收集和分析拟南芥韧皮部分泌物使用EDTA促进方法

该程序的总体目标是从拟南芥或其他植物中收集 flom 渗出物，以分析其内容物或确认 flom 流中化合物的存在。这是通过首先将花瓣切开并在 EDTA 钾中孵育以防止海元素密封来实现的。第二步是彻底清洗花瓣，以去除任何残留的 EDTA，这些 EDTA 可能会干扰后续分析，并在长期暴露期间损坏细胞。

接下来，流 EM 渗出物被收集到水中。她的最后一步是准备样品，以便通过 L-C-M-S-G-C-M-S 凝胶、电泳和薄层色谱进行后续分析。最终，EDTA 促进的 phem 渗出可用于分析和确认 phem 含量，如代谢物和脂质、蛋白质或 RNA。

植物无法逃避不利条件。因此，他们需要非常高效和快速的系统来在整个工厂中传输环境信号，并通过改变开发方式来做出响应。这些信号通路之一是植物流动，要理解其组成非常复杂。

我们使用 EDTA 促进的流动镇静来收集和分析流动内容物。它最初是由国王在 Perilla 开发的，但可以很容易地针对其他物种进行改造。演示该程序的是 Elena 和 US，他们都是我实验室的本科生，在开始此程序之前。

拟南芥生长计划在生长室中生长 4 到 6 周，收集当天有 12 小时的照片时间。用水稀释先前制备的 100 毫摩尔 EDTA 钾溶液，得到最终浓度为 20 毫摩尔。接下来，将 20 毫摩尔 EDTA 钾溶液填充两个直径为 7 至 15 厘米的玻璃培养皿的一半。

完成后，用 1.4 mL 的 20 mLer EDTA 钾溶液填充 1.7 mL反应管。然后用 1.4 毫升 millipore 水填充等量的反应管。从生长室中取出四到六周龄的植物后，用剃须刀片在靠近莲座中心附近的花瓣基部切割莲座叶，收获莲座叶。

立即将叶子放入含有 20 毫摩尔 EDTA 钾的培养皿中，将叶子的切端浸入溶液中。从三到四株植物中收集 15 片叶子后，轻轻地将它们堆叠在一起，使切下的花瓣彼此对齐。重新切开花瓣的基部，轻轻卷起叶子。

然后，轻轻地将卷好的叶子插入含有 20 毫摩尔钾 EDTA 的反应管之一中，用于收集渗出液。在暗线中，一个大浅盘的底部，上面放着湿纸巾。将装有叶子的反应管的架子放在培养皿中，然后将其放入带狭缝的黑色塑料袋中进行曝气。

然后将整个装置放在柜子中以收集渗出液。在光线中，用湿纸巾划清透明有机玻璃容器的底部。将装有叶子填充反应管的架子放入容器中并关闭。

从容器中取出架子后，一小时后，将叶子从反应管中取出。用蒸馏水彻底清洗叶子以去除所有 EDTA。立即将叶子转移到含有 millipore 水的反应管中，并从加湿容器中取出架子后将它们返回到加湿容器中以收集分泌物。

5 到 8 小时后，将叶子从试管中取出，然后将流出物冷冻在液氮中，并将它们储存在零下 80 摄氏度的冰箱中。为了在第二天进行进一步分析，请解冻样品以准备脂质分析。然后抽取 2 至 3 个样品，向混合溶液中加入等量的氯仿和甲醇。

将混合物涡旋几秒钟。接下来，将样品以 400 gs 离心 4 分钟。完成后，在与顶部相重复分配后，将底部有机相收集在玻璃管中，再重复三次，在氮气流下干燥合并的有机相，并提交薄层色谱和 LCMS 分析。

这种方法允许收获足够的 phem 渗出物来识别 phem 定位的蛋白质及其水平响应发育或应激的变化。在某些情况下，研究人员可能希望使用蛋白酶抑制剂来防止蛋白质降解。如图所示，蛋白质的丰度非常低，但它们的水平足以用于后续的蛋白质组学实验。

使用 LCMS 或用于葫芦的蛋白质印迹分析结果表明，STEM 的切割会导致水势平衡的破坏，随后水和可能的污染物从 alast 流入。然而，采集 1 到 8 小时不会影响流式 M 蛋白谱和 InOpSys 的组成。收集的蛋白质量和发现的蛋白质模式因物种和处理而异。

因此，可以可视化、识别和跟踪蛋白质信号。通过这种方法，也可以在 flom 渗出物中鉴定 mRNA 和 microRNA。然而，用 RNA 抑制剂治疗对于防止 MR 降解是必要的。NA 在延长的渗出时间内。

由于 C 元件不含功能性叶绿体，红宝石、小或大亚基 mRNA 可用作阴性对照，而已知的 pH flu m 定位 mRNA 如泛素结合酶可用作阳性对照。同样，糖或小代谢物可以使用 GCMS 或 LCMS 进行分析。值得一提的是，phem 渗出物含有大量的功能性酶，几乎包括整个糖酵解途径。

因此，使用多个时间点可能会揭示渗出液收集过程中的代谢过程。在所有渗出物中，蔗糖是最丰富的代谢物。这在收集一小时后最为明显。

然而，5 小时后，蔗糖与果糖的比率略有降低。如果收集相同的渗出液 1 小时，然后在工作台上再放置 4 小时，则蔗糖与果糖的比率会大大降低到更大程度。表明 phem 渗出物中的活性酶导致蔗糖在室温下降解。

此外，连续收集 5 小时的事实显示蔗糖与果糖的比率仅略有降低，这与 phem 负载和分子从伴生细胞运输到海洋元素的发现一致，在渗出过程中可能会继续，直到系统失去活力。phem 渗出物中的脂质以及延伸的长距离脂质信号传导是植物科学中一个相当新的感兴趣领域。由于其疏水性，脂质仅以低浓度存在，并且可能与其他分子结合进行溶解。

然而，EDTA 促进的渗出允许收集足够的材料来可视化和识别来自几种植物物种的流动和脂质。如图所示，可以使用薄层色谱分离几种脂质。LCMS 允许识别不同的脂质种类并监测不同基因型或处理的脂质谱的变化。

这允许研究脂质在植物发育和胁迫反应中的作用。一旦掌握，这种技术就可以完成，如果执行得当，只需三个小时。但是，对于大多数样品，我们建议采集时间为 5 到 8 小时。

在这种情况下，建议清晨开始采叶。该程序可以针对其他植物进行修改，并可能导致发现或确认新型流动化合物。在尝试此过程时，重要的是要记住在第一个小时后彻底观察 PDL 以去除 EDTA，并且不要挤压叶子以防止被其他细胞的内容物污染。

此外，戴手套还可以保护样品免受可能从皮肤引入的污染物的侵害。为防止污染，请对蛋白质 RNA 或代谢物样品使用适当的对照。文本协议中列出了建议的控件。这种方法使我们能够对植物流的组成有新的见解。

我们能够在渗出物形式中鉴定出几种脂质，这在地板的水环境中是意想不到的。这促使我们和其他人引入了长距离脂质信号转导的概念，该概念现已发展成为令人兴奋的新领域植入物研究。