Name: 视网膜血流小鼠活体视频显微镜测量 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-26T14:15:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: 学习使用活体视频显微镜测量小鼠视网膜血流的方法。该技术通过荧光微球和葡聚糖示踪剂，精确量化血管直径与血流速度，为研究糖尿病视网膜病变等眼部疾病提供可靠的实验手段。

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由 NIH EY017599（NRH）资助。

涉及动物使用的实验方案均经路易斯安那州立大学健康科学中心-什里夫波特分校机构动物照护与使用委员会审查并批准，并依照美国国立卫生研究院规定的要求执行。
1. 灌注溶液的制备
<ol>
	<li>对浓度为1%（重量比）的1.9 µm直径微球储备液进行超声处理。</li>
	<li>用300 µl注射器吸取约25–30 ×&#160;106个绿色荧光微球（即约10 µl储备液），再吸入240 µl生理盐水，将微球稀释。</li>
	<li>配制50 µl无菌生理盐水溶液，其中溶解有分子量为2 ×&#160;106的荧光葡聚糖，注射剂量范围为3–10 mg/kg。在使用前，将葡聚糖溶液用铝箔包裹避光保存。</li>
</ol>
2. 动物麻醉与血管插管
<ol>
	<li>为进行血管插管手术以及在显微镜物镜下固定动物，需对动物实施麻醉。可选择的麻醉方案有多种，各有其优缺点，并可能对全身生理参数产生不同影响。常用方案包括&#160;氯胺酮（100–150 mg/kg）、赛拉嗪（10 mg/kg）和乙酰丙嗪（2 mg/kg）的联合使用，或氯胺酮（50 mg/kg）与戊巴比妥（50 mg/kg）联合使用。&#160; 本实验为急性实验，最终通过过量戊巴比妥（150 mg/kg）实施安乐死，随后行胸廓切开术；终末性操作无需使用镇痛剂。</li>
	<li>实验剩余时间内，将加热垫置于动物下方以维持体温。</li>
	<li>在后续进行血管插管手术期间，使用磷酸盐缓冲液保持眼睛湿润。</li>
	<li>准备用于后续注射荧光示踪剂的血管插管。取一段20&#160;cm长的聚乙烯导管（例如，内径0.28 mm，外径0.61 mm），将其套在注射器针头尖端，使用止血钳反复弯折预先折断针头的锐利端。</li>
	<li>用肝素化生理盐水（25 U/ml）填充注射器及导管。</li>
	<li>剃除下腹部一侧毛发，并做切口以暴露股静脉。</li>
	<li>为插入股静脉，先用5.0缝线结扎血管，然后对血管进行部分切开（约血管直径的一半），将导管插入血管，并用缝线结扎固定插管段。</li>
</ol>
3. 活体显微镜检查的准备
<ol>
	<li>使用一滴1%托吡卡胺滴眼液使瞳孔散大，随后再使用一滴2.5%羟丙甲纤维素滴眼液。</li>
	<li>用一片5&#160;mm的玻璃盖玻片覆盖眼睛。</li>
	<li>将动物放置在一块聚甲基丙烯酸甲酯（plexiglass）板上，该板将置于直立显微镜的物镜下方。在动物头部下方适当放置外科纱布，以确保物镜与视网膜中央及视盘之间形成直接的光轴通路。</li>
	<li>通过显微镜对准视盘，先使用低倍率4X&#160;物镜并配合荧光素滤光片找到视盘位置。</li>
</ol>
4. 注入荧光微球以测量流速
<ol>
	<li>使用4X&#160;物镜，将视网膜对焦，使视盘位于视野中央。</li>
	<li>以250 µl/min/kg的速率输注荧光微球溶液。</li>
	<li>使用约8毫秒的相机曝光时间，录像记录视盘周围可见的视网膜区域。</li>
	<li>当已录制足够时长的视频（1-2分钟）后，停止微球输注；部分微球溶液可能仍未使用。</li>
</ol>
5. 注入荧光血浆标记物以测量直径
<ol>
	<li>使用 4X&#160;物镜，将视网膜的视盘置于视野中央并进行聚焦。</li>
	<li>将制备好的荧光葡聚糖溶液经股静脉以团注方式在约 5 秒内注入，同时进行视频记录。该视频将有助于区分小动脉与小静脉，其中小动脉会首先被灌注。此步骤的相机曝光时间应设为约 8 毫秒，尽管精确的曝光时间并非关键。</li>
	<li>切换至 10X&#160;物镜，并将曝光时间设为 20–40 毫秒，以提高分辨率，对浅层视网膜中的 4–7 条小动脉和 4–7 条小静脉逐一进行视频记录。每次聚焦并视频记录可视视网膜的大约一个象限区域，使视盘中心位于视野的一个角落。应尽量减少显微镜光源照射组织的时间，以降低光/染料诱导的光毒性风险17。</li>
</ol>
6. 视频分析
<ol>
	<li>使用微米刻度尺对视频系统进行校准，以实现 µm/像素的换算。</li>
	<li>利用图像处理软件回放录制的视频。</li>
	<li>根据荧光葡聚糖团注视频，区分微动脉与微静脉。</li>
	<li>针对使用10X&#160;物镜记录的每根4-7条微动脉和4-7条微静脉，测量其中被荧光葡聚糖填充的血管直径，并在每条血管可见长度范围内取5个测量值取平均。</li>
	<li>对上述相同的微动脉和微静脉，测量荧光微球的轨迹长度，每条血管内选取连续10个微球轨迹以避免选择偏差。将轨迹长度除以曝光时间，计算微球速度，例如：160 µm/8 msec = 20 µm/msec = 2 cm/sec。每条血管取10个速度值取平均。</li>
	<li>使用以下公式计算每条血管的体积流量：流量 = 平均速度 × π × 直径2/4。</li>
	<li>分别对所有微动脉和微静脉的流量进行加总，得到总的视网膜血流量。</li>
</ol>

