Name: 成像生物膜损伤和参与亚细胞修复过程 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-24T20:45:00.000+00:00
Duration: 16 min 44 s
Description: 了解利用荧光染料成像生物膜损伤和亚细胞修复过程的方法。本研究通过监测溶酶体胞吐作用揭示细胞修复机制，为细胞损伤治疗提供重要见解。

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本研究工作由美国国立卫生研究院基金项目 AR055686 和 AR060836 以及法国肌肉萎缩症协会（AFM）为 AD 提供的博士后奖学金资助。本研究所使用的细胞成像设施由美国国立卫生研究院基金项目 HD040677 支持。

1. 使用群体（玻璃珠）损伤法对细胞膜修复进行成像
该方案可分别标记受损细胞和未能愈合的细胞。定量分析这些细胞群体需要使用三种条件：1. 实验组（C1）——细胞在含有 Ca2+ 的环境中进行修复；2. 对照组1（无损伤，C2）——细胞在含有 Ca2+ 的环境中孵育，但不造成损伤；3. 对照组2（无修复，C3）——细胞在无 Ca2+ 的环境中进行修复。
<ol>
	<li>培养细胞至 &#62;在三个无菌盖玻片上接种至50%汇合度，用37 °C的CIM洗涤C1和C2两次，用37 °C的PBS洗涤C3两次，然后将盖玻片转移至硅胶O型环上。</li>
	<li>在C1和C2的CIM中加入100 μl预热的FITC葡聚糖溶液，或在C3的PBS中加入同样体积的溶液。</li>
	<li>通过手动将盖玻片在30°角度下前后倾斜6–8次，使40 mg玻璃珠在室温下轻轻滚过盖玻片表面，从而损伤C1和C3处的细胞质膜。 
	注意：对于轻度损伤，应确保玻璃珠均匀分布，从而最大限度地减少重复损伤。为提高不同样本间损伤的可重复性，应同时对需比较的不同样本进行玻璃珠损伤处理。</li>
	<li>避免珠子进一步滚动，将所有盖玻片转移至37 °C、常氧CO₂培养箱中2 并让修复反应进行5分钟。</li>
	<li>在不使珠子滚动的情况下，用 CIM（C1 和 C2）或 PBS（C3）在 37 °C 洗涤以去除玻璃珠和 FITC 葡聚糖。</li>
	<li>将盖玻片放回O型圈上，在C1和C2中加入100 μl预热的溶于CIM的赖氨酸可固定TRITC葡聚糖溶液，或在C3中加入溶于PBS的相应溶液。</li>
	<li>在37 °C、环境CO₂条件下孵育5分钟2.</li>
	<li>用预热的 CIM 洗涤盖玻片两次，然后在室温下用 4% PFA 固定 10 分钟。</li>
	<li>用 PBS 洗涤两次，随后在 Hoechst 染料中室温孵育 2 分钟。</li>
	<li>用 PBS 清洗样品两次，使用封片剂将样品固定在载玻片上，并使用落射荧光显微镜观察细胞。</li>
	<li>使用C2细胞确定红色和绿色染色的背景强度，并利用该值对所有样品（C1-C3）的红色和绿色通道进行阈值设定。</li>
	<li>统计 C1 和 C3 样本中 a) 绿色（受损并修复）和 b) 红色或红绿双色（受损但未修复）的细胞总数。</li>
	<li>计数 &#62;每种条件下计数100个绿色细胞，并将未能修复的细胞数占所有受损细胞（绿色和红色）的百分比表示。</li>
</ol>
2. 激光损伤后细胞膜修复动力学的活体成像
<ol>
	<li>用预热的 CIM 洗涤细胞，然后将盖玻片放入含有 FM 染料的 CIM 中。</li>
	<li>将盖玻片置于载物台顶部培养箱内的样品 holder 中，并维持在 37 °C。</li>
	<li>选择细胞膜上 1–2 mm2 的区域，使用脉冲激光照射 &#60;10 毫秒。通过软件将激光功率衰减至峰值功率的 40–50%。最佳功率应能产生稳定但非致死性的损伤，具体数值需根据所使用的不同仪器和细胞系通过反复试验确定。</li>
	<li>为监测修复过程，在损伤前开始，每隔 10 秒采集一次落射荧光和明场图像，持续至损伤后 3–5 分钟&#160;。 
	注意：对于无修复对照组，使用含 FM 染料的 PBS 缓冲液重复步骤 2.1–2.4。</li>
	<li>为定量分析修复动力学，测量细胞内 FM 染料的荧光强度，并绘制成像过程中荧光强度变化（ΔF/F0）。每种条件下应至少分析 10 个细胞的数据，根据需要绘制平均值或单个细胞的数值。</li>
