Name: 基于细胞的流式细胞仪检测，以测量细胞毒活性 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-17T13:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 14 s
Description: 学习基于细胞的流式细胞术检测方法，用于测量抗原特异性CD8+ T细胞的细胞毒活性。该方法通过共培养效应T细胞与靶细胞，利用流式细胞仪精确定量杀伤效率，为免疫学研究提供可靠的细胞毒性评估工具。

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本工作由佛罗里达州旅游、贸易和经济发展办公室资助。

1. 效应CD8+ T细胞的制备
<ol>
	<li>将自体冻存的外周血单个核细胞（PBMC）（2-3管，每管50&#160;x 106个细胞）从液氮中取出，放入37 °C水浴中解冻。</li>
	<li>用完全RPMI培养基（含4 mM L-谷氨酰胺、100 U/ml青霉素和链霉素，并添加10%胎牛血清）将细胞管加至50 ml，洗涤细胞。计数PBMC，并以5 x 106/ml的浓度重悬于完全RPMI培养基中。</li>
	<li>向PBMC中加入特异性肽段（5 µg/ml）和IL-2（10 ng/ml）。</li>
	<li>在96孔深孔板中建立培养体系；每孔接种1 ml细胞悬液。</li>
	<li>培养3天后，更换一半的细胞培养基为新鲜的完全RPMI培养基。</li>
	<li>培养6天后，用多通道移液器收集所有PBMC，并转移至无菌储液槽中。</li>
	<li>计数、洗涤PBMC，并以5 x 107/ml的浓度重悬于14 ml圆底管中的推荐分离缓冲液中。按每毫升细胞加入50 µl人CD8+ T细胞富集混合液。混匀后室温孵育10分钟。再按每毫升细胞加入150 µl磁性颗粒，孵育5分钟。</li>
	<li>通过加入分离缓冲液将细胞悬液体积调整至7 ml。将试管放入磁铁中，进行未接触式CD8+ T细胞的免疫磁分离。5分钟后，保持试管仍在磁铁中，将目标细胞倾倒入新的15 ml锥形管中。取少量细胞样本，在4 °C条件下，用含1X PBS-2% FBS的缓冲液与抗CD3和CD8抗体孵育30分钟。随后可通过流式细胞术检测CD8+ T细胞纯度，预期纯度为95%或更高。</li>
	<li>将CD8+ T细胞重悬于450 µl完全RPMI培养基中。</li>
	<li>向5个螺帽管中各加入225 µl完全RPMI培养基。</li>
	<li>通过将225 µl CD8+ T细胞悬液转移至下一管，进行系列稀释（从1:2至1:32）（见 图1 上图）。</li>
</ol>
2. 靶向CD4+ T细胞的制备
<ol>
	<li>将自体冻存的外周血单个核细胞（PBMC）（1 小瓶，含 50 × 106 个细胞）从液氮中取出，转移至 37 °C 水浴中解冻。</li>
	<li>将细胞悬液转移至含有 10 ml RPMI 培养基的 50 ml 圆底离心管中。</li>
	<li>用分离缓冲液洗涤细胞，并将 PBMC 重悬于 14 ml 圆底管中，浓度为 5 × 107/ml。按每毫升细胞加入 50 µl 人 CD4+ T 细胞富集混合液，混匀后室温孵育 10 分钟。再按每毫升细胞加入 100 µl 磁性颗粒，室温孵育 5 分钟。</li>
