Name: 收集和分析拟南芥韧皮部分泌物使用EDTA促进方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-23T19:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: 学习使用EDTA促进法收集拟南芥韧皮部分泌物，用于代谢组学和蛋白质组学分析。该方法可鉴定代谢物、蛋白质及RNA，揭示植物长距离信号传导机制。

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本工作由美国国家科学基金会（NSF-IOS）资助，项目编号#1144391，授予SHB。

1. 植物的准备
<ol>
	<li>拟南芥 种子可直接在土壤或MS平板上萌发。将植株置于培养室中生长4至6周，光照周期为12小时&#160;光周期（22 °C 白天，15 °C 夜间）14每周浇水一至两次。采用底部托盘浇水法；切勿从上方直接浇水；再次浇水前需确保托盘已干燥。收获时应确保植株水分充足。</li>
</ol>
2. 溶液与培养皿的准备
<ol>
	<li>K2-EDTA 溶液：配制 100 mM 的 K2-EDTA 储存液，可保存于冰箱中。在取样当天，将该溶液按 1:5 的比例稀释（1 份 EDTA 溶液，4 份水），得到 20 mM 的 K2-EDTA 溶液。</li>
	<li>用 20 mM 的 K2-EDTA 溶液将玻璃皿或培养皿（直径 7–15 cm）填充至一半。若需采集不同处理的样品（例如对照组和盐胁迫处理的植株，或不同基因型的植株），应为每种处理分别准备独立的培养皿。</li>
	<li>将所需数量的 1.7 ml 反应管分别加入 1.4 ml 的 20 mM K2-EDTA 溶液；另取相同数量的反应管，每管加入 1.4 ml 经高压灭菌的去离子水或 Millipore 水。</li>
	<li>在实验台上铺上纸巾用于放置植株；准备一把新的剃须刀片，并戴上手套。</li>
</ol>
3. 韧皮部渗出物的收集（见图1中的流程图）
<ol>
	<li>用剃刀在莲座叶叶柄基部靠近莲座中心处切割，采集四至六周龄植株的莲座叶。</li>
	<li>立即将叶片放入含有 20 mM K 的培养皿中2-EDTA。确保叶柄的切割端浸没在溶液中（图2).</li>
	<li>当采集到约15片叶片（相当于3至4株植物）后，将叶片轻轻叠放，使叶柄切口相互对齐。重新剪切叶柄基部（约1 mm），并立即将叶片转移至含有20 mM K的反应管之一中2-EDTA 溶液中。叶片稍卷曲后更容易放入。避免用力挤压叶片，因为这可能导致细胞损伤，从而引起叶片细胞内容物的释放。</li>
	<li>如需更多材料，用湿润的纸巾轻轻覆盖样品。若需收集不同处理或基因型的样品，应使用一套新的器皿。</li>
	<li>将所有样品放入反应管后，应在黑暗或光照条件下收集渗出物。</li>
	<li>为在黑暗条件下收集，将一个大型浅底容器的底部铺上湿润的纸巾。将装有叶片的反应管置于支架上，并放入该容器中，然后用湿润的纸巾覆盖，或将其放入带有通气狭缝的黑色塑料袋中。将整个装置放置于柜子或暗室中。</li>
	<li>在光照条件下收集时，用湿润的纸巾铺满透明有机玻璃容器底部。将装有叶片反应管的支架放入容器中，并盖上盖子。</li>
	<li>1小时后，轻轻将叶片从容器和反应管中取出，用蒸馏去离子水或Millipore水充分冲洗，以彻底去除所有EDTA。此步骤具有三个目的：（1）去除EDTA以尽量减少对细胞的损伤；（2）消除EDTA对SDS-PAGE和层析分析的干扰；（3）去除因切割或损伤细胞而积累的各类化合物。立即将叶片转移至预先准备好的含有高压灭菌水的反应管中，并放回加湿的收集容器内，用于收集渗出物。此时，若后续需进行RNA提取，可加入RNase抑制剂。可选：如需进行蛋白质分析，可加入蛋白酶抑制剂。</li>
	<li>在预定的收集时间结束后，取出并丢弃叶片，将韧皮部渗出物在液氮中速冻2 以备后续使用。如需长期保存，请将样品冻干后于 -80 °C 保存。</li>
	<li>在……的情况下 拟南芥，代谢物在收集渗出液1小时后即可被检测到。然而，建议收集5-8小时&#160;如果计划分析丰度较低的组分，则建议对较大的植物如 紫苏建议延长采集时间（8 小时）。 
	从15片叶片收集的渗出液通常足以用于SDS-PAGE凝胶电泳（蛋白质分析）、mRNA提取以及GC-MS分析（糖类和代谢物）中的一个泳道。对于脂质分析，建议合并2-3个样本（来自30-45片叶片的渗出液），以获得更清晰的结果。</li>
</ol>
4. 后续分析（视频中仅展示 4.4）
<ol>
	<li>用于蛋白质分析时，将样品重悬于15 μl水和30 μl Lämmli缓冲液中，95 °C加热5分钟，短暂离心去除沉淀，将全部样品加载至SDS-PAGE凝胶（上样孔体积为45 μl）。由于蛋白质含量极低，样品应使用胶体考马斯亮蓝或其他高灵敏度染色方法进行染色。</li>
	<li>用于糖类和小分子代谢物分析时，按照文献所述向干燥样品中加入衍生化试剂14.</li>
	<li>mRNA 可通过 RT-PCR、微阵列或 RNA-Seq 分析进行检测。</li>
	<li>用于脂质分析时，立即混合两到三个样本，并在通风橱中用氯仿:甲醇（1:1）进行分相，具体步骤如下：向每个样本中加入等体积的氯仿:甲醇，涡旋震荡数秒，然后离心4分钟&#160;在400 × g条件下离心。收集下层（有机相）至带聚四氟乙烯盖的玻璃管中，并与上层水相再分配三次。将合并的有机相在氮气流下干燥2 并提交进一步分析（薄层色谱：TLC）14, 37液相色谱-质谱联用：LC-MS14).</li>
</ol>