<ol><li>Wang, L., Fortune, B., Cull, G., McElwain, K. M., Cioffi, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microspheres+method+for+ocular+blood+flow+measurement+in+rats%3A+size+and+dose+optimization%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Microspheres method for ocular blood flow measurement in rats: size and dose optimization.</a> Exp. Eye Res. 84, 108-117 (2007).</li>
<li>Wang, L., Grant, C., Fortune, B., Cioffi, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+and+choroidal+vasoreactivity+to+altered+PaCO2+in+rat+measured+with+a+modified+microsphere+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Retinal and choroidal vasoreactivity to altered PaCO2 in rat measured with a modified microsphere technique.</a> Exp. Eye Res. 86, 908-913 (2008).</li>
<li>Pouliot, M., Hetu, S., Lahjouji, K., Couture, R., Vaucher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+retinal+blood+flow+by+kinin+B%281%29+receptor+in+Streptozotocin-diabetic+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Modulation of retinal blood flow by kinin B(1) receptor in Streptozotocin-diabetic rats.</a> Exp. Eye Res. 92, 482-489 (2011).</li>
<li>Pouliot, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+and+regional+measurement+of+retinal+blood+flow+in+rats+using+N-isopropyl-p-%5B14C%5D-iodoamphetamine+%28%5B14C%5D-IMP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Quantitative and regional measurement of retinal blood flow in rats using N-isopropyl-p-[14C]-iodoamphetamine ([14C]-IMP).</a> Exp. Eye Res. 89, 960-966 (2009).</li>
<li>Zhi, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Volumetric+and+quantitative+imaging+of+retinal+blood+flow+in+rats+with+optical+microangiography%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Opti.+Express%22%5BJournal%5D)">Volumetric and quantitative imaging of retinal blood flow in rats with optical microangiography.</a> Biomed. Opti. Express. 2, 579-591 (2011).</li>
<li>Zhi, Z., Cepurna, W. O., Johnson, E. C., Morrison, J. C., Wang, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+intraocular+pressure+on+changes+of+blood+flow+in+the+retina%2C+choroid%2C+and+optic+nerve+head+in+rats+investigated+by+optical+microangiography%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Opti.+Express%22%5BJournal%5D)">Impact of intraocular pressure on changes of blood flow in the retina, choroid, and optic nerve head in rats investigated by optical microangiography.</a> Biomed. Opti. Express. 3, 2220-2233 (2012).</li>
<li>Li, G., De La Garza, B., Shih, Y. Y., Muir, E. R., Duong, T. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Layer-specific+blood-flow+MRI+of+retinitis+pigmentosa+in+RCS+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Layer-specific blood-flow MRI of retinitis pigmentosa in RCS rats.</a> Exp. Eye Res. 101, 90-96 (2012).</li>
<li>Muir, E. R., Renteria, R. C., Duong, T. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+ocular+blood+flow+as+an+early+indicator+of+diabetic+retinopathy+in+a+mouse+model+of+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Reduced ocular blood flow as an early indicator of diabetic retinopathy in a mouse model of diabetes.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 53, 6488-6494 (2012).</li>
<li>Wright, W. S., Harris, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ozagrel+attenuates+early+streptozotocin-induced+constriction+of+arterioles+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Ozagrel attenuates early streptozotocin-induced constriction of arterioles in the mouse retina.</a> Exp. Eye Res. 86, 528-536 (2008).</li>
<li>Lee, S., Harris, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Losartan+and+ozagrel+reverse+retinal+arteriolar+constriction+in+non-obese+diabetic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Losartan and ozagrel reverse retinal arteriolar constriction in non-obese diabetic mice.</a> Microcirculation. 15, 379-387 (2008).</li>
<li>Wright, W. S., Messina, J. E., Harris, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attenuation+of+diabetes-induced+retinal+vasoconstriction+by+a+thromboxane+receptor+antagonist%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Attenuation of diabetes-induced retinal vasoconstriction by a thromboxane receptor antagonist.</a> Exp. Eye Res. 88, 106-112 (2009).</li>
<li>Wang, Z., Yadav, A. S., Leskova, W., Harris, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attenuation+of+streptozotocin-induced+microvascular+changes+in+the+mouse+retina+with+the+endothelin+receptor+A+antagonist+atrasentan%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Attenuation of streptozotocin-induced microvascular changes in the mouse retina with the endothelin receptor A antagonist atrasentan.</a> Exp. Eye Res. 91, 670-675 (2010).</li>