	<li>用分离缓冲液将细胞悬液补至 7 ml。将离心管放入磁架中，开始分离 CD4+ T 细胞。5 分钟后，在保持离心管处于磁架中的情况下，将未被磁性捕获的细胞倾入新的 15 ml 圆底离心管中。取少量细胞 aliquot，用含 CD3 和 CD4 抗体的 1×&#160;PBS-2% FBS 溶液在 4 °C 染色 30 分钟，随后通过流式细胞术检测 CD4+ T 细胞纯度，预期纯度应达到 95% 或更高。</li>
	<li>计数 CD4+ T 细胞，将其分装至两个 15 ml 圆底离心管中，并用预热的 1×&#160;PBS 洗涤。</li>
	<li>在预热的 PBS 中配制 0.4 µM 的 CFSE 高浓度工作液。</li>
	<li>取部分 10×&#160;CFSE 高浓度工作液，用预热的 PBS 稀释，配制 0.04 µM 的 CFSE 低浓度工作液。</li>
	<li>将细胞重悬于 PBS 中，浓度为 20 × 106/ml（若 CD4+ T 细胞数量少于 10 × 106/ml，则用 0.5 ml PBS 重悬），取一半细胞加入等体积的 0.4 µM CFSE 高浓度工作液（终浓度为 0.2 µM）。例如，1 ml 细胞加入 1 ml CFSE 工作液。剩余另一半 CD4+ T 细胞则加入等体积的 0.04 µM CFSE 低浓度工作液（终浓度为 0.02 µM）。所有细胞在 37 °C、5% CO2 条件下染色 15 分钟。</li>
	<li>染色结束后，以 1,500 rpm 离心 5 分钟，弃上清，用 1 ml 预热的完全 RPMI 培养基重悬细胞，以终止标记反应。</li>
	<li>向 CFSE 低浓度标记的 CD4+ T 细胞中加入目标肽段，终浓度为 5 µg/ml，置于完全 RPMI 培养基中，在 37 °C、5% CO2 条件下孵育 45 分钟。</li>
	<li>用完全 RPMI 培养基洗涤 CFSE 高浓度和低浓度标记的 CD4+ T 细胞，共洗涤两次。洗涤后分别用完全 RPMI 培养基重悬，浓度均为 2 ×&#160;105 个细胞/ml。</li>
	<li>将两种目标细胞群体按 1:1 比例混合（CFSE 高浓度 : CFSE 低浓度）（见 图 1 下图）。</li>
</ol>
3. 共培养
<ol>
	<li>从每种稀释度的 CD8+ T 细胞中，取 100 µl 加入圆底 96 孔板中，每个样本设两个复孔。</li>
	<li>向每种效应细胞稀释液中加入混合的靶向 CD4+ T 细胞（100 µl），使终体积为 200 µl。</li>
	<li>为检测基础凋亡水平，单独接种靶细胞于 3 个孔中。</li>
	<li>将共培养体系在 37 °C、5% CO2 条件下孵育 6 小时。</li>
</ol>
4. 流式细胞术染色与采集
<ol>
	<li>将细胞转移至V型底96孔板中，在37 °C、5% CO2条件下，用PE标记的pMHC四聚体染色15分钟。</li>
	<li>用1×&#160;PBS-2% FBS洗涤一次，在4 °C避光条件下，用Far Red LIVE/DEAD可固定死细胞染料、αCD3-Alexa700、αCD8-Percp和αCD4-Brilliant Violet 650染色30分钟。</li>
	<li>用1×&#160;PBS-2% FBS洗涤细胞一次，重悬于含2%甲醛的1×&#160;PBS溶液中，体积为100 µl。</li>
	<li>在流式细胞仪上检测细胞。</li>
</ol>