</ol>
3. 成像检测大体积（玻璃微珠）损伤诱导的溶酶体胞吐作用
样本包括以下细胞，培养至&#62;50% 汇合度：1. 实验组（C1）— 在存在 Ca2+ 的条件下进行修复的细胞；2. 对照组1（C2；无损伤）— 未造成损伤且未与一抗孵育的细胞；3. 对照组2（C3；无修复）— 在无 Ca2+ 条件下进行修复的细胞。
<ol>
	<li>用 37 °C 的 CIM 洗涤盖玻片 C1 和 C2 两次，用 37 °C 的 PBS 洗涤盖玻片 C3 两次，并将它们转移至硅胶 O 形环上。</li>
	<li>在 C1 和 C2 上加入 100 μl 预热的可固定 TRITC 葡聚糖溶于 CIM 的溶液，在 C3 上加入溶于 PBS 的相同溶液。</li>
	<li>参照步骤 1.3，在 C1 和 C3 上损伤细胞质膜。</li>
	<li>避免玻璃珠进一步滚动，将所有盖玻片转移至 37 °C、常压 CO2 条件下的培养箱中，孵育 5 分钟以允许修复过程进行。</li>
	<li>用冷的生长培养基洗涤盖玻片，去除玻璃珠和 TRITC 葡聚糖，过程中需确保玻璃珠不在细胞表面滚动。</li>
	<li>用冷的生长培养基冲洗盖玻片两次，并转移回 O 形环上。</li>
	<li>向 C1 和 C3 加入 100 μl 冷的完全生长培养基中稀释的大鼠抗小鼠 LAMP1 抗体，向 C2 加入等量的冷的完全生长培养基。</li>
	<li>将盖玻片置于 4 °C 孵育 30 分钟，以允许抗体结合。</li>
	<li>用冷的 CIM 洗涤盖玻片三次，并用 4% PFA 在室温下固定 10 分钟&#160;，然后用 CIM 再洗三次。</li>
	<li>将所有盖玻片在室温下用 100 μl 封闭液孵育 15 分钟。</li>
	<li>将所有盖玻片在 4 °C 下用 100 μl Alexa Fluor 488 抗大鼠抗体孵育 15 分钟。</li>
	<li>用 PBS 洗涤两次，然后在 Hoechst 中室温孵育 2 分钟。</li>
	<li>用 PBS 洗涤细胞两次，用封片剂将盖玻片封于载玻片上，并使用落射荧光显微镜进行成像。</li>
	<li>根据 C2 细胞的图像，确定红色（TRITC 葡聚糖）和绿色（Alexa Fluor 488 抗体）通道中的非特异性背景染色，并利用这些背景染色值对所有样品（C1–C3）的红绿通道进行阈值设定。</li>
	<li>利用 C1 和 C3 中超过 100 个红色标记的细胞&#62;，测量受损细胞中 LAMP1 染色（绿色）的强度。成功的实验中，C3 来源细胞的 LAMP1 染色强度应显著低于 C1 来源细胞。</li>
</ol>
4. 细胞膜损伤诱导的亚细胞转运的活体成像
<ol>
	<li>荧光标记 通过转染适当的报告基因来标记目标区室例如&#160;溶酶体用 CD63-GFP8）或使用荧光染料9.</li>
	<li>用荧光染料标记溶酶体时，将生长至50%汇合度的细胞在含有FITC-葡聚糖的生长培养基中孵育</li>
	<li>在CO₂培养箱中孵育2小时（或根据目标细胞系的需要延长孵育时间，以实现足够的葡聚糖内体标记），使葡聚糖被细胞内吞2 培养箱</li>
	<li>用预热的生长培养基洗涤细胞，并在CO₂培养箱中孵育2小时2 孵育器中孵育，使所有内吞的葡聚糖均积累于溶酶体中。</li>
	<li>成像前，用预热的CIM冲洗盖玻片，并将其安装在置于载物台顶部培养箱内的盖玻片架中，于37 °C孵育。</li>
	<li>进行宽场成像（用于观察细胞内整体运动）或全内反射荧光成像（TIRF，用于观察细胞表面运动及胞吐作用）——溶酶体未被密集标记FITC葡聚糖的细胞最适合用于成像单个溶酶体的运动与胞吐过程。</li>
	<li>对成像显微镜的TIRF激光进行校准：使用60倍或100倍物镜 &#62;1.45 数值孔径。使用制造商提供的方法设置入射全内反射荧光（TIRF）激光束的角度。</li>
	<li>通过照射一小块区域（1-2 mm）来损伤细胞膜2区域用于 &#60;100 毫秒，脉冲激光衰减率为 40–50%。</li>
	<li>为监测溶酶体对细胞损伤的响应，以每秒4-6帧的速度对细胞成像，持续至少2分钟或更长时间，具体时长取决于目标细胞中外排作用的动力学特征。</li>
</ol>