<li>Yadav, A. S., Harris, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+tempol+on+diabetes-induced+decreases+in+retinal+blood+flow+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Effect of tempol on diabetes-induced decreases in retinal blood flow in the mouse.</a> Curr. Eye Res. 36, 456-461 (2011).</li>
<li>Wang, Z., Yadav, A. S., Leskova, W., Harris, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+20-HETE+attenuates+diabetes-induced+decreases+in+retinal+hemodynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Inhibition of 20-HETE attenuates diabetes-induced decreases in retinal hemodynamics.</a> Exp. Eye Res. 93, 108-113 (2011).</li>
<li>Wright, W. S., Yadav, A. S., McElhatten, R. M., Harris, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+blood+flow+abnormalities+following+six+months+of+hyperglycemia+in+the+Ins2%28Akita%29+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Retinal blood flow abnormalities following six months of hyperglycemia in the Ins2(Akita) mouse.</a> Exp. Eye Res. 98, 9-15 (2012).</li>
<li>Lee, S., Morgan, G. A., Harris, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ozagrel+reverses+streptozotocin-induced+constriction+of+arterioles+in+rat+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Ozagrel reverses streptozotocin-induced constriction of arterioles in rat retina.</a> Microvasc. Res. 76, 217-223 (2008).</li>
<li>Rumbaut, R. E., Sial, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+phototoxicity+of+fluorescent+dye-labeled+albumin+conjugates%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Differential phototoxicity of fluorescent dye-labeled albumin conjugates.</a> Microcirculation. 6, 205-213 (1999).</li>
<li>Tadayoni, R., Paques, M., Gaudric, A., Vicaut, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Erythrocyte+and+leukocyte+dynamics+in+the+retinal+capillaries+of+diabetic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Erythrocyte and leukocyte dynamics in the retinal capillaries of diabetic mice.</a> Exp. Eye Res. 77, 497-504 (2003).</li>
<li>Walsh, M. K., Quigley, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+time-lapse+fluorescence+imaging+of+individual+retinal+ganglion+cells+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">In vivo time-lapse fluorescence imaging of individual retinal ganglion cells in mice.</a> J. Neurosci. Methods. 169, 214-221 (2008).</li>
<li>Shahidi, M., Wanek, J., Blair, N. P., Mori, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+mapping+of+chorioretinal+vascular+oxygen+tension+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional mapping of chorioretinal vascular oxygen tension in the rat.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 50, 820-825 (2009).</li>
<li>Hughes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+schematic+eye+for+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Vis.+Res%22%5BJournal%5D)">A schematic eye for the rat.</a> Vis. Res. 19, 569-588 (1979).</li>
<li>Remtulla, S., Hallett, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+schematic+eye+for+the+mouse%2C+and+comparisons+with+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Vis.+Res%22%5BJournal%5D)">A schematic eye for the mouse, and comparisons with the rat.</a> Vis. Res. 25, 21-31 (1985).</li>
<li>Schmucker, C., Schaeffel, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+biometry+in+the+mouse+eye+with+low+coherence+interferometry%5BTitle%5D)+AND+%22Vis.+Res%22%5BJournal%5D)">In vivo biometry in the mouse eye with low coherence interferometry.</a> Vis. Res. 44, 2445-2456 (2004).</li>
<li>Mulivor, A. W., Lipowsky, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation-+and+ischemia-induced+shedding+of+venular+glycocalyx%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Inflammation- and ischemia-induced shedding of venular glycocalyx.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 286, 1672-1680 (2004).</li>
<li>Harris, N. R., Whatley, J. R., Carter, P. R., Specian, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Venular+constriction+of+submucosal+arterioles+induced+by+dextran+sodium+sulfate%5BTitle%5D)+AND+%22Inflamm.+Bowel+Dis%22%5BJournal%5D)">Venular constriction of submucosal arterioles induced by dextran sodium sulfate.</a> Inflamm. Bowel Dis. 11, 806-813 (2005).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