<ol><li>Appay, V., Van Lier, R. A. W., Sallusto, F., Roederer, M. Cytometry. 73, 975-983 (2008).</li>
<li>Betts, M. R., Harari, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotype+and+function+of+protective+T+cell+immune+responses+in+HIV%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+HIV+AIDS%22%5BJournal%5D)">Phenotype and function of protective T cell immune responses in HIV.</a> Curr. Opin. HIV AIDS. 3, 349-355 (2008).</li>
<li>Roder, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+immunodeficiency+disorder+in+humans+involving+NK+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A new immunodeficiency disorder in humans involving NK cells.</a> Nature. 284, 553-555 (1980).</li>
<li>Barber, D. L., Wherry, E. J., Ahmed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+edge%3A+rapid+in+vivo+killing+by+memory+CD8+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cutting edge: rapid in vivo killing by memory CD8 T cells.</a> J. Immunol. 171, 27-31 (2003).</li>
<li>Byers, A. M., Kemball, C. C., Moser, J. M., Lukacher, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+edge%3A+rapid+in+vivo+CTL+activity+by+polyoma+virus-specific+effector+and+memory+CD8%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cutting edge: rapid in vivo CTL activity by polyoma virus-specific effector and memory CD8+ T cells.</a> J. Immunol. 171, 17-21 (2003).</li>
<li>Devevre, E., Romero, P., Mahnke, Y. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LiveCount+Assay%3A+concomitant+measurement+of+cytolytic+activity+and+phenotypic+characterisation+of+CD8%28%2B%29+T-cells+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">LiveCount Assay: concomitant measurement of cytolytic activity and phenotypic characterisation of CD8(+) T-cells by flow cytometry.</a> J. Immunol. Methods. 311, 31-46 (2006).</li>
<li>Altman, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+analysis+of+antigen-specific+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes.</a> Science. 274, 94-96 (1996).</li>
<li>Mbitikon-Kobo, F. M., Bonneville, M., Sekaly, R. P., Trautmann, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+measurement+of+the+cytotoxic+capacity+of+human+primary+antigen-specific+CD8+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Ex vivo measurement of the cytotoxic capacity of human primary antigen-specific CD8 T cells.</a> J. Immunol. Methods. 375, 252-257 (2012).</li>
<li>Bryant, J., Day, R., Whiteside, T. L., Herberman, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calculation+of+lytic+units+for+the+expression+of+cell-mediated+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Calculation of lytic units for the expression of cell-mediated cytotoxicity.</a> J. Immunol. Methods. 146, 91-103 (1992).</li>
<li>Varadarajan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+single-cell+analysis+of+human+CD8%28%2B%29+T+cell+functions+reveals+discordance+for+cytokine+secretion+and+cytolysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">A high-throughput single-cell analysis of human CD8(+) T cell functions reveals discordance for cytokine secretion and cytolysis.</a> J. Clin. Invest. 121, 4322-4331 (2011).</li>
<li>Trautmann, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profound+metabolic%2C+functional%2C+and+cytolytic+differences+characterize+HIV-specific+CD8+T+cells+in+primary+and+chronic+HIV+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Profound metabolic, functional, and cytolytic differences characterize HIV-specific CD8 T cells in primary and chronic HIV infection.</a> Blood. 120, 3466-3477 (2012).</li>
<li>Hildemann, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+Efficiency+of+Antiviral+CD4%28%2B%29+Killer+T+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">High Efficiency of Antiviral CD4(+) Killer T Cells.</a> PLoS One. 8, (2013).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

