成像细胞膜损伤及参与修复的亚细胞过程

以下实验的总体目标是观察特定处理对受损细胞修复的影响，并研究参与修复受损细胞的亚细胞过程。该目标通过在荧光染料存在下造成细胞损伤来实现，这些荧光染料无法穿过完整的细胞膜，从而可评估受损细胞阻止染料进入的动力学过程及其能力。第二步，我们监测细胞内蛋白质在受损细胞膜上的出现情况，以确定特定细胞区室是否能够通过与受损细胞膜融合而参与修复过程。

接下来，我们监测目标细胞区室与受损细胞膜的融合，以观察损伤的动力学过程。该区室触发融合的结果表明，细胞膜损伤的修复与溶酶体外排有关，依据是溶酶体相关膜蛋白1在受损细胞表面的增加，以及受损细胞分泌溶酶体内容物的活体成像。这些方法有助于解答细胞损伤与修复领域的重要科学问题。

例如，这些方法可用于确定哪些蛋白质和细胞区室会对细胞膜局部损伤产生响应，并进一步评估其响应动力学。本实验操作将由我实验室的博士后研究员 Aurelia D four 和 hamma stra two 演示。以分别标记能够愈合的受损细胞和未能愈合的受损细胞。

将细胞接种于无菌盖玻片上，设置三种实验条件。培养细胞至融合度超过50%后，用37摄氏度的CIM洗涤C1和C2两次，用37摄氏度的PBS洗涤C3。

然后将盖玻片转移至硅胶O型环上。加入100 µL预热的fitzy葡聚糖溶液至适当的缓冲液中。通过在盖玻片上加入40 mg玻璃珠并在室温下手动倾斜盖玻片，对C one和C3处的细胞质膜进行损伤处理。

以30度角来回滑动六至八次，以造成轻度损伤。确保玻璃珠分布均匀，从而尽量减少重复损伤，提高样本间损伤的可重复性。同时对需比较的不同样本进行玻璃珠损伤处理，避免玻璃珠进一步滚动。

将所有盖玻片转移至37摄氏度、常压CO2的培养箱中，静置修复5分钟，期间避免珠子滚动。通过缓冲液或PBS洗涤去除玻璃珠和Fitzy葡聚糖。随后将盖玻片重新放回O型圈上，加入100微升预热的赖氨酸溶液。

孵育可固定三价右旋糖酐溶液，在37摄氏度、常压CO2条件下孵育5分钟。用预温的CIM洗涤盖玻片两次，经两次PBS洗涤后，室温下用4% PFA固定10分钟。在赫希奇染料中孵育2分钟，再经两次PBS洗涤后，使用封片剂将样品封于载玻片上。

接下来，使用来自 C 两个样本的落射荧光显微镜对细胞进行成像。确定背景的红色和绿色染色强度，然后利用该值对所有样本的红色和绿色通道进行阈值设定。

计数所有呈绿色的细胞总数。同时对C1和C3样本中呈红色或同时呈红色和绿色的细胞进行计数。然后针对每种条件，统计超过100个绿色损伤细胞，并将未能修复的细胞数占所有损伤细胞数的百分比表示出来。

用预热的 CIM 洗涤生长至超过 50% 汇合度的细胞，并将盖玻片置于含 FM 染料的 CIM 中，放入维持在 37 摄氏度的显微镜载物台培养箱内的支架上。使用适当的激光功率选择细胞膜区域，以实现稳定但非致死性的损伤。

使用脉冲激光对样品进行照射，时间少于10毫秒。通过软件将激光功率衰减至峰值功率的40%至50%，以便在损伤前开始，并在损伤后持续三到五分钟，每隔两到十秒在落射光、荧光和明场模式下监测、修复并采集图像。为定量分析修复动力学，测量细胞FM染料的荧光强度。

计算成像过程中强度的变化。对每种条件下的10个以上细胞的数据进行平均，并以平均值或单个细胞的数值作图。清洗C一和C二的盖玻片。

在37摄氏度下用CIM培养细胞，并在37摄氏度下用PBS洗涤C3。然后将样品转移至硅胶O型环上。加入100微升预热的赖氨酸可固定三西葡聚糖。

如前所述，在 C 一和 C3 处损伤质膜。然后避免珠子进一步滚动，将所有盖玻片转移至 37 摄氏度、常氧 CO2 的培养箱中，孵育五分钟以允许修复进行。

现在，为了去除玻璃珠和Trixie葡聚糖，用冷的完全培养基清洗盖玻片，注意确保玻璃珠不在细胞上滚动。用冷的完全培养基冲洗盖玻片两次，并转移至C1和C3的O型环上。加入100微升大鼠抗US lamp 1抗体（溶于冷的完全培养基中），并在C2中加入冷的完全培养介质，以允许抗体结合。在用冷的CIM洗涤三次后，于4摄氏度孵育盖玻片30分钟。

将所有盖玻片在室温下用 4% PFA 固定 10 分钟。然后用 CIM 洗涤三次。接着将所有盖玻片在 100 µL 封闭液中孵育 15 分钟，随后加入 100 µL Alexa Fluor 488 抗大鼠抗体，孵育 15 分钟。