这种活体视频显微技术不仅可用于小鼠，也可用于大鼠。本方案仅基于少数几个假设，但如我们所述，其应用仅限于麻醉和瞳孔扩张条件下。其他假设与局限性如下：
1. 假设由于眼睛的折射特性导致的光学放大误差极小。正如其他研究者所述18-20，通过在角膜与盖玻片之间填充眼科溶液液体层，可抵消角膜的折射能力。任何未被校正的放大效应都会影响长度和直径的测量结果。
2. 光学分辨率的局限性。我们通常使用10X&#160;物镜（工作距离 = 1.05 cm）进行直径测量，该物镜的数值孔径为0.25，标称分辨率为~1.2 µm（约等于测量的不确定度）。在当前放大倍数下，整体分辨率不受相机/图像处理器分辨率的限制；无像素合并时为0.47 µm/像素，2 x&#160;2像素合并时为0.94 µm/像素。只要工作距离足够，本方案可采用更高数值孔径的物镜以提高分辨率：小鼠和大鼠眼球的轴向长度分别约为3.4 mm和6.3 mm21-23。
<p...

视网膜是人体中代谢最活跃的组织之一，因此需要充足的血液供应。两套独立的循环系统满足这一需求：脉络膜循环供应视网膜外层，视网膜循环供应视网膜内层。对视网膜灌注的研究对于理解糖尿病性视网膜病变、氧诱导性视网膜病变、视网膜动脉或静脉阻塞以及中风的病理机制和后果至关重要。已有多种方法用于定量测量视网膜血流，每种技术都有其优势、劣势、局限性和假设条件。这些技术包括注入直径为7-8 μm的微球，使其嵌顿于毛细血管前微动脉1,2、定量放射自显影3,4、光学微血管成像-光学相干断层扫描5,6、磁共振成像7,8以及活体视频显微技术9-16。其中，活体视频显微技术的优势包括可直接实时观察视网膜血管及其血流、所需假设较少，以及对于配备荧光显微镜和连接视频相机的实验室而言成本较低。在以往的活体视频显微研究9-16中，通常使用荧光标记的葡聚糖作为血浆标记物，使用荧光标记的红细胞（来自供体动物）作为流速标记物。在本实验方案中，采用直径为1.9 μm的荧光标记微球代替红细胞来测量流速，这一改进消除了对血液供体动物的需求。

