净的手术刀，从凝胶中切下目标条带，将凝胶切块切成2至4毫米的立方体，并将样品转移至离心管中。用50%乙腈和50毫摩尔碳酸氢铵溶液洗涤凝胶碎块，直至脱色完全。然后用移液器吸去溶液。

注意不要移除凝胶碎片。用100%乙腈脱水样品5分钟，并除去游离液体。然后在56摄氏度下，以10毫摩尔DTT还原蛋白质二硫键，振荡孵育30至45分钟，随后除去游离液体以烷基化半胱氨酸残基。

在室温避光条件下，加入55毫摩尔的氯乙酰胺，反应20至30分钟。去除上清液体，然后用50%乙腈洗涤凝胶颗粒两次，每次10分钟。去除上清液体。

现在用100%乙腈将凝胶颗粒脱水五分钟，并去除三联消化所需的游离液体。加入40微升胰蛋白酶工作液，使凝胶颗粒在足以覆盖凝胶的消化缓冲液中重新水合10分钟。在37摄氏度下孵育过夜以终止消化反应，并用含5%甲酸的溶液超声处理5至10分钟，从凝胶颗粒中提取肽段。

然后将上清液转移至新管中，通过冷冻干燥或真空浓缩仪将肽段干燥，并将样品在零下20摄氏度保存。本实验从烟草（Nacoa hamana）中纯化了P-R-F-P-T-O激酶复合物，该实验使用表达35 SPTO的转基因NACOA hamana，并瞬时转化35 SPRF flag，随后利用抗Flag M2琼脂糖珠对复合物进行免疫沉淀。免疫印迹结果显示，目标PRF蛋白被高效地免疫沉淀，PTO以及与其相互作用的效应蛋白均与PRF共纯化，这通过抗体检测和质谱分析得以证实。

此处的策略是使用抗Flag抗体靶向PTO蛋白。该策略已更改，目的是为了鉴定PTO的磷酸化位点。

通过抗Flag M2抗体免疫沉淀包含PRF复合物和游离形式的全部PTO蛋白，并进行SDS-PAGE分离、胶内三联消化及质谱分析，结果获得了覆盖其序列约80%的PTO肽段。值得注意的是，鉴定出一组PTO肽段的单个磷酸化位点。需注意的是，仅在存在效应蛋白的情况下才鉴定出双磷酸化位点。

为了鉴定蛋白质复合物的组分并检测目标蛋白质的翻译后修饰，获取足量的植物蛋白至关重要。请记住，要进行磷酸化等修饰位点的鉴定，质谱分析需要相对充足的蛋白质样品，因此在完成本实验步骤后，凝胶上至少应能观察到微弱的蛋白条带。此外，还可采用其他方法，例如免疫共沉淀，以鉴定复合物的组分，从而回答诸如免疫复合物的激活如何引发功能性免疫等进一步的科学问题。

请注意，操作有机缓冲液、细菌和 razor BBLs 可能具有极高危险性，因此应采取预防措施，例如佩戴手套和实验服。