<ol><li>Bi, G. Q., Alderton, J. M., Steinhardt, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-regulated+exocytosis+is+required+for+cell+membrane+resealing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Calcium-regulated exocytosis is required for cell membrane resealing.</a> Cell Biol. 131, 1747-1758 (1995).</li>
<li>Togo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+the+plasma+membrane+stimulates+rearrangement+of+microtubules+and+lipid+traffic+toward+the+wound+site%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Disruption of the plasma membrane stimulates rearrangement of microtubules and lipid traffic toward the wound site.</a> Cell Sci. 119, 2780-2786 (2006).</li>
<li>Miyake, K., McNeil, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicle+accumulation+and+exocytosis+at+sites+of+plasma+membrane+disruption%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Vesicle accumulation and exocytosis at sites of plasma membrane disruption.</a> Cell Biol. 131, 1737-1745 (1995).</li>
<li>Reddy, A., Caler, E. V., Andrews, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+membrane+repair+is+mediated+by+Ca2%2B-regulated+exocytosis+of+lysosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Plasma membrane repair is mediated by Ca2+-regulated exocytosis of lysosomes.</a> Cell. 106, 157-169 (2001).</li>
<li>Babiychuk, E. B., Monastyrskaya, K., Potez, S., Draeger, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blebbing+confers+resistance+against+cell+lysis%5BTitle%5D)+AND+%22Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Blebbing confers resistance against cell lysis.</a> Death Differ. 18, 80-89 Forthcoming.</li>
<li>Bansal, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+membrane+repair+in+dysferlin-deficient+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Defective membrane repair in dysferlin-deficient muscular dystrophy.</a> Nature. 423, 168-172 (2003).</li>
<li>Abreu-Blanco, M. T., Verboon, J. M., Parkhurst, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+wound+repair+in+Drosophila+occurs+through+three+distinct+phases+of+membrane+and+cytoskeletal+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell wound repair in Drosophila occurs through three distinct phases of membrane and cytoskeletal remodeling.</a> Cell Biol. 193, 455-464 (2011).</li>
<li>Jaiswal, J. K., Chakrabarti, S., Andrews, N. W., Simon, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptotagmin+VII+restricts+fusion+pore+expansion+during+lysosomal+exocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Synaptotagmin VII restricts fusion pore expansion during lysosomal exocytosis.</a> PLoS Biol. 2, 1224-1232 (2004).</li>
<li>McNeil, P. L., Clarke, M. F., Miyake, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+wound+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Protoc.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell wound assays.</a> Protoc. Cell Biol. Chapter 12, (2001).</li>
<li>McNeil, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+introduction+of+molecules+into+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Protoc.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Direct introduction of molecules into cells.</a> Protoc. Cell Biol. Chapter 20, (2001).</li>
<li>Knight, M. M., Roberts, S. R., Lee, D. A., Bader, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+cell+imaging+using+confocal+microscopy+induces+intracellular+calcium+transients+and+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol.+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Live cell imaging using confocal microscopy induces intracellular calcium transients and cell death.</a> J. Physiol. Cell Physiol. 284, C1083-C1089 (2003).</li>
<li>McNeil, P. L., Miyake, K., Vogel, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+endomembrane+requirement+for+cell+surface+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">The endomembrane requirement for cell surface repair.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 4592-4597 (2003).</li>
<li>Benink, H. A., Bement, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concentric+zones+of+active+RhoA+and+Cdc42+around+single+cell+wounds%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Concentric zones of active RhoA and Cdc42 around single cell wounds.</a> Cell Biol. 168, 429-439 (2005).</li>
<li>Schmoranzer, J., Goulian, M., Axelrod, D., Simon, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+constitutive+exocytosis+with+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Imaging constitutive exocytosis with total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Cell Biol. 149, 23-32 (2000).</li>
<li>Steyer, J. A., Horstmann, H., Transport Almers, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((docking+and+exocytosis+of+single+secretory+granules+in+live+chromaffin+cells%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">docking and exocytosis of single secretory granules in live chromaffin cells.</a> 388, 474-478 (1997).</li>
<li>Jaiswal, J. K., Andrews, N. W., Simon, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+proximal+lysosomes+are+the+major+vesicles+responsible+for+calcium-dependent+exocytosis+in+nonsecretory+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Membrane proximal lysosomes are the major vesicles responsible for calcium-dependent exocytosis in nonsecretory cells.</a> Cell Biol. 159, 625-635 (2002).</li>
<li>Jaiswal, J. K., Simon, S. M. Ch. 4.12. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJaiswal%2C+JK+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22">Current Protocols in Cell Biology</a>. , Wiley and Sons Inc. 4.12.1-4.12.15 (2003).</li>
<li>Johnson, D. S., Jaiswal, J. K., Simon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+internal+reflection+fluorescence+%28TIRF%29+microscopy+illuminator+for+improved+imaging+of+cell+surface+events%5BTitle%5D)+AND+%22Protoc.+Cytom%22%5BJournal%5D)">Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy illuminator for improved imaging of cell surface events.</a> Protoc. Cytom. Chapter 12, (2012).</li>
<li>Jaiswal, J. K., Simon, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+single+events+at+the+cell+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Imaging single events at the cell membrane.</a> Chem. Biol. 3, 92-98 (2007).</li>
</ol>

