视网膜血流小鼠活体视频显微镜测量
2013年12月26日
活体显微镜可用于动物，以可视化和测量视网膜血管直径、血流速度和视网膜总血流量。
该程序的总体目标是测量小鼠的视网膜血流。这是通过首先通过麻醉小鼠的空管股静脉注入荧光微球来实现的。第二步是视频记录流经小鼠视网膜血管的微球。
接下来，通过股静脉注入荧光葡聚糖，并在其流经视网膜血管时捕获视频。最后一步是从录制的视频中测量微球速度和血管直径，以计算视网膜血流。该技术的一个主要优点是能够使用标准荧光显微镜准确测量视网膜血流。
这种方法可以帮助回答视网膜视野中的关键问题，例如血流变化在多大程度上导致糖尿病视网膜病变。尽管我们将在小鼠的视网膜中演示这项技术。一般方法可用于其他组织，也可用于大鼠。
对直径为 1.9 微米的微球的 1% 储备溶液进行超声处理，将 10 微升储备溶液抽入 300 微升注射器中，然后通过将 240 微升无菌盐水吸入注射器中来稀释微球。接下来，制备 50 微升荧光葡聚糖溶液，溶解在足够的无菌盐水中，使注射剂量为每公斤 5 毫克。然后用铝箔覆盖葡聚糖，直到其融合。
在麻醉动物并通过牵引捏测试充分麻醉后，在动物下方放置一个加热垫。用磷酸盐缓冲盐水保持眼睛湿润。接下来，用止血钳来回弯曲注射器针头的锋利尖端，将其折断。
然后将一根 20 厘米长的聚乙烯管放在针头的钝尖上，并用肝素盐水填充管子。现在制备每毫升 25 单位的肝素化盐水溶液。剃除下腹部一侧后，用肝素盐水填充注射器，在腹部和腿部之间的过渡处切开一厘米，露出股静脉。
然后用 5 T 缝合线系紧股静脉增宽近端的血管。接下来，做一个血管直径一半的部分切口，并将管子沿其轴线以高于水平面 20 至 30 度角插入血管中。用缝合线系在插管段上固定管子。
为了准备动物进行显微镜检查，用一滴 1% 热带滴眼液扩张瞳孔，然后滴一滴 2.5% hyper melos 滴眼液。然后用 5 毫米的玻璃盖玻片盖住眼睛。将动物放在有机玻璃板上后，将板放在正置显微镜的显微镜物镜下方。
将手术纱布放在头部下方，以允许轴直接穿过物镜到达中央视网膜和视盘。使用 Forex 物镜和荧光素滤光片，聚焦在视盘上，使其保持在视野的中心。接下来，以每分钟 250 微升/千克的速率将荧光微球溶液注入股静脉。
使用 8 毫秒的相机曝光时间，对视盘周围的可见视网膜进行视频记录。停止微球输注。三分钟后，一些微球溶液可能仍未使用。
将制备好的荧光葡聚糖溶液作为推注注入股静脉，持续 5 秒。要开始测量视网膜血管的直径，请用 Forex 物镜保持对视盘的关注。然后切换到 10 倍物镜和 40 毫秒曝光。
是时候提高分辨率视频 4 到 7 条动脉和 4 到 7 个场地在浅表视网膜中。一次聚焦于可见视网膜的一个象限，保持视盘的中心位于视野的一个角落。记录每个象限仅 10 到 15 秒，以尽量减少光毒性的可能性。
现在，分析视频以确定流速和总视网膜血流量。使用千分尺，使用图像处理软件校准视频系统以将微米转换为像素。播放荧光葡聚糖推注视频中的录制视频。
识别动脉和 V 动脉 动脉在 V 静脉之前灌注。测量充满荧光葡聚糖的每条动脉和静脉的直径。沿可视长度每个血管平均 5 次直径测量。
然后，对于每个相同的动脉和 ve，在每个血管中使用 10 个连续的微球条纹测量荧光微球的条纹长度，以避免选择偏差。现在将条纹长度除以曝光时间，以计算微球速度并平均每个容器的 10 个速度。接下来，计算每个容器的体积流速。
流量等于平均速度乘以 pi 乘以直径的平方除以 4。最后，将小动脉流速和分别流速相加，以获得总视网膜血流量。显示。以下是单帧视频，显示 1.9 微米荧光微球在穿过视网膜血管时显示为条纹。
中间的图像显示了图其他面板中视网膜血管的方向。请注意，某些帧具有多条条纹。在这个实验中，大多数荧光条纹的长度在 120 到 170 微米的范围内，相当于每秒 1.5 到 2.1 厘米的速度。
接下来的这些图像来自荧光葡聚糖的推注输注。在第一帧中，可以看到动脉充满葡聚糖。染料穿过毛细管床后，静脉填充。
此处显示的是用于测量血管直径的 10 x 图像之一。小动脉直径为 47 至 55 微米，小静脉直径为 50 至 65 微米。该图显示了先前实验的流量测量值，其中荧光微球和荧光红细胞被注射到同一只小鼠中，以确定是否会发现相似的血管速度和流量。
如图所示，测得的速度和流量非常相似一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在不到一小时内完成。在执行此程序时，重要的是要记住通过限制显微镜快门打开的时间来减少染料的荧光激发。看完这个视频，你应该对如何使用荧光染料测量小鼠的视网膜血流有了很好的了解。
查看完整文字稿并访问数千部科学视频
概述
该程序利用活体显微镜技术来测量小鼠的视网膜血流。它涉及输注荧光微球和纤维素以可视化和定量分析视网膜血管中的血流动力学。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 血管生物学
- 显微镜技术
背景
- 视网膜血流对维持视网膜健康至关重要。
- 活体显微镜允许对血流进行实时可视化。
- 荧光微球提供了一种跟踪血流动力学的方法。
- 该技术可以增强对视网膜血管状况的理解。
研究目的
- 在活体小鼠模型中测量视网膜血流。
- 评估活体显微镜在血管研究中的有效性。
- 提供一种可靠的方法来定量分析视网膜血流参数。
使用的方法
- 通过股静脉输注荧光微球。
- 视频记录视网膜血管中的微球。
- 输注荧光纤维素以进行额外的可视化。
- 分析录制的视频以测量速度和血管直径。
主要结果
- 成功可视化了视网膜血管中的血流。
- 准确测量了微球的速度。
- 根据血管直径计算了总视网膜血流。
- 证明了使用荧光显微镜进行此目的的优势。
结论
- 活体显微镜可有效测量视网膜血流。
- 该方法为视网膜血管健康提供了见解。
- 未来的研究可以在各种应用中基于这一技术进行扩展。
常见问题
Executive Industry Relevance
Quantitative measurement of retinal blood flow in mice using intravital video microscopy provides a robust platform for investigating vascular contributions to ocular disease mechanisms. This approach enables high-confidence assessment of perfusion changes, supporting early discovery and mechanistic de-risking in ophthalmic and vascular research pipelines. The method's reproducibility and scalability position it as a valuable asset for translational studies and preclinical model validation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables precise quantification of retinal perfusion to interrogate disease mechanisms.