<ol><li>Balachandran, S., Xiang, Y., Schobert, C., Thompson, G. A., Lucas, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phloem+sap+proteins+from+Cucurbita+maxima+and+Ricinus+communis+have+the+capacity+to+traffic+cell+to+cell+through+plasmodesmata%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Phloem sap proteins from Cucurbita maxima and Ricinus communis have the capacity to traffic cell to cell through plasmodesmata.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94, 14150-14158 (1997).</li>
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<li>Zhang, B., Tolstikov, V., Turnbull, C., Hicks, L. M., Fiehn, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Divergent+metabolome+and+proteome+suggest+functional+independence+of+dual+phloem+transport+systems+in+cucurbits%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS+USA%22%5BJournal%5D)">Divergent metabolome and proteome suggest functional independence of dual phloem transport systems in cucurbits.</a> PNAS USA. 107, 13532-13537 (2010).</li>
<li>Zhang, C., Yu, X., Ayre, B. G., Turgeon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Origin+and+Composition+of+Cucurbit+%22Phloem%22+Exudate%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">The Origin and Composition of Cucurbit "Phloem" Exudate.</a> Plant Physiology. 158, 1873-1882 (2012).</li>
<li>Zhang, S., Sun, L., Kragler, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Phloem-Delivered+RNA+Pool+Contains+Small+Noncoding+RNAs+and+Interferes+with+Translation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">The Phloem-Delivered RNA Pool Contains Small Noncoding RNAs and Interferes with Translation.</a> Plant Physiol. 150, 378-387 (2009).</li>
</ol>

我们没有需要披露的内容。

利用EDTA促进韧皮部渗出物的收集非常简单，所需设备极少，且适用于大多数植物。总体而言，该方法扩展了对更多物种韧皮部渗出物进行分析的能力。尽管渗出物被稀释，但易于从多株植物或多个样本中大量收集，从而获得足够量的材料。这使得检测那些丰度极低、 otherwise 易被忽略的新化合物成为可能。
该方法适用于多种植物物种，并可按照本文所述用于所列物种。若探索新物种，可能需要调整的两个方面是所用叶片的数量和渗出时间。大多数情况下，5至8小时的渗出时间是合适的。为验证该方法在新植物物种中的适用性，需收集渗出液，并进行第4部分实验方案中描述的一种或多种后续分析。根据观察到的信号强度，可能需要增加收集量。通常，脂质和蛋白质分析所需的样品量多于糖类和代谢物分析，因为前者在韧皮部渗出液中的含量较低。
由于EDTA辅助的渗出液收集方法涉及切面以及EDTA可能带来的细胞损伤效应，需考虑以下几点：（1）在EDTA孵育一小时后，必须彻底清洗叶柄，以去除来自受损细胞的化合物以及EDTA本身，避免其对细胞造成损伤或干扰后续提取过程。（2）需要设置阳性和阴性对照，以确保所获得的数据来源于韧皮部汁液而非受伤细胞（见下文关键步骤）。（3）韧皮部汁液中含有多种酶类，可能在渗出过程中保持活性，因此在某些情况下，采用不同时间长度进行收集可能更为合适。（4）由于该方法是将渗出物收集至水中，因此无法对化合物进行绝对定量。
关键步骤：成功使用该方法的关键在于处理样品时需格外小心，避免损伤任何细胞，同时设置适当的对照（参见参考文献14）。一种合适的对照是不预先用EDTA处理而直接收集韧皮部渗出物。在此情况下，韧皮部会自行封闭，无法收集到渗出物，从而可检测到由受伤细胞带来的任何污染化合物。第二种对照是对渗出物中的糖类进行分析。在Arabidopsis中，蔗糖应为韧皮部汁液中的主要代谢物，果糖与蔗糖的比例应在1:4至1:8之间（参考文献8, 14）。
进行RNA提取时，必须使用RNase抑制剂。此外，建议设置阳性对照，如先前报道的韧皮部定位mRNA（UBC9：泛素结合酶9，At4g27960；8, 14），以及阴性对照，例如叶绿体mRNA（Rubisco LSU）。
由于渗出液含有活性酶，建议进行时间过程实验，以确保韧皮部谱型的变化并非仅仅源于收集时间的差异。在某些情况下，使用蛋白酶抑制剂可能有益。然而，研究者需要注意，所收集的渗出液将会被浓缩，任何添加的化合物也会被大幅浓缩。本实验方案中的第二个关键步骤是在 EDTA 溶液中重新切割叶柄。此步骤具有双重目的：第一，去除可能已封闭的筛板，同时防止新的堵塞物形成，从而允许韧皮部汁液自由流出；第二，去除切割过程中在木质部中产生的气穴气泡，从而恢复木质部的运输功能。第二次切割的位置取决于所用植物种类。对于叶柄较大的植物，第二次切割应位于第一次切口上方几毫米（最多达 1 cm）处；而对于拟南芥（Arabidopsis）等植物，1–2 mm 即已足够。
采用该方法可发现韧皮部渗出物中具有信号传导、发育或生物医学意义的新化合物。该方法促使人们更加深入地研究长距离脂质信号传导，而这一领域由于难以获取韧皮部样品，在植物科学中此前鲜有研究。

