设计一个连续和操作 13 C和 15Ñ贴标商会统一或差分，代谢和结构，植物同位素标记

该程序的总体目标是在整个植物中均匀地生产富含碳 13 和氮 15 的植物材料，或在结构和代谢组织中产生差异。这是通过首先建造一个用于植物生长的密室来实现的。第二步是控制室内的温度、湿度和二氧化碳水平，以保持适合植物生长的条件。

接下来，植物在密封室中生长，空气中含有 13 C、二氧化碳，并灌溉和施肥含有氮 15。最后一步是通过在收获前几周从腔室中取出差异标记的植物来停止标记，以便它们的代谢物质在碳 13 和氮 15 中的富集程度降低。与收获植物材料后的结构植物成分相比，热水提取和同位素比值、质谱法用于测量整体同位素标记和标记强度的差异。

与其他方法（如叶面施用或重复脉冲标记）相比，连续标记的主要优点是它产生均匀标记的植物材料，这些材料可以在其代谢或结构成分中进行差异标记。要开始此过程，请按照随附文本协议中的描述构建标记室，方法是在带有白色涂漆钢地板的铝框架上安装 3.18 毫米厚的透明丙烯酸壁和 6.35 毫米厚的透明丙烯酸天花板，腔室的尺寸可以定制以适应特定的植物生长需求。这里显示的腔室尺寸为 1.2 x 2.4 x 3.6 米，可容纳 40 个 15 升的罐子，通过用足够的硅酮密封胶覆盖所有接缝来确保腔室的气密性。

将门安装到机械螺钉上，可以使用可拆卸的蝶形螺母拧紧和拧下机械螺钉。用挡风雨条密封门，以防止标签室附近区域漏气。将控制中心安装到显示器上，并调节腔室内的温度、湿度和二氧化碳。

确保进入腔室的电线和气管用硅胶密封良好，以防止漏气。可选择在腔室中添加灯，以增加光线穿透并控制日照时间 调节腔室温度。安装商用分体式空调，蒸发器盘管位于腔室内，压缩机和冷凝器盘管位于腔室外，以散热。

接下来，在室内安装一个小房间除湿机。在除湿机附近的地板上钻一个孔，然后将除湿机的排水管穿过孔，进入装满水的罐子中。这为排水管创造了一个气密密封，并允许压力 E 平衡，通过将可编程控制器（例如带有湿度传感器的 omega eye 系列）连接到除湿机火灾来调节腔体内的湿度。

然后安装红外气体分析仪或带有隔膜泵的 ER A，该隔膜泵连续将空气从 ER A 从腔室中抽出并返回腔室。这保持了一个封闭的系统，同时持续监测腔室内的二氧化碳浓度。接下来，将两个纯二氧化碳气罐连接到二氧化碳控制系统。

其中一个水箱应含有 10 个原子百分比、13 C 或更高的二氧化碳，另一个应含有自然丰度。13 C 二氧化碳。在调节器将电磁阀插入气体管路中以通过 Ergo 软件控制二氧化碳注入后，将气瓶调节器设置为 20 PSI。

通过固态继电器程序将电磁阀连接到 ER rga 来控制电磁阀的打开和关闭，当腔室中的二氧化碳浓度低于一定值时，ergas 软件上的低警报触发电磁阀的打开，死区关闭阀门。一旦二氧化碳浓度达到上限设定点。电磁阀后，在两条气罐管路上各连接一个计量阀，并仔细将它们调整到大气中所需的碳 13 富集水平。

这里我们使用 4.4 原子百分比的碳 13 富集。将出口连接在一起，最后将管线管道连接到风扇之间的腔室中心，这有助于将标记的二氧化碳均匀分布在整个腔室中，以建立灌溉系统。首先，每个花盆创建一个滴灌环，并通过腔壁上的一个小孔将灌溉管送至外部。

然后用硅胶填缝剂密封灌溉管周围的孔，以防止腔室外部漏气。将灌溉管连接到蠕动泵管上，并在其上放置一个小软管夹，以防止浇水之间漏气，在种植花盆之前发芽，以确保存活率，用新鲜的土壤浆料接种幼苗。为了引入有益微生物，请在花盆中加入无土壤的盆栽混合物，以消除从土壤中引入未标记的碳和氮。

在这里，我们使用沙子蛭石和轮廓多孔陶瓷的混合物。种子发芽后，小心地将幼苗移植到花盆中，用最少的盆栽土壤。然后将花盆移入腔室，并用单独的灌溉软管组装每个花盆。

最后，密封腔室的门，通过将碱石灰洗涤器连接到气泵来擦洗外部二氧化碳，直到二氧化碳浓度降至至少百万分之 200 至 250。在将腔室填充回去之前，最高可达百万分之 400。使用 13 C 二氧化碳罐混合物，尽量在整个生长季节期间保持腔室关闭，以尽量减少自然丰度二氧化碳污染。

首先，通过将 15 原子百分比的氮、15 原子百分比的氮、15 硝酸钾与自然丰度氮、15 硝酸钾混合，用氮 15 标记 Hyland 型肥料溶液，然后将其添加到钩子蛋白溶液的其余部分中。在这里，我们使用 7 原子百分比的氮 15 溶液进行施肥。使用蠕动泵通过灌溉管进料氮 15 标记的肥料溶液。

UNC 夹住灌溉软管，并根据需求和实验设计向各个植物分配不同数量的肥料。然后通过软管泵送水，冲洗灌溉软管中的肥料。添加的液体总量不应超过花盆的持水能力，以尽量减少肥料浪费。

Rec 夹，所有软管经过施肥和灌溉，以消除腔室漏气。对于结构和代谢成分的差异标记，请在收获前 1 至 3 周从标记室中取出植物。将要统一标记的植物保留在腔室内，直到收获。

诱导衰老。准备好后只需停止灌溉即可。首先剪掉地上生物量来收获植物。

收获地上生物质后，将盆栽混合物和根部倒在 6 毫米的岩芯筛网上，以从盆栽混合物中分离出根部。然后在 2 毫米的筛网上冲洗根部，以去除任何残留的盆栽材料。必要时使用镊子去除任何可能对根部有粘液的盆栽混合物，然后让根部风干，为未来的实验做准备。

在三个生长季节的运行中，该试验箱成功地将温度保持在 26 到 29 摄氏度之间，湿度保持在 36% 到 56% 之间，二氧化碳浓度保持在百万分之 360 到 400 之间，因为它们是在控制中心设置的。这里展示的是 Andra Pogon Girard di 2011 年生长季的代表性结果。夜间呼吸过程中积累的二氧化碳似乎不会损害生长中的植物，并且在日出后会很快被吸收。

氮 15 标记通过靶向 7 亚当百分比氮 15 疣猪精溶液产生高度标记的植物材料，氮 15 原子百分比为 6.7，目标氮 15 标记的轻微稀释可能是由盆栽混合物中的一些天然丰度氮或来自天然土壤接种引起的。碳 13 标记使用目标原子百分比为 4.4 的 13 C 二氧化碳，结果为 4.46 原子百分比，即碳 13。在均匀标记的植物材料的整个窝中，在收获前 7 天、14 天或 22 天从腔室中取出的差异标记植物在碳 13 和氮方面具有显着差异15。

以热水提取物形式获得的代谢成分和以热水提取物残留物形式获得的结构成分中的含量表明代谢和结构植物材料的标记存在差异。经过开发，连续双同位素标记为生物地球化学研究人员在宏观和纳米尺度上探索环境中植物成分的命运和转变铺平了道路。