此处所述的检测方法可用于量化CD8+ T细胞的主要功能：细胞毒活性。在表征CD8+ T细胞效应功能时，准确测量该功能至关重要，因为既往研究报道，抗原特异性CD8+ T细胞的细胞毒活性与其细胞因子分泌之间存在不一致性。10,11由于共培养孵育时间较短（6小时）且使用自体靶细胞，靶细胞的非特异性杀伤率较低。因此，该检测方法具有高度特异性和可靠性。该检测方法还可轻松修改以分析不同的细胞亚群。效应CD8+ T细胞可替换为其他细胞类型，例如CD4+ T细胞，正如近期文献所述 体内 杀伤实验12靶向的CD4+ T细胞也可替换为其他细胞类型，正如我们此前描述的，可使用自体B细胞作为靶细胞8在此系统中，抗原的来源也可被替换。例如，靶细胞可通过病毒感染，而非使用肽段致敏。本方案提供了一种准确定量抗原特异性CD8+ T细胞溶细胞活性的方法。由于该方法具有良好的通用性和操作简便性，检测效应细胞的杀伤能力或可更频繁地用于CD8+ T细胞功能的量化分析。

细胞溶解活性是CD8+ T细胞的主要功能，但目前仍很少被检测，因为用于此目的的检测方法繁琐且难以标准化。在表征CD8+ T细胞效应功能时，准确测量该功能至关重要，因为迄今为止尚未发现可有效预测细胞介导的细胞毒性的可靠指标1,2。本文中，我们提出一种新的功能性检测方法，用于测量抗原特异性CD8+ T细胞对靶向CD4+ T细胞的细胞毒活性。已有多种方法被开发出来，以替代传统的“金标准”——铬释放实验。本文介绍的是一种基于细胞的检测方法，能够反映整个杀伤过程，通过测量活靶细胞的死亡情况来实现。该方法源自基于流式细胞术的小鼠体内in vivo4,5和人类体外in vitro6细胞毒检测方案。在本实验方案中，使用总CD8+ T细胞群体中含有的抗原特异性CD8+ T细胞作为效应细胞，同源CD4+ T细胞作为靶细胞。通过MHCI/肽段四聚体7对感兴趣的效应性CD8+ T细胞进行计数。靶细胞的死亡率通过加载肽段与未加载肽段的CD4+ T细胞之间的比例来计算。我们先前已证明，该方法具有可重复性、高灵敏度、高特异性，且不依赖于总CD8+ T细胞群体中效应细胞的数量8。通过在共培养实验中同时对效应细胞和靶细胞进行计数，可计算出CD8+ T细胞杀伤靶细胞的内在能力，并以裂解单位表示9。

<table><tbody><tr><td>EasySep 人 CD4+ T 细胞富集试剂盒</td><td>Stem Cell</td><td>19052</td><td></td></tr><tr><td>EasySep 人 CD8+ T 细胞富集试剂盒</td><td>Stem Cell</td><td>19053</td><td></td></tr><tr><td>CellTrace CFSE 细胞增殖试剂盒 - 用于流式细胞术</td><td>Invitrogen</td><td>C34554</td><td></td></tr><tr><td>Far Red LIVE/DEAD 可固定死细胞染料</td><td>Invitrogen</td><td>L10120</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 700 小鼠抗人 CD3 抗体</td><td>BD</td><td>557943</td><td></td></tr><tr><td>Brilliant Violet 650 抗人 CD4 抗体</td><td>Biolegend</td><td>317435</td><td></td></tr><tr><td>PerCP 抗人 CD8 抗体</td><td>Biolegend</td><td>344707</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 培养基 1x</td><td>VWR</td><td>10-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素 100x 溶液</td><td>Invitrogen</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清 - 金标，热灭活</td><td>PAA</td><td>A15-252</td><td></td></tr><tr><td>96 孔板；经处理；U 型底；带盖</td><td>BD Falcon</td><td>353077</td><td></td></tr><tr><td>25 ml 无菌聚苯乙烯储液槽，独立包装</td><td>USA Scientific</td><td>2321-2230</td><td></td></tr><tr><td>96 孔 U 型底，无菌 2 ml 深孔板</td><td>Thermo Scientific</td><td>275743</td><td></td></tr><tr><td>人 IL-2 (v126)，研究级</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-096</td><td></td></tr><tr><td>RoboSep 缓冲液，分离缓冲液</td><td>Stem cell</td><td>20104</td><td></td></tr><tr><td>15 ml 聚丙烯圆锥形离心管</td><td>BD Falcon</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>14 ml 圆底管，聚丙烯材质</td><td>BD Falcon</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td>The Big Easy EasySep 磁力架</td><td>Stem cell</td><td>18001</td><td></td></tr><tr><td>PBS 1x</td><td>VWR</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>96 孔 V 型底板，带盖</td><td>Fisher</td><td>12-565-481</td><td></td></tr><tr><td>甲醛溶液，ACS 级试剂，37 wt % 溶于 H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252549-500ML</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml 螺口盖微量离心管，锥形</td><td>Sarstedt</td><td>72.692.005</td><td></td></tr></tbody></table>

基于细胞的流式细胞术检测细胞毒活性

Cell-based Flow Cytometry Assay to Measure Cytotoxic Activity

CD8+ T细胞的细胞毒活性很少被评估。本文介绍一种新的基于细胞的检测方法，用于测量抗原特异性CD8+ T细胞杀伤负载其同源肽段的CD4+ T细胞的能力。将靶向的CD4+ T细胞分为两个群体，并用两种不同浓度的CFSE进行标记。其中一个群体用目标肽段致敏（CFSE低表达），另一个群体则未致敏（CFSE高表达）。将致敏与未致敏的CD4+ T细胞按相等比例混合后，与不同数量的纯化CD8+ T细胞共同孵育。在与含有抗原特异性效应CD8+ T细胞的CD8+ T细胞共培养后，通过流式细胞术分析自体靶向CD4+ T细胞的特异性杀伤情况，其中抗原特异性效应CD8+ T细胞通过肽段/MHCI四聚体染色进行鉴定。通过在不同效应细胞与靶细胞比例下测定靶向CD4+ T细胞的特异性裂解程度，可计算出溶细胞单位LU30/106细胞。该检测方法简单直接，能够准确测量CD8+ T细胞杀伤靶向CD4+ T细胞的内在能力。