植物无法移动以逃避不利环境。因此，它们必须进化出检测环境胁迫、在全株范围内引发并传递相关信号，以及相应调整发育过程的机制。植物体内存在两种运输系统，用于水分、养分及其他（信号）化合物的分配。第一种是木质部，通常负责将根部吸收的水分和矿物质输送到整个植株。第二种是韧皮部。人们对韧皮部的认识已从简单的同化物运输系统，转变为认识到它是RNA、蛋白质、病毒、脂类及其他小分子的运输通道。韧皮部在同化物和养分运输、对生物和非生物胁迫的响应，以及植物生长与发育过程中发挥着重要作用。如今，它被称为植物的&#34;信息高速公路&#34;18。
韧皮部由多种细胞类型组成：韧皮薄壁细胞，以及特化的伴胞和筛管分子。筛管分子是长距离运输的场所。为了实现畅通的纵向流动，筛管分子缺失了大部分细胞器和细胞核，被认为最多仅含有有限的翻译机制21, 33。人们认为伴胞合成蛋白质和其他化合物，这些物质随韧皮部汁液流动而运输。随后，这些化合物通过胞间连丝转运至筛管分子中，并可作为长距离信号分子发挥作用4,16。
韧皮部渗出物中可发现几类化合物：
<ul>
	<li>糖通常是光合作用的产物，并以 &#34;携带能量的&#34; 分子可被运输至植物的其他部位用于储存或作为结构单元，但也可能发挥抗冻剂或信号传导分子的作用。</li>
	<li>在韧皮部渗出物中也可以发现蛋白质。这些蛋白质包括代谢酶，同时也具有信号传导功能。一个作为发育信号的蛋白质例子是成花位点T蛋白（Flowering locus T protein），它在植物中可传递成花诱导以及季节性叶片脱落的信号。6</li>
	<li>韧皮部渗出物中含有核酸，其形式包括mRNA、小RNA和微小RNA以及病毒RNA。这些核酸似乎主要参与信号传导过程 27, 28, 39同时，在葫芦科植物的韧皮部汁液中已观察到几乎所有氨基酸的rRNA和tRNA。42它们似乎被选择性地转移到筛管系统中。这些tRNA经过修饰，具备将氨基酸转运至翻译装置的能力。然而，它们似乎并不参与翻译过程，反而可能抑制该过程。或者，它们可作为细胞分裂素的来源，或传递植物的代谢状态信号。42.</li>
	<li>在韧皮部渗出物中也发现了脂肪酸、氧脂类及其他脂质 3, 13, 14, 23茉莉酸是一种氧化脂质，在植物对病原体感染的响应过程中通过韧皮部进行运输。22, 29, 31, 32尽管大多数韧皮部脂质的功能尚不明确，但其中一些可能具有信号传导功能4.</li>
</ul>
研究植物韧皮部的难点在于其受伤后具有自我封闭的能力。目前有四种主要方法用于收集韧皮部分泌物，但这些方法仅适用于特定物种：
1) 在葫芦科植物中，可通过切去叶柄获得较大量的韧皮部渗出液。去除最初含有受损细胞污染物的液滴后，即可获得相对大量且较为纯净的韧皮部汁液。 1, 15然而，随着收集时间的延长，该渗出液逐渐变稠，越来越不适合用于液相色谱分析方法（未发表）。近期研究表明，根据物种的不同，这种韧皮部汁液可能来源于维管束内韧皮部（FP）或维管束外韧皮部（EP），并且尽管其中含有 &#34;移动的&#34; 来自筛管分子的韧皮部汁液（FP）也容易受到包括木质部在内的其他细胞类型的污染40, 41.
2）第二种方法是通过在茎或叶柄上制造浅层切口或穿刺来获取韧皮部汁液。该方法已成功应用于羽扇豆17, 25、葫芦科植物36以及Brassica napus12。此法所获得的汁液细胞损伤污染极少，渗出物非常纯净。然而，植物必须保持健康且水分充足，因为精准穿刺筛管分子极具挑战性。若刺伤木质部导管，所有渗出液将被吸入木质部液流中。因此，该方法不适用于叶柄或茎部极为脆弱或高度木质化的植物。
3) 蚜虫吻针切除术允许蚜虫将其吻针插入筛管分子，随后用激光去除蚜虫，韧皮部汁液会通过残留的吻针渗出2, 9, 10, 35, 38。理论上，任何可被蚜虫感染的植物均可用于该方法。然而，大多数温室或人工气候室管理者不会允许使用病原体。此外，蚜虫会通过唾液向韧皮部引入多种蛋白质19, 33，导致有限的转录重编程30，并可能改变韧皮部的成分26。
4) 此处所述方法为EDTA辅助的韧皮部汁液渗出法。该方法利用EDTA防止韧皮部闭合20。EDTA通过螯合Ca2+离子，阻止其参与导致韧皮部闭合的生理过程。尽管EDTA可能引起细胞损伤30，但已有多个研究团队使用该方法，并发现10 mM至20 mM浓度范围内的EDTA对细胞超微结构以及韧皮部装载和运输均无不良影响5, 24。为减少EDTA可能造成的损伤及其在色谱分析和凝胶电泳中的干扰，植物在处理1小时后需转移至水中，且仅使用后期渗出的汁液进行分析14。因此，实际收集的是在EDTA辅助下渗出至水中的韧皮部汁液（即EDTA辅助渗出法）。这是一种操作简便、成本低、技术要求低的韧皮部渗出物收集方法。通过该方法获得的韧皮部汁液可用于分析蛋白质、小分子、脂质和RNA，并已在多种植物中成功应用。尽管在单子叶植物中进行的实验较为有限11，但该方法似乎更适用于双子叶植物（Perilla17, 20、Arabidopsis8, 13, 14、Poplar7）。渗出物的收集必须在高湿度环境中进行，以避免因蒸腾作用导致汁液损失。根据植物种类不同，在EDTA中孵育一至两小时足以防止韧皮部或筛管元件闭合。随后可将渗出物收集至水中。这种方法的优势在于避免了EDTA对细胞结构和稳定性的负面影响，同时消除了EDTA对高效液相色谱（HPLC）或SDS-PAGE等分析技术的干扰。文中示例以Arabidopsis为例。对于较大的植物，EDTA孵育和渗出物收集需相应放大规模，通常使用烧杯而非1.7 ml离心管进行操作。