<table><tbody><tr><td>荧光微球</td><td>Bangs Laboratories</td><td>FS04F/10584 (绿色)</td><td></td></tr><tr><td>高分子量荧光葡聚糖</td><td>Molecular Probes</td><td>D-7137 (绿色); D-7139 (红色)</td><td></td></tr><tr><td>显微镜系统</td><td>Nikon</td><td>Eclipse E600FN + 附件</td><td></td></tr><tr><td>4X 物镜</td><td>Nikon</td><td>Plan Fluor 4X</td><td>数值孔径 0.13；工作距离 17.2 mm</td></tr><tr><td>10X 物镜</td><td>Nikon</td><td>Plan 10X</td><td>数值孔径 0.25；工作距离 10.5 mm</td></tr><tr><td>托吡卡胺滴眼液</td><td>Bausch & Lomb</td><td>1% 托吡卡胺</td><td></td></tr><tr><td>羟丙甲纤维素滴眼液</td><td>HUB Pharmaceuticals</td><td>2.5% Goniovisc</td><td></td></tr><tr><td>图像处理软件</td><td>加利福尼亚大学旧金山分校 Vale 实验室</td><td>Micro-Manager</td><td></td></tr><tr><td>显微用数字摄像机</td><td>Photometrics</td><td>CoolSnap ES</td><td>分辨率 1392 x 1040 像素；像素尺寸 6.45 x 6.45 &amp;mu;m</td></tr></tbody></table>

小鼠视网膜血流的活体视频显微测量

Intravital Video Microscopy Measurements of Retinal Blood Flow in Mice

视网膜血流的改变可能促成或源于眼部疾病和视觉功能障碍。因此，定量测定灌注变化有助于研究视网膜病变的机制。通过活体荧光示踪剂视频显微镜技术，可测量视网膜血管的血管直径和血流速度，特别是由中央视网膜动脉分支出的动脉以及汇入中央视网膜静脉的静脉。通过血管直径和血流速度可计算血流量，将所有小动脉血流和小静脉血流分别加总，即可获得总的视网膜血流量。本文及配套视频描述了在小鼠中应用该技术的方法，包括：1）对麻醉动物进行活体显微观察前的眼部准备；2）静脉输注荧光微球以测量血流速度；3）静脉输注高分子量荧光葡聚糖，以增强视网膜微血管的显微可视性；4）使用数字显微相机获取灌注后视网膜的视频；以及 5）使用图像处理软件分析视频。这些相同技术也可用于测量大鼠的视网膜血流速率。

图1 显示一项实验视频的单帧图像，其中图A-D和F-I为使用4X物镜捕获的荧光微球轨迹&#160;物镜，8毫秒曝光时间（及2× binning）&#160;2 像素以减小视频文件大小）。 图1E 显示了图中其他面板中视网膜血管的走向。并非视频的每一帧都会有一个清晰对焦的荧光条带；然而，部分帧可能包含多个可用于分析的条带（例如&#160;C、D、G、H 和 I）。在本实验中，大多数荧光条带（曝光时间为 8 msec 时捕获）的长度在 120–170 范围内 &#181;m，相当于流速为1.5–2.1 cm/sec。
图2展示了通过团注输入2×&#160;106分子量的荧光素异硫氰酸酯标记葡聚糖后视频的九个帧，所选帧之间的时间间隔为0.071秒（为帧采集速率的两倍）。图2中第一幅与最后一幅图像之间的时间长度约为0.57秒。首先被荧光葡聚糖填充的血管（见图A-D）为小动脉，在此对应于约1:30、4:30、7:00和...

