使用 EDTA 促进法收集和分析 Arabidopsis 韧皮部渗出物

本实验的总体目标是从拟南芥或其他植物中收集韧皮部汁液，以分析其成分或确认韧皮部流中特定化合物的存在。首先将花器官切下并置于含钾盐的EDTA溶液中孵育，以防止筛管分子闭合；第二步是彻底清洗花器官，以去除可能干扰后续分析并在长期暴露下损伤细胞的残留EDTA。

接下来，将流动电泳渗出物收集到水中。此步骤的最后环节是通过液相色谱-质谱-气相色谱-质谱联用、凝胶电泳以及薄层色谱对样品进行后续分析前的制备。最终，利用EDTA促进的酚类物质渗出可用于分析并确认其中的酚类成分，如代谢物和脂质、蛋白质或RNA。

植物无法逃避不利环境条件。因此，它们需要非常高效且快速的系统，将环境信号传递至全株，并通过改变发育来作出响应。其中一种信号通路是植物体内的物质运输流，其组成十分复杂，难以理解。

我们采用 EDTA 辅助的流式镇静法来收集和分析流式样本。该方法最初由 King 在紫苏中开发，但可轻松修改用于其他物种。本次实验操作将由我实验室的两名本科生 Elena 和 US 演示。在开始此操作之前。

在采集当天，将拟南芥植株在光照周期为12小时的生长室中培养4至6周。用蒸馏水稀释先前配制的100毫摩尔浓度的EDTA钾溶液，使其终浓度为20毫摩尔。接着，取两个直径为7至15厘米的玻璃培养皿，各加入一半体积的20毫摩尔EDTA钾溶液。

实验完成后，用 1.4 毫升 20 毫摩尔的 EDTA 钾溶液填充 1.7 毫升反应管。然后用 1.4 毫升去离子水填充相同数量的反应管。从生长室中取出 4 至 6 周大的植株后，用剃刀片在莲座中心附近的花瓣基部切割，收获莲座叶。

立即把叶片放入含有20毫摩尔钾盐EDTA的培养皿中，使叶柄切端浸没于溶液中。从三到四株植物上共采集15片叶片后，将它们轻轻叠放，使切口处对齐。重新切割花瓣基部，然后轻轻卷起叶片。

随后，将卷好的叶片轻轻插入含有 20 毫摩尔 EDTA 钾用于收集渗出液的反应管中。在暗处，用湿润的纸巾铺满一个大型浅盘底部。将装有叶片的反应管架放入盘中，并将其置于带有通气切口的黑色塑料袋内。

然后将整个装置放入柜中以收集渗出液。在光线下，用湿润的纸巾铺满透明有机玻璃容器的底部。将装有叶片的反应管架放入容器中，并关闭容器。

从容器中取出架子一小时后，将叶片从反应管中取出。用蒸馏水彻底清洗叶片，以去除所有 EDTA。立即将叶片转移至含有 Millipore 水的反应管中，并放回加湿容器内，以便在从加湿容器中移除架子后收集渗出物。

5 到 8 小时后，将叶片从离心管中取出，用液氮迅速冷冻渗出液，并储存在 -80 摄氏度冰箱中。为进行次日的进一步分析，将样品解冻以准备进行脂质分析。随后取出两到三个样品，向合并的溶液中加入等量的氯仿和甲醇。

将混合物涡旋震荡数秒。接着，以400 ×g离心样品4分钟。离心结束后，重复与上相进行分配3次，收集下层有机相至玻璃试管中，在氮气流下干燥合并的有机相，然后进行薄层色谱和液相色谱-质谱（LCMS）分析。

该方法能够收集足量的韧皮部汁液，以鉴定定位于韧皮部的蛋白质及其在发育或胁迫条件下表达水平的变化。在某些情况下，研究者可使用蛋白酶抑制剂以防止蛋白质降解。如图所示，尽管蛋白质含量极低，但其丰度仍足以满足后续蛋白质组学实验的需求。

利用液相色谱-质谱联用技术（LCMS）或蛋白质印迹分析在葫芦科植物中的研究结果表明，茎部切割会导致水势平衡被破坏，从而引起水分及可能的污染物从外源环境流入。然而，在1至8小时的不同采集时间内，M蛋白的表达谱和组成在InOpSys中并未受到影响。所收集的蛋白质含量以及检测到的蛋白质谱在不同物种和处理之间存在差异。

因此，可以对蛋白质信号进行可视化、鉴定和追踪。通过该方法也可在伤流液渗出物中鉴定 mRNA 和微小 RNA（microRNAs）。然而，必须使用 RNA 抑制剂处理，以防止在较长的渗出时间内 mRNA 发生降解。

由于C区不含功能性叶绿体，因此可将rubis、小亚基或大亚基mRNA用作阴性对照，而已知在pH flu m中定位于外泌物的mRNA（如泛素结合酶）则可用作阳性对照。类似地，糖类或小分子代谢物可采用GCMS或LCMS进行分析。需要指出的是，外泌物中含有大量功能性酶类，包括几乎完整的糖酵解途径中的全部酶。

因此，使用多个时间点可能揭示渗出液收集过程中的代谢过程。在所有渗出液中，蔗糖是最丰富的代谢物，这一现象在收集一小时后最为明显。

然而，五小时后，蔗糖与果糖的比值略有降低。如果将相同的外泌物收集一小时，然后在室温下放置额外的四小时，蔗糖与果糖的比值则显著降低。这表明韧皮部外泌物中的活性酶在室温下会导致蔗糖的降解。

此外，持续收集五小时后蔗糖与果糖的比值仅略有下降，这一事实与已有研究结果一致，即韧皮部装载以及分子从伴胞向筛管分子的转运可能在渗出过程中持续进行，直至系统失去活力。韧皮部渗出物中的脂质以及由此延伸的长距离脂质信号传导，是植物科学中一个较新的研究领域。由于脂质具有疏水性，其浓度通常较低，可能需要与其他分子结合以实现溶解。

然而，EDTA 促进的渗出使得能够收集到足够的材料，从而对多种植物物种的渗出液和脂质进行观察与鉴定。如图所示，可利用薄层色谱法分离多种脂质组分。液相色谱-质谱联用技术（LCMS）可用于鉴定不同的脂质组分，并监测不同基因型或处理条件下脂质谱的变化。

这使得研究脂质在植物发育和应激反应中的作用成为可能。一旦掌握，若操作得当，该技术可在短短三小时内完成。然而，对于大多数样品，我们建议采集时间为五到八小时。

在此情况下，建议清晨尽早开始叶片采收。该方法可针对其他植物进行调整，有助于发现或确认新的韧皮部汁液化合物。在进行该操作时，需特别注意在孵育一小时后彻底观察 PDLs，及时去除 EDTA，并避免挤压叶片，以防其他细胞内容物的污染。

此外，佩戴手套还可以保护您的样品免受可能通过皮肤引入的污染物的影响。为防止污染，应针对蛋白质、RNA 或代谢物样品使用适当的对照。建议的对照已在文本方案中列出。该方法使我们能够深入了解植物汁液的组成。

我们能够在蚁穴渗出物中鉴定出多种脂质，这些脂质原本并不预期会存在于蚁穴地面的水性环境中。这一发现促使我们以及其它研究者提出了长距离脂质信号传导的概念，该概念如今已发展成为一个令人振奋的新兴植入物研究领域。