图1中的示意图总结了该检测方法。将纯化的CD8+ T细胞（效应细胞）重悬于450 µl完全RPMI培养基中，并通过将225 µl CD8+ T细胞加入含有225 µl培养基的下一试管中进行系列稀释（上图）。对纯化的CD4+ T细胞（靶细胞）进行计数后，分装至两个试管中，并按照方案所述用两种不同浓度的CFSE（高浓度和低浓度）进行染色。CFSE低染的CD4+ T细胞用目标肽段进行刺激，而CFSE高染的CD4+ T细胞则不加肽段作为对照。将CFSE高染和CFSE低染的CD4+ T细胞均重悬至2 × 105/ml，并以1:1的比例混合（下图）。每孔加入100 µl混合的CD4+ T细胞。使用三孔仅含混合CD4+ T细胞的样本作为CD4+ T细胞单独培养的三复孔（红色孔）。将每种CD8+ T细胞稀释液各100 µl以双复孔形式加入其余含有混合CD4+ T细胞的孔中（绿色孔）。共培养6小时后，通过流式细胞术评估靶细胞的杀伤情况。
孵育后，细胞的分析和设门方法如图2所示。从一个较小的FSC-A/SSC-A...

本方案描述了一种灵敏的基于细胞的细胞毒性检测方法。通过计数在效应CD8+ T细胞数量递增的情况下，存活的靶CD4+ T细胞频率的减少，该检测可直接评估抗原特异性CD8+ T细胞的溶细胞活性。