作者无任何披露信息。

细胞膜损伤 体内 由于多种生理应激因素引起，已有多种实验方法被开发用于模拟这些条件。这些方法包括通过刮除贴壁细胞或使其通过细孔注射器以损伤细胞膜9,10受伤后，这些细胞在悬浮状态下愈合，而非像在组织中那样附着于细胞外基质。另一些情况，例如使用成孔毒素，会通过提取胆固醇等脂质来化学改变细胞膜，因而无法模拟 体内 机械性损伤5因此，用于造成细胞损伤的方法可能影响对修复反应的研究结果。这要求不仅在选择细胞损伤检测方法时需谨慎，还应选用更能模拟机械性损伤的方法。 体内此类方法包括划痕损伤（使用手术刀或针头损伤细胞单层）和玻璃珠损伤（通过玻璃珠在贴壁细胞上滚动造成损伤）。这些方法适用于细胞损伤实验 大规模，但无法用于细胞膜修复过程的实时成像。利用微针和脉冲激光在撞击点产生局部且可控的损伤，可模拟机械性与创伤性损伤 体内 并且适用于实时成像修复反应，但仅能提供单个细胞修复过程的信息。值得注意的是，脉冲激光损伤方法不同于使用非脉冲激光对细胞膜进行持续照射的方法，后者通过局部加热造成膜损伤，已知会引发非生理效应，例如对膜...

细胞膜通过在细胞与细胞外环境之间形成屏障，维持细胞的完整性。当化学、电或机械刺激超过正常生理阈值，或存在入侵病原体时，均可能导致细胞膜损伤，并触发细胞后续的修复反应。为在细胞膜损伤后存活，细胞具备一种高效的修复机制。该机制依赖于钙离子，涉及多种蛋白质（如annexins和MG53等）的细胞内转运，以及内体、溶酶体、高尔基体来源的囊泡和线粒体等亚细胞结构向受损细胞膜的募集1-7。然而，参与修复受损细胞膜的分子和亚细胞事件的具体顺序仍不甚清楚。
细胞的修复反应可分为早期反应和晚期反应。早期反应发生在数秒至数分钟的时间尺度内，对决定晚期反应的性质（导致细胞成功修复或细胞死亡）具有极其重要的作用。基于整体生化和细胞分析的终点检测方法，已帮助确立了分子和细胞过程在修复中的参与。然而，由于细胞修复反应具有异质性和快速性，终点检测无法提供修复过程中事件序列的动力学和空间细节。能够实现对细胞膜的可控损伤，并可在高时空分辨率下监测细胞膜修复及相关亚细胞反应的方法，非常适合此类研究。本文介绍了这些方法。其中两个实验方案描述了在激光损伤后，于活细胞中实时监测细胞膜修复动力学及与修复过程相关的亚细胞反应的方法。作为对这些基于活细胞成像检测方法的补充，本文还介绍了终点检测方法，可用于在群体水平上评估单个细胞的修复情况及其相关的亚细胞反应。为展示这些方法的应用价值，已将其用于监测细胞膜损伤后溶酶体的 trafficking（转运）和胞吐作用。