<table><tbody><tr><td>K2-EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>ED2P-500G</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>浅底玻璃或塑料培养皿（7-15 cm）</td><td>PYREX 或 Corning</td><td></td><td>任何洁净的浅底容器均可使用</td></tr><tr><td>氯仿</td><td>EMD</td><td>CX1054-1</td><td>仅可在通风橱中打开容器</td></tr><tr><td>甲醇</td><td>J.T.Baker</td><td>9070-03</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>带螺口盖的试管</td><td>VWR International</td><td>53283-800</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>带螺口盖的试管</td><td>Sun Sri</td><td>13-425</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Eppendorf 管</td><td>Denville</td><td>C2170</td><td>&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

使用 edta 促进法收集和分析 arabidopsis 韧皮部渗出物

Collection and Analysis of Arabidopsis Phloem Exudates Using the EDTA-facilitated Method

植物韧皮部对于（光合）同化物以及传递生物或非生物胁迫信号的长距离运输至关重要。韧皮部含有糖类、氨基酸、蛋白质、RNA、脂质及其他代谢物。尽管人们对了解韧皮部的组成和功能有极大兴趣，但其中许多分子的作用及其在植物发育和胁迫响应中的重要性仍有待确定。韧皮部分析的一个障碍在于，韧皮部在受到损伤时会自我封闭。因此，能够获取韧皮部汁液的植物种类十分有限。本文所述的EDTA辅助韧皮部渗出物收集法是一种无需额外设备即可从多种植物物种中收集韧皮部渗出物的方法。该方法虽然操作简便，但会导致细胞损伤，因此必须小心去除受损细胞的内容物。此外，还需设置多个对照以验证渗出物的纯度。由于这是一种渗出过程，而非直接采集韧皮部汁液（在许多物种中不可行），因此只能对其中成分进行相对定量。该方法相较于其他方法的优势在于，它适用于多种草本或木本植物物种（Perilla、Arabidopsis、poplar、etc.），且所需设备和培训极少。该方法可获得相对大量的渗出物，可用于后续的蛋白质、糖类、脂质、RNA、病毒及代谢物分析。其操作足够简单，既可用于科研实验室，也可用于教学实验室。