CD8+ T 细胞的细胞毒性活性很少被评估。本文介绍一种新的基于细胞的检测方法，用于测量抗原特异性 CD8+ T 细胞的功能能力……

本实验的总体目标是利用基于细胞的流式细胞术检测方法，测定抗原特异性CD8+ T细胞的细胞毒性活性。首先，在含有目标肽段的条件下，将效应CD8+ T细胞扩增培养6天；第二步，用目标肽段刺激靶CD4+ T细胞，然后与未刺激的CD4+ T细胞混合；接下来，将效应CD8+ T细胞与靶CD4+ T细胞在不同效靶比条件下共培养6小时。最后一步中，通过流式细胞术定量分析加载了肽段的靶向 CD4 T 细胞的杀伤情况以及效应 CD8 T 细胞的数量。最终，可计算出抗原特异性 CD8 T 细胞以裂解单位表示的内在杀伤能力。该技术相较于传统的铬释放试验的主要优势在于，该方法使用自体原代靶细胞，而非永生化细胞系，并更接近真实的靶细胞。该方法可在单细胞水平上对效应细胞数量进行定量。接下来，我实验室的研究助理将演示分离CD8阳性效应细胞的操作步骤。首先，在37摄氏度水浴中复苏自体冷冻保存的外周血单个核细胞（PBMC），然后用最多50毫升完全培养基洗涤细胞。计数后，将PBMC用完全培养基稀释至浓度为每毫升500万个细胞，然后向培养物中加入IL-2和目标肽段。接着，将1毫升细胞悬液接种至96孔板的每个孔中。培养3天后，更换一半上清液为新鲜的完全培养基。培养6天后，使用多通道移液器将细胞转移至无菌储液槽中，然后进行细胞计数和洗涤。将沉淀重悬于分离缓冲液中，调整细胞密度为每毫升5000万个细胞，在14毫升圆底试管中加入人CD8阳性T细胞富集混合液，每毫升细胞加入50微升，室温孵育。10分钟后，加入抗CD8 IgG偶联磁性颗粒，每毫升细胞加入150微升，继续孵育5分钟，随后用额外的分离缓冲液将细胞悬液体积补至7毫升。5分钟后，将试管放入分离磁铁中，在试管仍置于磁铁中的情况下，将细胞悬液倒入15毫升锥形管中。接下来，取少量细胞 aliquot 用含2% FBS的PBS缓冲液稀释，加入抗CD3和抗CD8抗体，4°C避光孵育30分钟。通过流式细胞术确认细胞纯度达到95%以上CD8阳性。现在向五个螺口管中各加入225微升完全培养基，然后将细胞按1:2至1:32进行系列稀释。为分离CD4阳性目标细胞，首先在37摄氏度水浴中解冻自体冷冻保存的外周血单个核细胞（PBMC）。将解冻的细胞转移至含有10毫升培养基的50毫升锥形管中。通过磁性微粒分离法富集表达CD4的T细胞，方法如前所述，并通过流式细胞术确认CD4阳性T细胞纯度达到95%或更高。细胞计数后，将其分装至两个15毫升锥形管中，用预热的PBS洗涤，然后重悬于PBS中，浓度为每毫升2000万个细胞。在确保细胞避光的条件下，将一半的CD4阳性T细胞与新配制的CFSE高工作液孵育，终浓度为0.2毫摩尔，另一半与新配制的CFSE低工作液孵育，终浓度为0.04毫摩尔，在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育15分钟。染色结束后，离心收集细胞，并将细胞沉淀重悬于1毫升预热的完全培养基中，以终止标记反应。随后，在细胞培养箱中，将CFSE低浓度标记的CD4阳性T细胞与目标肽段在完全培养基中以终浓度5微克/毫升进行脉冲刺激，孵育45分钟。孵育后，用不完全培养基洗涤CFSC高T细胞群和低T细胞群，洗涤两次。将两种细胞悬液分别重悬于不完全培养基中，浓度为每毫升200,000个细胞。随后按CFSE高荧光细胞与CFSE低荧光细胞1:1的比例混合两种目标细胞群。现在将100 µL混合的靶向CD4阳性T细胞加入至圆底96孔板的每孔中，然后将每种CD8阳性T细胞悬液各1 µL以复孔方式接种，使每孔终体积为200 µL。通过设置仅含靶细胞的三孔来测量基础凋亡水平，随后将共培养体系在细胞培养孵箱中孵育6小时。孵育结束后，将细胞转移至VBO 96孔板中，并向每孔加入PE标记的肽-MHC四聚体染料染色15分钟。在细胞培养孵育箱中，用添加了2% FBS的PBS洗涤细胞，洗涤后在4摄氏度避光条件下孵育细胞30分钟进行染色。再次将细胞沉淀重悬于100微升含2%甲醛的PBS中，并通过流式细胞术分析细胞。共培养后，细胞的分析和设门策略如以下散点图所示。通过前向散射与侧向散射分析活细胞中CFSE高表达与CFSE低表达的靶细胞比例，无论是否负载肽段。首先根据前向散射与侧向散射圈选活细胞，进一步限定为活死染料阴性且CD4阳性T细胞，再通过CFSE信号分析CFSE低表达与CFSE高表达细胞的比例。接着，设置更大的前向散射与侧向散射门以统计效应细胞和靶细胞的总数量（包括死亡和存活细胞）。在六小时孵育后，分析CD8阳性、四聚体阳性T细胞与CFSE低表达且CD4阳性T细胞的比例，以评估效应细胞与靶细胞的比例。通过圈选CD8阳性四聚体阳性细胞来确定效应性CD8阳性T细胞的总数。通过圈选CD4阳性T细胞、CFSE低表达以及活/死染色阳性和阴性细胞来确定靶细胞的总数。CFSE低表达细胞与CFSE高表达细胞的目标比例为1:1。当CD4阳性靶细胞在无效应细胞的条件下培养时，该比值显著下降。当CFSE低荧光强度的阳性脉冲细胞与包含抗原特异性CD8阳性效应T细胞的总CD8阳性T细胞群体共孵育时。随着该比值降低，CFSE低荧光CD4阳性脉冲靶细胞开始出现活/死染色阳性。效应细胞的稀释因此导致CFSE比值恢复，最终使存活的肽段脉冲CFSE低荧光CD4阳性靶T细胞数量恢复。随后可将特异性裂解百分比以效应细胞与靶细胞比值的对数形式作图。如图中所示，通过该图计算线性回归，利用趋势线方程计算裂解单位（lytic units）。这是指需要多少个CD8阳性效应T细胞来杀伤100万个靶向CD4阳性T细胞中的30%，以确定抗原特异性CD8阳性T细胞的内在细胞毒能力，并用于比较不同供体之间的实验结果。观看本视频后，您应能够充分掌握如何利用流式细胞术来检测抗原特异性CD T细胞的细胞毒活性。该技术也可轻松应用于您自身研究的其他T细胞类型。