活体显微镜可用于动物，以观察和测量视网膜血管直径、血流速度以及总视网膜血流量。

视网膜血流的改变可能促成或导致眼部疾病和视觉功能障碍。因此，对异常血流进行定量分析……

本实验的总体目标是测量小鼠的视网膜血流。首先通过插管麻醉小鼠的股静脉注入荧光微球，实现血流标记；第二步是录像记录微球在小鼠视网膜血管中的流动过程。接下来，通过股静脉注入荧光葡聚糖，并拍摄其流经视网膜血管的视频。最后一步是从录制的视频中测量微球流速和血管直径，以计算视网膜血流量。该技术的主要优势在于能够使用标准荧光显微镜精确测量视网膜血流量。该方法有助于回答视网膜研究领域中的关键问题，例如血流变化在多大程度上导致糖尿病性视网膜病变。尽管我们将以小鼠的视网膜为例来演示该技术，但该通用方法也可应用于其他组织以及大鼠。将1%的1.9微米直径微球原液进行超声处理，取10微升原液注入300微升注射器中，然后吸入240微升无菌生理盐水稀释微球。接着，配制50微升荧光葡聚糖溶液，用足够的无菌生理盐水溶解，使其注射剂量为每千克体重5毫克。然后用铝箔包裹葡聚糖溶液，避光保存至使用时。在麻醉动物并用足趾夹捏测试确认麻醉效果充分后，将加热垫放置于动物身下。用磷酸盐缓冲液保持眼睛湿润。接着，用止血钳反复弯折注射器针头的尖端，使其折断。然后将一段20厘米长的聚乙烯导管套在针头的钝端，并用肝素化生理盐水充满导管。现在配制浓度为每毫升25单位的肝素化生理盐水溶液。剃除下腹部一侧的毛发后，用该溶液充满注射器，在腹部与腿部交界处做一个1厘米长的切口，以暴露股静脉。然后用5-0缝线在股静脉扩张处近端结扎血管。接着，沿血管直径的一半做部分切口，并将导管以高于水平方向20至30度的角度沿血管轴线插入血管内。用缝线结扎套管插入部位，固定导管。为进行显微镜观察，先向动物眼部滴加一滴1%托吡卡胺眼用溶液以散大瞳孔，随后滴加一滴2.5%去氧肾上腺素眼用溶液。然后用直径为5毫米的玻璃盖玻片覆盖眼睛。将动物放置于有机玻璃板上后，将该板置于直立显微镜的物镜下方。将手术纱布置于头部下方，以便物镜与中央视网膜及视盘之间形成直接轴线。使用 Forex 物镜和荧光素滤光片，对准视盘并使其保持在视野中央。随后，以每分钟每公斤 250 微升的速度将荧光微球溶液注入股静脉。使用八毫秒的相机曝光时间，录制视盘周围可见视网膜的视频。停止微球灌注。三分钟后，可能仍有部分微球溶液未使用。在五秒内将荧光葡聚糖的预配溶液以团注方式注入股静脉。开始测量视网膜血管直径时，先使用Forex物镜对准视盘并保持聚焦，随后切换至10倍物镜和40毫秒曝光时间。在浅层视网膜中，分别采集四到七条动脉和四到七条静脉的高分辨率视频。每次聚焦于可视视网膜的一个象限，将视盘中心置于视野的一角。每个象限仅记录10至15秒，以尽量减少光毒性风险。现在，分析视频以确定流速和总视网膜血流量。使用微米刻度，通过图像处理软件对视频系统进行校准，将微米转换为像素。回放荧光葡聚糖团注输注过程的录制视频。识别动脉及其灌注的静脉。测量充满荧光葡聚糖的各条动脉和静脉的直径。沿可观察长度

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小鼠视网膜血流的活体视频显微测量

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