近年来越来越明确的是，韧皮部汁液的复杂性可能是解释植物如何传递多种发育和胁迫信号以实现最佳响应的关键。利用EDTA促进的韧皮部分泌方法，可能为分析那些不适合采用其他方法、但在经济或生理上具有研究价值的植物的韧皮部渗出物提供了机会。
该方法可收集到足量的韧皮部渗出物用于鉴定 韧皮部定位蛋白 并检测其在发育或胁迫条件下水平的变化（图3）。如图所示，蛋白质的含量虽然极低，但其浓度已足以进行后续的蛋白质组学实验，如LC-MS/MS，或用于Western blot分析。在葫芦科植物中的研究发现，茎部切割会导致水势平衡被破坏，进而引起水分及可能的污染物从质外体渗入41然而，收集时间从一到八小时并不影响韧皮部蛋白质谱/组成 拟南芥 （仅绝对含量有所不同 Guelette） 等），所收集的蛋白质含量及检测到的蛋白质谱在不同物种间存在差异（拟南芥：A.t.； 紫苏，泳道 I 和 NI）以及处理（紫苏 在不同光周期下生长的植株（I 和 NI 泳道）。因此，可以对蛋白质类信号进行可视化、鉴定和追踪。
mRNA 和 micro RNA 也可通过此方法在韧皮部渗出物中被鉴定。然而，必须使用RNase抑制剂处理，以防止mRNA在较长的渗出时间内发生降解。由于筛管分子不含功能性叶绿体，因此核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶的小亚基或大亚基（RbcS 或 RbcL）的mRNA可作为阴性对照，而已知在韧皮部定位于的泛素结合酶mRNA则可作为阳性对照（图4）。
同样，糖类或小分子代谢物可采用GC-MS或LC-MS进行分析。需要指出的是，韧皮部渗出物中含有大量具有功能的酶类，包括几乎完整的糖酵解途径12。因此，采用多个时间点取样可能揭示渗出物收集过程中的代谢动态。如图5所示：在所有渗出物中，蔗糖均为最丰富的代谢物，这在收集1小时后最为明显。然而，经过5小时收集后，蔗糖与果糖的比值略有下降。若将同一份渗出物收集1小时后，在室温下放置接下来的4小时，其蔗糖与果糖的比值则显著降低，表明韧皮部渗出物中活性酶在室温下导致蔗糖降解（更多峰的解析参见14）。该结果与已有研究一致，即从伴胞向筛管分子装载和运输分子的过程在渗出期间可能持续进行，直至系统失去活力34。
脂质在韧皮部渗出物中的存在，以及由此延伸出的长距离脂质信号传导，是植物科学中一个相对较新的研究领域。由于脂质具有疏水性，其在渗出物中仅以较低浓度存在，并可能与其他分子结合以实现溶解。然而，通过EDTA促进的渗出方法，能够收集到足够的样品，用于对多种植物物种的韧皮部脂质进行可视化分析（薄层色谱法，TLC；图6）和鉴定（液相色谱-质谱联用，LC-MS；图7）。如图所示，可以实现多种脂质组分的分离与鉴定。LC-MS技术不仅可用于鉴定不同的脂质种类，还可用于监测不同基因型或处理条件下脂质谱的变化，从而有助于研究脂质在植物发育及胁迫响应过程中的作用。
<img alt="叶片代谢物分析示意图；提取；相分离色谱系统；GC-MS、TLC、LC-MS。" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51111/51111fig1.jpg" width="600px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. 拟南芥或紫苏韧皮部渗出物采集流程图。不同路径通向不同的最终产物，以蓝色标示。制备RNA时，需在收集韧皮部渗出物的水中加入RNase抑制剂（100 U/ml，Roche）。 
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51111/51111fig1highres.jpg" target="_blank">点击此处查看高清大图</a>。
<img alt="用于实验的植物繁殖装置，包括切割工具、手套、培养皿和水瓶。" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51111/51111fig2.jpg" width="600px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. 韧皮部渗出液采集的材料准备装置。该装置展示了步骤 3.1–3.4 所需的全部材料。 
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51111/51111fig2highres.jpg" target="_blank">点击此处查看高清图像</a>。
<img alt="显示蛋白质分子量标记的SDS-PAGE凝胶图像。电泳蛋白质分离。" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51111/51111fig3.jpg" width="600px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 3"> 
图3. 在两种不同植物物种——拟南芥（Arabidopsis，A.t.）和紫苏（Perilla，I 和 NI；不同光照时长）的韧皮部渗出物中发现的蛋白质；MW：分子量标记（第2道）；使用10-20%的梯度SDS-PAGE进行蛋白质分离。 
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51111/51111fig3highres.jpg" target="_blank">点击此处查看高分辨率图像</a>。
<img alt="显示 RbcS、RbcL 和 UBC 条带的凝胶电泳结果；DNA 分离与条带可视化。" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51111/51111fig4.jpg" width="600px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 4"> 
图 4. Rubisco 小亚基和大亚基（分别为 RbcS 和 RbcL）以及泛素结合酶（UBC）mRNA 存在性的分析。mRNA 来源于拟南芥（Arabidopsis）叶片（L）、叶柄（P）和韧皮部渗出物（Ph），经逆转录后通过 PCR 检测特异性转录本。该图改编自 Guelette et al.14。 
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51111/51111fig4highres.jpg" target="_blank">点击此处查看高分辨率图像</a>。
<img alt="色谱图；糖分离；四个图（A-D）；强度 vs. 时间；果糖、葡萄糖、蔗糖。" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51111/51111fig5.jpg" width="600px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 5"> 
图 5. 不同收集时间下韧皮部渗出物的气相色谱-质谱（GC-MS）分析图谱。注意蔗糖的相对含量在收集1小时（A）与收集5小时（B）之间的变化。收集1小时后，在室温（RT）下“孵育”4小时的渗出物图谱（C）。叶片代谢物图谱（D）。 
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51111/51111fig5highres.jpg" target="_blank">点击此处查看高清图像</a>。
<img alt="Thin layer chromatography (TLC) results of lipid separation in Perilla and Arabidopsis samples." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51111/51111fig6.jpg" width="600px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 6"> 
图6. 薄层色谱图比较不同脂质 紫苏 （左）和 拟南芥 （右）叶片与韧皮部渗出物。星号表示韧皮部渗出物中特有的脂质。DGDG：二半乳糖基二酰基甘油；PG：磷脂酰甘油；MGDG：单半乳糖基二酰基甘油；图中显示的部分为 拟南芥 脂质的提取方法已根据Guelette的方法进行了修改 等14. 
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51111/51111fig6highres.jpg" target="_blank">单击此处查看大图</a>.
<img alt="显示峰强度与时间关系的色谱图，突出关键保留时间。" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51111/51111fig7.jpg" width="600px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 7"> 
图 7. 利用液相色谱-质谱联用技术（LC-MS）负离子模式分析拟南芥（Arabidopsis）韧皮部渗出物的脂质谱（氯仿相）。上方（突变体，A）和下方（野生型，B）的图谱显示了两种不同基因型之间脂质谱的差异（由箭头指示）。 
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51111/51111fig7highres.jpg" target="_blank">点击此处查看高分辨率图像</a>。