<table><tbody><tr><td>HBSS</td><td>Sigma</td><td>H1387</td><td>用于配制 CIM（HBSS/10 mM Hepes/2 mM Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;，pH 7.4）</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher</td><td>BP410</td><td>用于配制 CIM（HBSS/10 mM Hepes/2 mM Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;，pH 7.4）</td></tr><tr><td>FITC 葡聚糖（可与赖氨酸交联）</td><td>Invitrogen</td><td>D1820</td><td>2 mg/ml，溶于 CIM 或 PBS</td></tr><tr><td>玻璃珠</td><td>Sigma</td><td>G8772</td><td></td></tr><tr><td>TRITC 葡聚糖（可与赖氨酸交联）</td><td>Invitrogen</td><td>D1818</td><td>2 mg/ml，溶于 CIM 或 PBS</td></tr><tr><td>PFA 16%</td><td>EMS</td><td>15710</td><td>使用时稀释为 PBS 中 4%</td></tr><tr><td> Hoechst </td><td>Invitrogen</td><td>H3570</td><td>PBS 中 1/10 000 稀释</td></tr><tr><td>FM 染料</td><td>Invitrogen</td><td>T3163</td><td>1 &amp;micro;g/&amp;micro;l，溶于 CIM 或 PBS</td></tr><tr><td>FITC 葡聚糖</td><td>Sigma</td><td>FD40S</td><td>2 mg/ml，溶于培养基</td></tr><tr><td>LAMP1&amp;nbsp;</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-19992</td><td>培养基中 1/300 稀释</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 鸡抗大鼠 IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A21470</td><td>封闭液中 1/500 稀释</td></tr><tr><td>封片剂</td><td>Dako</td><td>S3023</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>Fisher</td><td>12-545-86</td><td></td></tr><tr><td>玻璃底培养皿</td><td>MatTek corporation</td><td>P35G-1.0-14-C</td><td></td></tr><tr><td>硅胶 O 形圈</td><td>Bellco</td><td>1943-33315</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片支架</td><td>Bellco</td><td>1943-11111</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen</td><td>A-7816</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>VWR</td><td>12001-566</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>VWR</td><td>MP1400-500H</td><td>用于配制培养基：DMEM 中含 10% FBS 和 1% P/S</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>VWR</td><td>12001-350</td><td>用于配制培养基：DMEM 中含 10% FBS 和 1% P/S</td></tr><tr><td>鸡血清</td><td>Sigma</td><td>C5405</td><td>免疫染色封闭液中使用含 5% 鸡血清的 CIM</td></tr><tr><td>PBS（无 Ca²⁺ 和 Mg²⁺）</td><td>VWR</td><td>12001-664</td><td></td></tr><tr><td>落射荧光显微镜</td><td>Olympus America, PA</td><td>IX81</td><td></td></tr><tr><td>TIRF 照明装置&amp;nbsp;</td><td>Olympus America, PA</td><td>Cell^TIRF (IEC60825-1:2007)</td><td></td></tr><tr><td>落射荧光照明装置</td><td>Sutter Instruments, Novato CA</td><td>Lambda DG-4 (DG-4 30)</td><td></td></tr><tr><td>CCD 相机</td><td>Photometrics, Tucson, AZ</td><td>Evolve 512 EMCCD&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>图像采集与分析软件</td><td>Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO</td><td>Slidebook 5</td><td></td></tr><tr><td>脉冲激光器</td><td>Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO</td><td>Ablate (3iL13)</td><td></td></tr><tr><td>载物台培养箱</td><td>Tokaihit, Japan</td><td>INUBG2ASFP-ZILCS</td><td></td></tr></tbody></table>