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

基于细胞的流式细胞仪检测，以测量细胞毒活性

一种体外检测细胞因子诱导杀伤细胞细胞毒性的实验方法

本视频展示了自然杀伤细胞对荧光标记靶细胞的裂解活性。该方法通过染色死亡细胞，并利用流式细胞仪定量活细胞和死细胞，从而实现自然杀伤细胞介导的细胞毒性的检测。...

自然杀伤细胞介导的细胞毒作用检测样本制备用于流式细胞术分析

本视频展示了由预先激活的效应T细胞诱导癌细胞的凋亡检测实验。通过将这些细胞与带有荧光标记细胞核的癌细胞共培养，并加入可被caspase切割的荧光底物。发生凋亡的癌细胞其细胞核将呈现不同的荧光颜色，从而产生双荧光信号。该双荧光信号表明癌细胞正在经历凋亡过程。...

一种用于研究预先活化的CD8+ T细胞对癌细胞毒性的体外实验方法

我们描述了一种高通量单细胞检测方法，用于测量T细胞与肿瘤靶细胞共孵育时的细胞毒性。该方法采用高密度的弹性体微孔阵列（每个阵列约10万个亚纳升级微孔），将T细胞与靶细胞以特定比例在空间上进行限定，并结合荧光显微镜技术，实时监测效应细胞与靶细胞的结合以及后续的细胞凋亡过程。...

T细胞的定量高通量单细胞细胞毒性检测方法

全血细胞毒性检测（WCA）是一种将高通量细胞定位技术与荧光显微镜和自动图像处理相结合而开发的细胞毒性检测方法。本文描述了如何在人全血中实时分析经抗CD20抗体处理的淋巴瘤细胞，以提供定量的细胞毒性分析结果。...

人全血中的实时细胞毒性检测

本文介绍了一种简单且可靠的分析方法，可用于检测不同NK细胞亚群的脱颗粒、细胞因子和趋化因子产生等多种NK细胞功能。...

基于流式细胞术的自然杀伤细胞功能检测方法

本研究介绍了一种用于准确、快速测定人血液样本中自然杀伤（NK）细胞数量及NK细胞毒性的先进工作流程。...

全血中自然杀伤细胞溶细胞活性的流式细胞术分析

本文展示了一种基于流式细胞术的定量测定人类自然杀伤细胞细胞毒活性的方法。...

基于流式细胞术的细胞毒性检测法用于评估人自然杀伤细胞活性

本文介绍了一种制备双乳液滴的方法，该液滴包封单个T细胞和一个癌细胞靶标，用于在单细胞水平上研究细胞杀伤作用。该方法能够在大量T细胞中同时定量检测细胞毒性分子和靶细胞的凋亡情况。...

基于液滴的单细胞水平评估嵌合抗原受体T细胞毒性的检测方法

本方案提供了一种标准化的 体外...

利用活细胞成像和流式细胞术定量分析嵌合抗原受体与治疗性抗体增强的自然杀伤细胞毒性

学习基于细胞的流式细胞术检测方法，用于测量抗原特异性CD8+ T细胞的细胞毒活性。该方法通过共培养效应T细胞与靶细胞，利用流式细胞仪精确定量杀伤效率，为免疫学研究提供可靠的细胞毒性评估工具。

基于细胞的流式细胞术检测细胞毒活性

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