用PBS洗涤两次，随后在室温下用赫氏染色液染色两分钟，染色前需进行两次PBS洗涤。将样品置于载玻片上，使用落射荧光显微镜对C二细胞的图像进行成像。测定红色和绿色通道中的非特异性背景染色。

使用这些背景染色值对所有样本的红色和绿色通道进行阈值设定。利用C1和C3中超过100个红色标记的细胞，测量lamp1在损伤细胞中的染色强度。在成功的实验中，C3中lamp1染色的细胞信号将显著低于C1中的细胞。为用荧光染料标记溶酶体，将生长至50%汇合度的细胞在含有FITC葡聚糖的生长培养基中孵育。

将葡聚糖置于细胞培养孵育箱中内吞作用 2 小时。用预热的生长培养基洗涤细胞，并在 CO₂ 孵育箱中继续孵育 2 小时，使所有内吞的葡聚糖在成像前积聚于溶酶体中。用预热的 CIM 冲洗盖玻片，并将其置于载玻片支架上的 CIM 中，放置于台式孵育器内，在 37 摄氏度下进行成像。

选择溶酶体未被拥挤的Fitzy葡聚糖标记的细胞用于成像。观察单个溶酶体的运动与胞吐过程。采集全视野图像以观察溶酶体在整个细胞内的运动。

交替采集细胞表面运动的草皮图像，并监测其胞吐作用。如前所述，通过辐照损伤细胞膜，以监测溶酶体对细胞损伤的响应，以每秒四到六帧的速度对细胞成像，持续至少两分钟或更长时间，具体时长取决于目标细胞中胞吐作用的动力学特征。在此群体检测中，所有受损细胞均被标记，未能修复的细胞被识别出来，而未受损细胞则保持无标记状态。

当细胞在存在钙离子的条件下进行修复时，经玻璃珠损伤并在fitzy葡聚糖存在下处理的细胞呈绿色标记。大多数受损细胞能够完成修复，因此在允许修复的情况下不会被trissy葡聚糖标记为红色。在缺乏钙离子时，大多数受损细胞则被trissy葡聚糖标记为红色。

本实验通过监测 FM 染料进入细胞的情况来评估细胞膜修复的动力学。在 FM 染料中孵育时，完整的细胞几乎不显示或完全不显示细胞内染色。在对细胞膜进行局部激光损伤后，FM 染料开始进入细胞并与胞内膜结合，导致 FM 染料荧光急剧增加，因为细胞膜在激光损伤后修复的能力依赖于钙离子。

在存在钙离子的条件下受损的细胞能够进行修复，导致损伤后一分钟内FM染料的进入即停止。相反，在无钙离子条件下无法完成修复的细胞则会持续摄入FM染料，因而损伤后四分钟内FM染料荧光信号仍持续增加。因此，细胞膜修复会导致FM染料染色信号趋于平稳。

当细胞膜修复功能缺失时，染料会持续进入细胞而无法达到平台期。通过大体积玻璃珠损伤法，可用来监测细胞在损伤后囊泡和蛋白质向细胞表面的转位情况。在此方法中，细胞在含有三羟甲基氨基甲烷-葡聚糖的环境中受到损伤。

因此，未受损的细胞不会呈现红色标记，而所有受损的细胞均被标记为红色。需要注意的是，未受损且未用一抗处理的细胞，其细胞表面LAMP1的标记水平处于背景水平。然而，当细胞受损并在钙存在条件下进行修复时，溶酶体会发生胞吐作用，因此受损细胞表面LAMP1的染色水平升高。

在无钙条件下允许修复的细胞中，细胞表面 Lamp1 标记的增加要低得多。因此，通过定量具有高细胞表面 Lamp1 染色的细胞数量，以及测量单个受损细胞上细胞表面 Lamp1 染色的水平，均可评估细胞发生损伤触发的溶酶体胞吐作用的能力。

本实验直接监测单个溶酶体融合的动力学、性质及位置。在细胞膜损伤发生时，通过脉冲激光对细胞进行损伤处理，并利用草坪成像技术（turf imaging）对细胞表面的溶酶体进行成像，从而实现对单个细胞中由损伤触发的溶酶体胞吐过程的监测。该图左侧面板显示的是通过相差成像观察到的细胞，中间面板则为通过草坪显微镜成像的结果。

右侧面板显示了损伤后105秒同一细胞的turf图像。此处可见损伤触发了溶酶体向细胞膜的募集，并随之发生胞吐作用。该溶酶体在损伤前的turf图像中不可见，但在损伤后到达细胞膜并变得可被检测到。

当囊泡向细胞膜靠近时，其受到光栅照明的激发效果更佳，导致溶酶体内的fitzy dex链荧光达到最大值。当融合孔打开后，溶酶体内的pH值被中和，从而解除对fitzy DExT链荧光的淬灭。随后，DExT链从囊泡释放到细胞外，导致ZI荧光在侧向扩散，同时囊泡荧光逐渐减弱。通过该过程可测量溶酶体所引发的多种损伤相关反应。

观看本视频后，您应能充分理解如何监测细胞对大面积局灶性损伤的修复能力，以及如何观察参与损伤应答并促进修复过程的亚细胞结构和蛋白质。为进一步研究，可使用不同的标签、活体标记、细胞器或特定蛋白质开展更多实验，以监测损伤后的细胞反应及其在 IND 细胞修复过程中的作用。