成像细胞膜损伤及参与修复的亚细胞过程

Imaging Cell Membrane Injury and Subcellular Processes Involved in Repair

受损细胞的自我修复能力是一种基本的细胞过程，但参与受损细胞修复的细胞与分子机制目前仍不清楚。本文描述了几种用于监测培养细胞在局部损伤后修复能力及其动力学特征的实验方法。第一种方案介绍了一种基于终点的检测方法，可同时评估数百个细胞的细胞膜修复能力。第二种方案介绍了一种实时成像方法，用于在脉冲激光造成局部损伤后，监测单个细胞细胞膜修复的动力学过程。由于受损细胞的修复涉及特定蛋白质和亚细胞结构向损伤部位的转运，第三种方案描述了如何利用上述基于终点的方法，同时评估大量细胞中发生的某一类转运事件（溶酶体胞吐）。最后一种方案则介绍了结合脉冲激光损伤与全内反射荧光（TIRF）显微镜技术，以高空间和时间分辨率监测受损细胞中单个亚细胞结构动态变化的方法。尽管本文中的方案主要描述了这些方法在研究培养肌肉细胞中细胞膜修复与溶酶体胞吐之间关系的应用，但这些方法可直接适用于其他任何贴壁培养细胞以及选定的亚细胞结构。

本文所述的单细胞成像方案用于监测细胞膜修复的能力与动力学过程（方案1和2），以及修复过程中溶酶体的亚细胞转运与融合（方案3和4）。
方案1展示了一种整体检测方法，可用于标记所有受损细胞，并鉴定出那些受损后未能修复的细胞。图1结果显示，未受损细胞（图1A）未被标记，而通过玻璃珠造成损伤并在FITC葡聚糖存在下处理的细胞则呈现绿色标记（图1B和图1C）。当细胞在Ca2+存在条件下进行修复时，大多数受损（绿色）细胞能够完成修复，因而不会被TRITC葡聚糖标记为红色（图1B）。而当细胞在无Ca2+条件下修复时，大多数受损细胞则同时被TRITC葡聚糖标记为红色（图1C）。从未受损的细胞不会被TRITC葡聚糖标记。因此，在任意给定样本中，仅统计绿色标记的细胞数量可反映被玻璃珠损伤并成功修复的细胞数量；而统计双标记（红色和绿色）细胞的数量则可反映损伤后...

