Drosophila 温度偏好行为及其昼夜节律的设计与分析
2014年1月13日
我们近期鉴定出一种新的黑腹果蝇（Drosophila）昼夜节律输出——温度偏好节律（temperature preference rhythm, TPR），即果蝇在白天偏好的温度升高，而在夜间偏好的温度下降。TPR 的调控独立于另一项昼夜节律输出——运动活动节律。本文中 我们描述了黑腹果蝇（Drosophila）TPR 的实验设计与分析方法。
本实验的总体目标是确定果蝇的温度偏好。首先准备果蝇和实验装置，装置组装在一个温度可控的铝制底座周围。当装置内温度稳定后，将一群果游戏副本放入其中，半小时后记录其温度偏好。
最终，该检测方法可适用于多种实验条件。例如，温度偏好节律的研究。该方法有助于解答节律研究领域中的关键问题。
由于温度偏好节律的调控机制与运动活动的调控机制不同，该行为检测方法将有助于发现此前利用运动活动方法未能识别的新的分子和细胞机制。该方法还有助于回答感觉神经科学领域中的关键问题，例如温度感知和痛觉感知。由于该温度行为检测具有高度稳健性，因此将使我们能够绘制从温度感知到信息处理的神经环路图谱，从而更深入地理解感觉整合过程。
将果蝇饲养在具有12小时光照/12小时黑暗循环的加湿培养箱中。本实验方案需要两个设定为相反光照周期的培养箱。夜间培养箱在正常工作时间应保持黑暗。
在夜间周期中打开培养箱时，应使用红光照射培养箱内部。收集20至30只新孵化的果蝇（性别不限，比例任意）为一组，将其在原培养箱中继续培养两到三天后再进行实验检测。每种测试条件至少需要五组果蝇。
为构建温度偏好测试室，需设计一个有机玻璃盖，使其安装在铝板下方并紧密贴合。放置四个帕尔贴装置。每个帕尔贴装置应连接至温度控制器，该控制器可产生低温或高温，以防止帕尔贴装置过热。
计算机冷却系统连接至水管、风冷风扇和电源，用于监测铝板上的温度。温度探头嵌入铝板边缘，并与温度控制器相连。在盖板上将铝板的冷侧和热侧分别设置为12摄氏度和36摄氏度。
在其中一个通道内的不同位置安装六个温度探头。将装置置于温度为25摄氏度、相对湿度在65%至75%之间的环境控制室内。务必监测这些环境条件。
房间必须能够控制光照并具备良好的空气流通，以防止流动空气影响温度稳定性。使用浴帘对测试区域进行梯度屏蔽。仪器应使用均匀光照，因为光照强度可能会影响温度偏好。
开启设备至少30分钟，以在培养皿表面建立稳定的温度梯度。用防水材料涂抹行为学装置的盖子，防止果蝇攀爬盖子的壁面或顶部。
擦去多余的防水剂，必要时将盖子静置25至30分钟，半小时后可使用双面胶带。擦去铝板上的任何冷凝水，然后将有机玻璃盖板放在铝板上，并用六个C型夹固定。
确保盖子密封非常关键。需监测培养皿与盖子之间的空气温度。务必保证探头不接触铝板或有机玻璃盖。
让盖子在金属板上平衡至少15分钟。最终，铝板与盖子之间的空气温度梯度将在18至32摄氏度之间。在进行白天行为实验时，从白天培养箱中取出果蝇小瓶，并在夜间行为实验开始前立即在光照条件下进行行为检测。从夜间培养箱中取出果蝇小瓶。
用锡箔纸包裹后，放入盒子中，置于暗室内的红光灯下。在黑暗期进行实验时，行为学实验结束前，房间的照明灯必须始终保持关闭状态。但可使用红光灯通过抽吸方式进行照明。
将20至25只果蝇装入铝板之间的空间中，然后用盖玻片盖住孔洞以防止果蝇逃逸。让果蝇自由活动30分钟。
实验完成后，需对光照实验至少拍摄两张照片。暗实验则需要使用闪光灯。检查仪器的温度。
记录环境温度和湿度，同时将连接果蝇的二氧化碳管从装置顶部的孔中移开以麻醉果蝇，并丢弃这些果蝇，不得再次用于实验。接下来，擦去培养皿上的任何冷凝水或湿气。
将盖子重新盖在培养板上，并用夹子拧紧，以备下次实验使用。接下来，按以下步骤计算温度梯度：首先，根据温度探针的位置及其记录的温度，使用直尺确定各温度探针在图中的位置；然后，在果蝇最终位置照片的相应位置上，绘制代表每个温度梯度的直线。
接下来，统计每个一摄氏度温度区间内的果蝇数量。排除覆盖物壁面或顶面上的任何果蝇。计算每条通道中每个温度范围内果蝇的百分比，然后计算每种条件下的平均偏好温度。
至少收集五次试验的数据，然后使用每次试验的平均值来确定平均偏好温度及其误差。在25摄氏度条件下培养的正常果蝇，早晨偏好的温度低于傍晚。
在白天期间，测得温度偏好升高了1至1.5摄氏度，而在昼夜交替阶段则观察到降低了1.5至2摄氏度。该检测方法也可用于测试突变果蝇。
例如，研究发现，在 trip 基因（一种离子通道）中携带缺陷性突变的果蝇，其温度偏好高于对照组。观看本视频后，您应充分了解如何开展温度偏好行为实验。该方法可用于研究分子机制和神经回路、生物钟，以及大脑如何整合不同环境信号并作用于生物钟的机制。
