基于细胞的流式细胞术检测细胞毒活性

本实验的总体目标是利用基于细胞的流式细胞术检测方法，测定抗原特异性CD8+ T细胞的细胞毒性活性。首先，在含有目标肽段的条件下，将效应CD8+ T细胞扩增培养6天；第二步，用目标肽段刺激靶CD4+ T细胞，然后与未刺激的CD4+ T细胞混合；接下来，将效应CD8+ T细胞与靶CD4+ T细胞在不同效靶比条件下共培养6小时。

最后一步中，通过流式细胞术定量分析加载了肽段的靶向 CD4 T 细胞的杀伤情况以及效应 CD8 T 细胞的数量。最终，可计算出抗原特异性 CD8 T 细胞以裂解单位表示的内在杀伤能力。该技术相较于传统的铬释放试验的主要优势在于，该方法使用自体原代靶细胞，而非永生化细胞系，并更接近真实的靶细胞。

该方法可在单细胞水平上对效应细胞数量进行定量。接下来，我实验室的研究助理将演示分离CD8阳性效应细胞的操作步骤。首先，在37摄氏度水浴中复苏自体冷冻保存的外周血单个核细胞（PBMC），然后用最多50毫升完全培养基洗涤细胞。

计数后，将PBMC用完全培养基稀释至浓度为每毫升500万个细胞，然后向培养物中加入IL-2和目标肽段。接着，将1毫升细胞悬液接种至96孔板的每个孔中。培养3天后，更换一半上清液为新鲜的完全培养基。培养6天后，使用多通道移液器将细胞转移至无菌储液槽中，然后进行细胞计数和洗涤。

将沉淀重悬于分离缓冲液中，调整细胞密度为每毫升5000万个细胞，在14毫升圆底试管中加入人CD8阳性T细胞富集混合液，每毫升细胞加入50微升，室温孵育。10分钟后，加入抗CD8 IgG偶联磁性颗粒，每毫升细胞加入150微升，继续孵育5分钟，随后用额外的分离缓冲液将细胞悬液体积补至7毫升。5分钟后，将试管放入分离磁铁中，在试管仍置于磁铁中的情况下，将细胞悬液倒入15毫升锥形管中。接下来，取少量细胞 aliquot 用含2% FBS的PBS缓冲液稀释，加入抗CD3和抗CD8抗体，4°C避光孵育30分钟。

通过流式细胞术确认细胞纯度达到95%以上CD8阳性。现在向五个螺口管中各加入225微升完全培养基，然后将细胞按1:2至1:32进行系列稀释。为分离CD4阳性目标细胞，首先在37摄氏度水浴中解冻自体冷冻保存的外周血单个核细胞（PBMC）。

将解冻的细胞转移至含有10毫升培养基的50毫升锥形管中。通过磁性微粒分离法富集表达CD4的T细胞，方法如前所述，并通过流式细胞术确认CD4阳性T细胞纯度达到95%或更高。细胞计数后，将其分装至两个15毫升锥形管中，用预热的PBS洗涤，然后重悬于PBS中，浓度为每毫升2000万个细胞。

在确保细胞避光的条件下，将一半的CD4阳性T细胞与新配制的CFSE高工作液孵育，终浓度为0.2毫摩尔，另一半与新配制的CFSE低工作液孵育，终浓度为0.04毫摩尔，在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育15分钟。染色结束后，离心收集细胞，并将细胞沉淀重悬于1毫升预热的完全培养基中，以终止标记反应。随后，在细胞培养箱中，将CFSE低浓度标记的CD4阳性T细胞与目标肽段在完全培养基中以终浓度5微克/毫升进行脉冲刺激，孵育45分钟。

孵育后，用不完全培养基洗涤CFSC高T细胞群和低T细胞群，洗涤两次。将两种细胞悬液分别重悬于不完全培养基中，浓度为每毫升200,000个细胞。随后按CFSE高荧光细胞与CFSE低荧光细胞1:1的比例混合两种目标细胞群。

现在将100 µL混合的靶向CD4阳性T细胞加入至圆底96孔板的每孔中，然后将每种CD8阳性T细胞悬液各1 µL以复孔方式接种，使每孔终体积为200 µL。通过设置仅含靶细胞的三孔来测量基础凋亡水平，随后将共培养体系在细胞培养孵箱中孵育6小时。孵育结束后，将细胞转移至VBO 96孔板中，并向每孔加入PE标记的肽-MHC四聚体染料染色15分钟。

在细胞培养孵育箱中，用添加了2% FBS的PBS洗涤细胞，洗涤后在4摄氏度避光条件下孵育细胞30分钟进行染色。再次将细胞沉淀重悬于100微升含2%甲醛的PBS中，并通过流式细胞术分析细胞。共培养后，细胞的分析和设门策略如以下散点图所示。

通过前向散射与侧向散射分析活细胞中CFSE高表达与CFSE低表达的靶细胞比例，无论是否负载肽段。首先根据前向散射与侧向散射圈选活细胞，进一步限定为活死染料阴性且CD4阳性T细胞，再通过CFSE信号分析CFSE低表达与CFSE高表达细胞的比例。接着，设置更大的前向散射与侧向散射门以统计效应细胞和靶细胞的总数量（包括死亡和存活细胞）。在六小时孵育后，分析CD8阳性、四聚体阳性T细胞与CFSE低表达且CD4阳性T细胞的比例，以评估效应细胞与靶细胞的比例。

通过圈选CD8阳性四聚体阳性细胞来确定效应性CD8阳性T细胞的总数。通过圈选CD4阳性T细胞、CFSE低表达以及活/死染色阳性和阴性细胞来确定靶细胞的总数。CFSE低表达细胞与CFSE高表达细胞的目标比例为1:1。

当CD4阳性靶细胞在无效应细胞的条件下培养时，该比值显著下降。当CFSE低荧光强度的阳性脉冲细胞与包含抗原特异性CD8阳性效应T细胞的总CD8阳性T细胞群体共孵育时。

随着该比值降低，CFSE低荧光CD4阳性脉冲靶细胞开始出现活/死染色阳性。效应细胞的稀释因此导致CFSE比值恢复，最终使存活的肽段脉冲CFSE低荧光CD4阳性靶T细胞数量恢复。随后可将特异性裂解百分比以效应细胞与靶细胞比值的对数形式作图。如图中所示，通过该图计算线性回归，利用趋势线方程计算裂解单位（lytic units）。

这是指需要多少个CD8阳性效应T细胞来杀伤100万个靶向CD4阳性T细胞中的30%，以确定抗原特异性CD8阳性T细胞的内在细胞毒能力，并用于比较不同供体之间的实验结果。观看本视频后，您应能够充分掌握如何利用流式细胞术来检测抗原特异性CD T细胞的细胞毒活性。该技术也可轻松应用于您自身研究的其他T细胞类型。