修复受损细胞的过程涉及特定蛋白质和亚细胞区室向细胞膜损伤部位的转运。本方案描述了监测这些过程的实验方法。

受损细胞的自我修复能力是一种基本的细胞过程，但参与修复受损细胞的细胞与分子机制仍不明确……

以下实验的总体目标是观察特定处理对受损细胞修复的影响，并研究参与修复受损细胞的亚细胞过程。该目标通过在荧光染料存在下造成细胞损伤来实现，这些荧光染料无法穿过完整的细胞膜，从而可评估受损细胞阻止染料进入的动力学过程及其能力。作为第二步，我们监测细胞内蛋白质在受损细胞膜上的出现情况，以确定特定细胞区室是否能够通过与受损细胞膜融合而参与修复过程。接下来，我们监测目标细胞区室与受损细胞膜的融合，以观察损伤的动力学过程。该区室触发融合的结果表明，细胞膜损伤的修复与溶酶体胞吐作用相关，依据是溶酶体相关膜蛋白1在受损细胞表面的表达增加，以及受损细胞溶酶体内容物分泌的活体成像观察。这些方法有助于解答细胞损伤与修复领域的重要科学问题。例如，这些方法可用于确定哪些蛋白质和细胞区室会对细胞膜局部损伤产生响应，并进一步评估其响应的动力学特征。本实验操作将由我实验室的博士后研究员 Aurelia D four 和 hamma stra two 演示。以分别标记能够修复损伤的细胞和无法完成修复的细胞。将细胞接种于无菌载玻片上，设置三种实验条件。培养细胞至融合度超过50%后，用37摄氏度的CIM洗涤C1和C2两次，用37摄氏度的PBS洗涤C3。然后将盖玻片转移至硅胶O型环上。加入100微升预热的fitzy葡聚糖溶液至适当的缓冲液中。通过在盖玻片上加入40毫克玻璃珠并在室温下手动倾斜盖玻片，以损伤C1和C3处的细胞质膜。对于轻度损伤，以30度角前后滑动六到八次。确保玻璃珠均匀分布，从而减少重复损伤，提高样本间损伤的可重复性。同时对需比较的不同样本进行玻璃珠损伤处理，避免珠子进一步滚动。将所有盖玻片转移至37摄氏度、常压CO2的培养箱中，静置修复5分钟，期间避免珠子滚动。通过缓冲液或PBS洗涤去除玻璃珠和Fitzy葡聚糖。随后将盖玻片重新放回O型圈上，加入100微升预热的赖氨酸溶液。可固定三价右旋糖酐溶液，在37摄氏度、常温CO2条件下孵育5分钟。用预热的CIM洗涤盖玻片两次，经两次PBS洗涤后，室温下用4% PFA固定10分钟。在赫希奇染液中孵育2分钟，再经两次PBS洗涤后，使用封片剂将样本封于载玻片上。接着，使用来自 C 两个样本的落射荧光显微镜对细胞成像。确定背景红色和绿色染色强度，然后利用该值对所有样本的红色和绿色通道进行阈值设定。对呈绿色的细胞进行总数计数。同时对C1和C3样本中呈红色或同时呈红色和绿色的细胞进行计数。随后，针对每种条件计数超过100个绿色损伤细胞，并将未能修复的细胞数占所有损伤细胞数的百分比表示出来。用预热的 CIM 洗涤生长至超过 50% 汇合度的细胞，并将盖玻片置于含 FM 染料的 CIM 中，放入维持在 37 摄氏度的显微镜载物台培养箱内的支架上。选择细胞膜的一个区域，使用最佳功率进行照射，以实现稳定但非致死性的损伤。使用脉冲激光照射样品，时间少于10毫秒。通过软件将激光功率衰减至峰值功率的40%至50%，以便在损伤前开始，并在损伤后持续三到五分钟，每隔两到十秒在落射光、荧光和明场模式下进行监测、修复和图像采集。为定量分析修复动力学，检测细胞FM染料的荧光强度。计算成像过程中强度的变化。对每种条件下的10个以上细胞的数据进行平均，并以平均值或单个细胞的数值作图。清洗C一和C二的盖玻片。在37摄氏度下用CIM培养细胞，并在37摄氏度下用PBS洗涤C3。然后将样品转移至硅胶O型环上。加入100微升预热的赖氨酸可固定三聚氰氨葡聚糖。如前所示，在 C 一和 C3 处损伤质膜。然后避免珠子进一步滚动，将所有盖玻片转移至 37 摄氏度、常压 CO2 的培养箱中，孵育五分钟以允许修复进行。现在，为了去除玻璃珠和Trixie葡聚糖，请用冷的完全培养基清洗盖玻片，注意确保玻璃珠不在细胞上滚动。用冷的完全培养基冲洗盖玻片两次，并将其转移至C1和C3的O型环上。在冷的完全培养基中加入100微升大鼠抗US lamp 1抗体，并将冷的完全培养基加入C2，以允许抗体结合。在用冷的CIM洗涤三次后，于4摄氏度孵育盖玻片30分钟。将所有盖玻片在室温下用 4% PFA 固定 10 分钟，然后用 CIM 洗涤三次。接着，将所有盖玻片加入 100 µL 封闭液中孵育 15 分钟，随后加入 100 µL 488 抗大鼠抗体孵育 15 分钟。