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概述
本研究鉴定了果蝇中一种新的昼夜节律输出，称为温度偏好节律（TPR），其随一天中的时间而变化。该研究探讨了TPR如何独立于运动活动而受到调控。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 时间生物学
- 行为生物学
背景
- 温度偏好节律（TPR）是一种新近发现的昼夜节律输出行为。
- TPR 表现出每日波动，白天升高，夜间降低。
- 研究 TPR 有助于深入理解昼夜节律调控机制。
- TPR 与其他昼夜节律行为（如运动活动）不同。
研究目的
- 研究果蝇的温度偏好。
- 分析评估温度偏好反应（TPR）的实验设计与方法学。
- 探讨温度偏好反应（TPR）在昼夜节律背景下的意义。
使用的方法
- 果蝇及实验装置的准备。
- 在受控环境中建立温度条件。
- 将果蝇装入装置以进行温度偏好评估。
- 经过半小时观察期后记录温度偏好结果。
主要结果
- TPR 被成功测量，并显示出明显的日间波动。
- 该方法允许测试多种实验条件。
- 研究结果有助于理解黑腹果蝇的昼夜节律。
- 研究发现可能有助于解答昼夜生物学领域中的关键问题。
结论
- 体温节律（TPR）是一种重要的昼夜节律输出信号，其运行独立于运动活动。
- 所建立的方法可应用于昼夜节律的进一步研究。
- 理解体温节律（TPR）可能为其他生物中昼夜节律调控提供更广泛的见解。
常见问题
行业重要性概述
对果蝇（Drosophila）温度偏好节律（TPR）进行定量分析，能够超越运动活动的局限，对生物钟输出机制进行更深入的风险评估，从而支持神经生物学和时间生物学研究流程中的靶点验证。该行为学检测方法为解析神经环路及分子通路在环境信号整合中的作用提供了可靠的预测依据，可直接指导早期发现与转化研究策略的制定。这一稳健且可重复的实验流程使TPR分析成为研发团队在跨功能研究中用于探究感觉整合与生物钟调控的可复用技术平台。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 能够针对神经和分子通路中的不同昼夜节律输出进行功能靶点验证。
- 通过区分调控体温节律（TPR）与调节运动活动的机制，支持生物学风险评估。
- 有助于提高识别与疾病模型相关的新型昼夜节律基因和神经回路的预测可信度。
筛选与检测方法开发
- 提供了一种经过验证的行为检测系统，可在受控条件下对温度偏好进行定量测量。
- 确保在不同实验群体和环境变量之间检测结果的可重复性和标准化。
- 支持对影响昼夜节律和感觉通路的遗传突变体或药物干预进行可扩展的筛选。
转化与临床前研究
- 通过模拟变温动物的节律性体温调节，契合转化生物标志物的开发。
- 支持从神经环路功能及环境信号整合的发现到临床前验证的连续性研究。
- 通过提供与哺乳动物系统相关的感官和昼夜节律调控的机制性见解，降低研发推进决策的风险。
流程与工作流整合
TPR 检测可融入从早期机制研究到临床前模型开发的整个发现过程，从而为昼夜节律和感觉靶点的假设验证与通路阐明提供支持。
- Discovery Biology: 支持对温度偏好节律背后的神经回路和分子机制进行假设驱动型分析。
- Screening: 提供定量且可重复的输出结果，用于比较基因或环境干预的影响。
- Analytics: 提供对偏好温度分布及昼夜节律相位偏移的统计学测量。
- Translational Research: 将发现研究成果与体温调节和感觉整合的临床前模型相衔接。
- Enterprise Reuse: 为跨研发项目的持续靶点验证和机制研究建立一个稳健且可适应的平台。
运营与企业影响
- 科学价值：提高昼夜节律与感觉神经科学研究中的预测置信度，减少机制上的模糊性。
- 操作价值：通过可扩展且可重复的行为表型分析标准化实验流程。
- 战略价值：在研发早期明确生物学风险，为“推进/终止”决策提供依据，提升资金使用效率。
- 组合影响：实现对神经生物学与时间生物学项目中靶点及模型的风险校准优先排序，推动优选项目进入下一阶段。
实施注意事项
- 需要具备行为神经科学、时间生物学和定量数据分析方面的专业知识。
- 要求对温度和光照条件进行精确的环境控制及仪器调控。
- 需要跨团队对实验设置、数据采集和分析流程进行标准化。
- 可适用于黑腹果蝇（Drosophila）模型中不同的遗传背景和实验干预。
- 实际局限性包括对环境的敏感性以及需要严格的群体重复实验。