了解韧皮部汁液的组成及其装载和长距离运输的机制，对于理解植物发育以及胁迫/病原体响应中的长距离信号传导和同化物运输至关重要。本文描述了利用EDTA促进法收集韧皮部渗出物的方法。

使用 EDTA 促进法收集和分析 Arabidopsis 韧皮部渗出物

植物韧皮部对于光合产物等同化物以及传递生物或非生物胁迫信号的长距离运输至关重要。它……

本实验的总体目标是从拟南芥或其他植物中收集韧皮部汁液，以分析其成分或确认韧皮部流中特定化合物的存在。首先将花器官切下并置于含钾盐的EDTA溶液中孵育，以防止筛管分子闭合；第二步是彻底清洗花器官，以去除可能干扰后续分析并在长期暴露下损伤细胞的残留EDTA。接下来，将流动电泳渗出物收集到水中。此步骤的最后环节是通过液相色谱-质谱-气相色谱-质谱联用、凝胶电泳以及薄层色谱对样品进行后续分析前的制备。最终，利用EDTA促进的酚类物质渗出可用于分析并确认其中的酚类成分，如代谢物和脂质、蛋白质或RNA。植物无法逃避不利环境条件。因此，它们需要非常高效且快速的系统，将环境信号传递至全株，并通过改变发育来作出响应。其中一种信号通路是植物体内的物质运输流，其组成十分复杂，难以理解。我们采用 EDTA 辅助的流式镇静法来收集和分析流式样本。该方法最初由 King 在紫苏中开发，但可轻松修改用于其他物种。本次实验操作将由我实验室的两名本科生 Elena 和 US 演示。在开始此操作之前。在采集当天，将拟南芥植株在光照周期为12小时的生长室中培养4至6周。用蒸馏水稀释先前配制的100毫摩尔浓度的EDTA钾溶液，使其终浓度为20毫摩尔。接着，取两个直径为7至15厘米的玻璃培养皿，各加入一半体积的20毫摩尔EDTA钾溶液。实验完成后，用 1.4 毫升 20 毫摩尔的 EDTA 钾溶液填充 1.7 毫升反应管。然后用 1.4 毫升去离子水填充相同数量的反应管。从生长室中取出 4 至 6 周大的植株后，用剃刀片在莲座中心附近的花瓣基部切割，收获莲座叶。立即把叶片放入含有20毫摩尔钾盐EDTA的培养皿中，使叶柄切端浸没于溶液中。从三到四株植物上共采集15片叶片后，将它们轻轻叠放，使切口处对齐。重新切割花瓣基部，然后轻轻卷起叶片。随后，将卷好的叶片轻轻插入含有 20 毫摩尔 EDTA 钾用于收集渗出液的反应管中。在暗处，用湿润的纸巾铺满一个大型浅盘底部。将装有叶片的反应管架放入盘中，并将其置于带有通气切口的黑色塑料袋内。然后将整个装置放入柜中以收集渗出液。在光线下，用湿润的纸巾铺满透明有机玻璃容器的底部。将装有叶片的反应管架放入容器中，并关闭容器。从容器中取出架子一小时后，将叶片从反应管中取出。用蒸馏水彻底清洗叶片，以去除所有 EDTA。立即将叶片转移至含有 Millipore 水的反应管中，并放回加湿容器内，以便在从加湿容器中移除架子后收集渗出物。5 到 8 小时后，将叶片从离心管中取出，用液氮迅速冷冻渗出液，并储存在 -80 摄氏度冰箱中。为进行次日的进一步分析，将样品解冻以准备进行脂质分析。随后取出两到三个样品，向合并的溶液中加入等量的氯仿和甲醇。将混合物涡旋震荡数秒。接着，以400 ×g离心样品4分钟。离心结束后，重复与上相进行分配3次，收集下层有机相至玻璃试管中，在氮气流下干燥合并的有机相，然后进行薄层色谱和液相色谱-质谱（LCMS）分析。