用 PBS 洗涤两次，随后在室温下用 her 染色剂染色两分钟，染色前需进行两次 PBS 洗涤。将样品置于载玻片上，使用落射荧光显微镜对 C 两个细胞的图像进行成像。测定红色和绿色通道中的非特异性背景染色。使用这些背景染色值对所有样本的红色和绿色通道进行阈值设定。利用C1和C3中超过100个红色标记的细胞，测量lamp1在损伤细胞中的染色强度。在成功的实验中，C3中lamp1染色的细胞信号将显著低于C1中的细胞。为了用荧光染料标记溶酶体，将生长至50%汇合度的细胞在含有fitc标记葡聚糖（fitzy dextran）的生长培养基中孵育。让葡聚糖在细胞培养箱中内吞2小时。用预热的生长培养基洗涤细胞，并在CO2培养箱中继续孵育2小时，使所有内吞的葡聚糖在成像前积聚于溶酶体。用预热的CIM缓冲液冲洗盖玻片，然后将其置于载玻片支架上，在37 °C的台式培养箱中用CIM封片。选择溶酶体未被拥挤的Fitzy葡聚糖标记的细胞用于成像。观察单个溶酶体的运动与胞吐作用。采集宽场图像以观察溶酶体在整个细胞内的运动。交替采集细胞表面囊泡运动图像，并监测其胞吐过程。通过照射损伤细胞膜（如前所述），以监测溶酶体对细胞损伤的响应，以每秒四到六帧的速度对细胞成像，持续至少两分钟或更长时间，具体时长取决于目标细胞中胞吐作用的动力学特征。在此群体实验中，所有受损细胞均被标记，未能完成修复的细胞可被识别，而未受损细胞则保持无标记状态。在存在fitzy葡聚糖的情况下，经玻璃珠损伤的细胞在有钙条件下修复时呈绿色标记。当允许细胞进行修复时，大多数受损细胞能够完成修复，因而不会被trissy葡聚糖标记。在无钙条件下，大多数受损细胞则被trissy葡聚糖标记为红色。本实验通过监测 FM 染料进入细胞的情况来评估细胞膜修复的动力学。在 FM 染料中孵育时，完整的细胞几乎不显示或完全不显示细胞内染色。在对细胞膜进行局部激光损伤后，FM 染料开始进入细胞并结合胞内膜结构，导致 FM 染料荧光急剧增加，因为细胞膜在激光损伤后修复的能力依赖于钙离子。在钙存在的情况下受损的细胞能够进行修复，导致损伤后一分钟内FM染料的进入即停止。相反，若在无钙条件下允许细胞进行修复，则细胞无法完成修复，导致FM染料持续进入，即使在损伤后四分钟仍表现为FM染料荧光信号的持续增加。因此，细胞膜修复会导致FM染料染色信号达到平台期。尽管细胞膜修复功能的缺失会导致染料持续进入细胞而无法达到平台期。大量玻璃珠损伤法可用于监测细胞在损伤后囊泡和蛋白质向细胞表面的转位。在此方法中，细胞在三羟甲基氨基甲烷-葡聚糖存在下受到损伤。因此，未受伤的细胞不会被标记为红色，而所有受伤的细胞均被标记为红色。需要注意的是，未受伤且未用一抗处理的细胞，其细胞表面LAMP1的标记水平处于背景水平。然而，当细胞受伤并在钙存在条件下进行修复时，溶酶体会发生胞吐作用，因而受伤细胞表面LAMP1的染色水平升高。在允许无钙条件下愈合的细胞中，细胞表面 Lamp1 标记的增加要低得多。因此，无论是定量具有高细胞表面 Lamp1 染色的细胞数量，还是测量单个损伤细胞上细胞表面 Lamp1 染色的水平，均可作为评估细胞发生损伤触发的溶酶体胞吐能力的指标。本实验直接监测单个溶酶体融合的动力学、性质及位置。当细胞膜受损时，通过脉冲激光损伤细胞，利用TURF成像对细胞表面的溶酶体进行成像，从而可在单个细胞水平上监测损伤引发的溶酶体胞吐作用。该图左侧面板显示通过相差成像观察到的细胞，中间面板则显示通过TURF显微镜观察到的同一细胞。右侧面板显示了损伤后105秒同一细胞的turf图像。此处，损伤触发了溶酶体向细胞膜的募集，并显示了随后发生的胞吐作用。该溶酶体在损伤前的turf图像中不可见，但在损伤后，溶酶体到达细胞膜并变得可被检测到。当囊泡向细胞膜靠近时，其受到表面照明的激发效果更佳，导致溶酶体内的Fitzy Dex探针荧光达到最大值。当融合孔打开时，溶酶体内的pH值被中和，从而引起Fitzy DExT探针荧光的去猝灭。随后，DExT探针从囊泡释放至细胞外，导致ZI荧光在侧向扩散，同时囊泡荧光逐渐减弱。通过该过程可测量溶酶体所引发的多种损伤相关反应。观看本视频后，您应能充分理解如何监测细胞对大面积局灶性损伤的修复能力，以及如何观察响应损伤并参与修复过程的亚细胞结构和蛋白质。通过使用不同的标签、活体标记、细胞器或蛋白质，可进一步开展实验，以监测损伤后的细胞反应及其在IND细胞修复过程中的作用。

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