用于植物同位素均匀或差异性代谢与结构标记的连续¹³C和¹⁵N标记室的设计与操作

本实验的总体目标是获得整株植物中碳13和氮15同位素高度富集的植物材料，这些同位素可在植物的结构组织和代谢组织中均匀分布，或呈差异性分布。实现该目标的第一步是构建一个密闭的植物生长室；第二步是调控生长室内的温度、湿度和二氧化碳水平，以维持植物生长所需的适宜条件。

接下来，将植物种植在密闭的培养室中，供给含有¹³C的空气、二氧化碳，以及含¹⁵N的灌溉水和肥料。最后一步是在收获前数周将经过同位素标记的植物从培养室中移出，以终止标记过程，从而使植物体内的代谢物质中¹³C和¹⁵N的富集程度降低。在收获植物材料后，与结构性植物组分相比，采用热水提取法结合同位素比值质谱分析，测定整体同位素标记水平以及标记强度的差异。

与叶面施用或重复脉冲标记等其他方法相比，连续标记的主要优势在于能够产生同位素标记均匀的植物材料，并且其代谢组分或结构组分可实现差异性标记。开始本实验前，按照配套文字方案所述构建标记室：将厚度为3.18毫米的透明丙烯酸树脂壁和厚度为6.35毫米的透明丙烯酸树脂顶板安装在铝制框架上，底部为涂有白色油漆的钢板。标记室的尺寸可根据特定的植物生长需求进行调整。本例所示标记室尺寸为1.2米×2.4米×3.6米，可容纳40个15升的花盆。为确保标记室气密性，需使用足量的硅酮密封剂覆盖所有接缝处。

使用可拆卸的蝶形螺母将门安装到机用螺钉上，以便进行旋紧和拆卸。在紧邻标记室的区域，用密封条对门进行密封，以防止空气泄漏。将控制中心安装到显示器上，并调节室内的温度、湿度和二氧化碳浓度。

确保通入舱室的电线和气体管路使用硅胶进行良好密封，以防止空气泄漏。可选择在舱室内增加照明设备，以增强光照渗透并控制光照时长，从而调节舱室温度。安装商用分体式空调，将蒸发器盘管置于舱室内，而压缩机和冷凝器盘管置于舱室外，以便散热。

接下来，在腔室内安装一台小型除湿机。在除湿机附近的地板上钻一个孔，将除湿机的排水管穿过该孔并插入一个预先装有水的广口瓶中。这样可为排水管形成气密性密封，并通过连接带有湿度传感器的可编程控制器（如Omega Eye系列）至除湿机，实现腔室内的压力平衡，从而调节腔室湿度。

然后安装一个红外气体分析仪或带有隔膜泵的ER a，该泵持续将空气从密闭室中抽出，经过ER A后再返回密闭室。这样可在持续监测密闭室内二氧化碳浓度的同时维持一个封闭系统。接下来，将两个纯二氧化碳气瓶连接到二氧化碳控制系统。

其中一个气罐应含有10 atom percent的13C二氧化碳或更高浓度，另一个应含有天然丰度的13C二氧化碳。在气体管路中安装好调节阀后，通过Ergo软件控制的电磁阀来调控二氧化碳的注入，并将气罐调节阀设置为20 PSI。

通过固态继电器程序将电磁阀连接至ER rga，以控制其开关；在ergas软件中设置低限报警，当密闭室内的二氧化碳浓度降至某一设定值以下时，触发电磁阀开启，并设置死区以在二氧化碳浓度达到上限设定值时关闭阀门。在电磁阀后，将计量阀分别连接至两个气瓶的气体管路，并仔细调节计量阀，使大气中的碳13富集度达到所需水平。

此处我们使用碳13同位素富集度为4.4原子百分比的条件。将各出口连接在一起，最后将管道引至风扇之间的培养室中心，有助于将标记的二氧化碳均匀分布到整个培养室中，以建立灌溉系统。首先，每个花盆设置一个滴灌环，并将灌溉管通过培养室壁上的小孔引至外部。