该方法能够收集足量的韧皮部汁液，以鉴定定位于韧皮部的蛋白质及其在发育或胁迫条件下表达水平的变化。在某些情况下，研究者可使用蛋白酶抑制剂以防止蛋白质降解。如图所示，尽管蛋白质含量极低，但其丰度仍足以满足后续蛋白质组学实验的需求。利用液相色谱-质谱联用技术（LCMS）或蛋白质印迹分析在葫芦科植物中的研究结果表明，茎部切割会导致水势平衡被破坏，从而引起水分及可能的污染物从外源环境流入。然而，在1至8小时的不同采集时间内，M蛋白的表达谱和组成在InOpSys中并未受到影响。所收集的蛋白质含量以及检测到的蛋白质谱在不同物种和处理之间存在差异。因此，可以对蛋白质信号进行可视化、鉴定和追踪。通过该方法也可在伤流液渗出物中鉴定 mRNA 和微小 RNA（microRNAs）。然而，必须使用 RNA 抑制剂处理，以防止在较长的渗出时间内 mRNA 发生降解。由于C区不含功能性叶绿体，因此可将rubis、小亚基或大亚基mRNA用作阴性对照，而已知在pH flu m中定位于外泌物的mRNA（如泛素结合酶）则可用作阳性对照。类似地，糖类或小分子代谢物可采用GCMS或LCMS进行分析。需要指出的是，外泌物中含有大量功能性酶类，包括几乎完整的糖酵解途径中的全部酶。因此，使用多个时间点可能揭示渗出液收集过程中的代谢过程。在所有渗出液中，蔗糖是最丰富的代谢物，这一现象在收集一小时后最为明显。然而，五小时后，蔗糖与果糖的比值略有降低。如果将相同的外泌物收集一小时，然后在室温下放置额外的四小时，蔗糖与果糖的比值则显著降低。这表明韧皮部外泌物中的活性酶在室温下会导致蔗糖的降解。此外，持续收集五小时后蔗糖与果糖的比值仅略有下降，这一事实与已有研究结果一致，即韧皮部装载以及分子从伴胞向筛管分子的转运可能在渗出过程中持续进行，直至系统失去活力。韧皮部渗出物中的脂质以及由此延伸的长距离脂质信号传导，是植物科学中一个较新的研究领域。由于脂质具有疏水性，其浓度通常较低，可能需要与其他分子结合以实现溶解。然而，EDTA 促进的渗出使得能够收集到足够的材料，从而对多种植物物种的渗出液和脂质进行观察与鉴定。如图所示，可利用薄层色谱法分离多种脂质组分。液相色谱-质谱联用技术（LCMS）可用于鉴定不同的脂质组分，并监测不同基因型或处理条件下脂质谱的变化。这使得研究脂质在植物发育和应激反应中的作用成为可能。一旦掌握，若操作得当，该技术可在短短三小时内完成。然而，对于大多数样品，我们建议采集时间为五到八小时。在此情况下，建议清晨尽早开始叶片采收。该方法可针对其他植物进行调整，有助于发现或确认新的韧皮部汁液化合物。在进行该操作时，需特别注意在孵育一小时后彻底观察 PDLs，及时去除 EDTA，并避免挤压叶片，以防其他细胞内容物的污染。此外，佩戴手套还可以保护您的样品免受可能通过皮肤引入的污染物的影响。为防止污染，应针对蛋白质、RNA 或代谢物样品使用适当的对照。建议的对照已在文本方案中列出。该方法使我们能够深入了解植物汁液的组成。我们能够在蚁穴渗出物中鉴定出多种脂质，这些脂质原本并不预期会存在于蚁穴地面的水性环境中。这一发现促使我们以及其它研究者提出了长距离脂质信号传导的概念，该概念如今已发展成为一个令人振奋的新兴植入物研究领域。