- Supports functional validation of vascular targets implicated in ocular pathologies.
- Facilitates mechanistic de-risking by linking blood flow alterations to phenotypic outcomes.
Screening & Assay Development
- Provides standardized, quantitative readouts of vessel diameter and blood velocity for assay development.
- Ensures reproducibility and comparability across experimental cohorts and compounds.
- Prepares validated biological systems for downstream compound screening and evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant endpoints for translational biomarker development in retinal disorders.
- Enables continuity from discovery-stage findings to preclinical efficacy and safety studies.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by providing robust physiological data.
Pipeline & Workflow Integration
This intravital microscopy workflow integrates into the discovery-to-preclinical continuum, bridging mechanistic studies and translational research in vascular biology and ophthalmology.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on vascular contributions to retinal disease.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible measurements for assay standardization.
- Analytics: Provides vessel diameter, velocity, and flow rate outputs for condition comparison.
- Translational Research: Connects preclinical findings to disease-relevant biomarkers and endpoints.
- Enterprise Reuse: Adaptable for use in rats and potentially other tissues, enhancing platform value.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in vascular target validation.
- Operational Value: Offers standardized, scalable, and reproducible measurement protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital efficiency in early-stage programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of vascular and ocular assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in small animal surgery and fluorescence microscopy.
- Needs access to digital imaging systems and image analysis software.
- Demands cross-team standardization for data comparability and reproducibility.
- Adaptable to different model systems with protocol optimization.
- Phototoxicity and animal welfare must be managed during imaging sessions.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:25
Preparation of Perfusion Solutions
2:16
Animal Anesthesia and Vascular Cannulation
3:45
Preparation for Intravital Microscopy
4:41
Infusion of Fluorescent Microspheres to Measure Velocities
5:15
Infusion of a Fluorescent Plasma Marker to Measure Diameters
6:11
Video Analysis
7:56
Results: Intravital Microscopy Measurements of Retinal Blood Flow
9:38
Conclusion