然后使用硅胶密封剂密封灌溉管周围的孔洞，以防止空气从培养室外部泄漏。将灌溉管连接到蠕动泵管上，并在其上放置一个小的软管夹，以防止在两次浇水之间发生漏气。在移栽至花盆前先将种子萌发，以确保其活力，并用新鲜的土壤泥浆接种幼苗。为引入有益微生物，应使用无土栽培基质装填花盆，以避免土壤中未标记的碳和氮进入实验体系。

此处我们使用沙子、蛭石和多孔陶瓷颗粒的混合物。种子萌发后，将幼苗小心地移栽到含少量盆栽土的花盆中。然后将花盆移入培养室，并为每个花盆连接独立的灌溉软管。

最后，关闭腔室门，并将苏打石灰吸收装置连接到空气泵，以清除外部二氧化碳，直至二氧化碳浓度降至至少200至250 ppm。在使用¹³C二氧化碳钢瓶混合气将腔室重新充气至400 ppm之前，尽量在整个生长季节期间保持腔室密闭，以最大限度减少天然丰度二氧化碳的污染。

首先，通过将98原子百分比氮-15的硝酸钾与天然丰度氮-15的硝酸钾混合，标记海兰德型肥料溶液中的氮-15，然后将其加入其余的霍金溶液中。本实验中使用含7原子百分比氮-15的溶液进行施肥。使用蠕动泵将标记了氮-15的肥料溶液通过灌溉管输送。

UNC 夹住灌溉软管，并根据需求和实验设计向各植株施加不同量的肥料。然后通过软管泵入水，以冲洗残留的肥料。加入的液体总量不应超过花盆的持水能力，以尽量减少肥料浪费。

受精和灌溉后，关闭所有软管的夹子，以消除反应室的空气泄漏。对于结构和代谢组分的差异标记，应在收获前一至三周将植株从标记室中移出。需要进行均一标记的植株则保留在标记室内直至收获。

为诱导衰老，只需在准备就绪时停止灌溉。收获植株时，首先剪下地上部分的生物量。

收获地上部分生物量后，将盆栽基质和根系倒在6毫米孔径的筛网上，以分离根系与盆栽基质。随后在2毫米筛网上冲洗根系，去除残留的盆栽材料。根据需要使用镊子清除附着在根系上的盆栽基质，然后让根系自然风干，以备后续实验使用。

在连续三个生长季的运行中，该培养室已成功将温度维持在26至29摄氏度之间，湿度维持在36%至56%之间，二氧化碳浓度维持在360至400 ppm之间，各项参数均按照控制中心的设定执行。图中显示的是2011年生长季Andra Pogon Girard di的代表性结果。夜间呼吸作用导致的二氧化碳积累未对植物生长造成明显损害，并在日出后迅速被植物吸收利用。

通过使用目标为7.7%原子百分比氮15的霍格兰溶液进行氮15标记，获得了标记程度较高的植物材料，其氮15原子百分比达到6.7%；标记水平的轻微稀释可能是由于盆栽基质中存在部分天然丰度的氮，或来自土壤中原有微生物接种所致。使用目标为4.4%原子百分比碳13的二氧化碳进行碳13标记，最终获得的植物材料中碳13原子百分比为4.46%。在整个均匀标记的植物残体中，那些在收获前分别提前7天、14天或22天从培养室中移出的差异标记植株，其碳13和氮15的标记水平存在显著差异。

代谢组分的含量通过热水提取物获得，而结构组分则通过热水提取残渣获得，表明植物代谢物质与结构物质存在差异性标记。该技术发展后，连续双同位素标记法为生物地球化学领域的研究人员探索植物组分在环境中的归趋及其在宏观和纳米尺度上的转化过程开辟了道路。