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生物学

收集和分析<em&gt;拟南芥</em&gt;韧皮部分泌物使用EDTA促进方法

利用表现出组织和器官特异性光敏色素缺陷的转基因植物，正在研究空间特异性光敏色素响应的分子基础。通过荧光激活细胞分选技术分离出光敏色素生色团耗竭的特定细胞，随后进行微阵列分析，以鉴定参与空间特异性光敏色素响应的基因。...

利用FACS辅助的细胞类型特异性表达谱分析研究植物组织和器官特异性的光敏色素反应 拟南芥

一种用于制备的方法 拟南芥 适用于荧光激活细胞分选（FACS）的叶片原生质体，可用于特定细胞群体的研究。该方法适用于任何 拟南芥...

细胞特异性分析 拟南芥 使用荧光激活细胞分选法分离叶片细胞

本文介绍了一种基于未标记与标记去污剂混合物的植物质膜分馏的稳健方法，可将质膜分离为去污剂抗性膜和去污剂可溶性膜 体内 完全 15N标记 拟南芥...

代谢标记与膜组分分离用于比较蛋白质组学分析 拟南芥 悬浮细胞培养

结晶纤维素是植物细胞壁的重要组成成分。然而，在细胞分辨率下对其进行定量在技术上具有挑战性。本文中，我们报道了利用偏振光技术结合根部横切片，以获取具有时空分辨率的细胞壁组分信息。...

高分辨率定量分析结晶纤维素的积累 拟南芥 监测组织特异性细胞壁修饰的根部方法

昼夜节律钟调控约三分之一的拟南芥转录组，但反馈到生物钟调控中的基因所占比例仍不清楚。本文展示了一种利用原生质体中瞬时表达的生物钟报告基因进行发光成像，以快速评估任意拟南芥突变体株系昼夜节律表型的方法。...

转染发光生物钟报告基因的拟南芥原生质体中昼夜表型的快速分析

本文介绍了一种利用三维聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）技术分析油菜（B.

韧皮部汁液采样 Brassica napus 用于蛋白质和核糖核蛋白复合物的三维聚丙烯酰胺凝胶电泳

我们提出了一种用于快速筛选环境样品中铁载体潜力的方案，以评估其在陆地系统中对微量营养素生物有效性和周转的贡献。...

高通量环境样品铁载体筛选：植物组织、原位土壤和根际土壤

本文介绍了一种磷酸化蛋白质组学方法，即基于停止-洗脱提取尖端的磷酸化蛋白质组学技术，可实现高通量且深度覆盖的 拟南芥 磷酸化蛋白质组。该方法阐明了渗透胁迫信号传导的总体概况...

磷酸化蛋白质组学策略用于分析渗透压应激信号通路 拟南芥

根系分泌物的释放通常是植物在胁迫条件下的一种外部解毒策略。本方案描述了如何评估异源物质对苜蓿的影响 通过...

收集苜蓿根系分泌物以研究邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯对代谢物产生的影响

本文介绍了一种改进的拟南芥（Arabidopsis...

高分辨率单颗粒 体内 花粉水合生物测定法 拟南芥

本方案描述了一种优化的方法，用于从拟南芥（Arabidopsis...

利用优化的质外体洗脱液收集方法从拟南芥叶片中分离和纯化植物胞外囊泡

学习使用EDTA促进法收集拟南芥韧皮部分泌物，用于代谢组学和蛋白质组学分析。该方法可鉴定代谢物、蛋白质及RNA，揭示植物长距离信号传导机制。

使用 EDTA 促进法收集和分析 Arabidopsis 韧皮部渗出物

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