Name: 设计一个连续和操作 13 C和 15Ñ贴标商会统一或差分，代谢和结构，植物同位素标记 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-16T14:15:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: 了解连续¹³C和¹⁵N同位素标记技术，用于植物代谢与结构组分的差异化标记研究。该方法通过密闭培养室精确控制环境条件，实现植物组织的均匀或差异标记，为生物地球化学研究提供高富集度材料。

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特别感谢科罗拉多州立大学的植物生长设施和EcoCore分析设施，以及众多参与本项目的学生和教师。本研究由美国国家科学基金会（NSF）DEB资助项目 #0918482、美国农业部（USDA）国家需求奖学金以及Cotrufo-Hoppess土壤生态学研究基金资助。

1. 反应室构建
<ol>
	<li>在温室中构建标记室，以最大限度利用自然光照促进植物生长。确保有充足的电源供应，以支持标记室所有组件的运行。</li>
	<li>通过在铝制框架上安装厚度为3.175 mm的透明亚克力墙（聚碳酸酯材料也可适用）和厚度为6.35 mm的透明亚克力天花板，并配以涂成白色的钢制地板，以最大化太阳光反射，从而构建标记室。标记室的尺寸可根据具体研究需求进行调整。</li>
	<li>将标记室安装在由煤渣砖支撑的¾英寸（19 mm）胶合板上。</li>
	<li>在亚克力板、铝制框架和钢制地板上钻孔，并使用螺钉将所有部件固定在一起。</li>
	<li>使用硅胶密封胶对所有接缝进行密封，以确保气密性。</li>
	<li>通过将一块亚克力板用长螺钉固定作为门，并使用可拆卸的蝶形螺母将其锁紧，从而构建一个可开启的门。</li>
	<li>使用防风密封条对门进行密封，防止空气泄漏。</li>
	<li>选择紧邻标记室的区域作为控制中心，用于安装所有温度、湿度、CO2控制及监测设备。</li>
	<li>在标记室墙壁靠近控制中心的位置，为所有电线和气体管路仔细钻设小孔，并使用硅胶密封胶对电线和管路周围的孔洞进行密封，防止空气泄漏。</li>
	<li>通过向标记室内充入高浓度CO2（例如&#160;800 ppm）并静置过夜，检测标记室的气密性。若标记室内CO2浓度保持在初始水平，则说明其具有良好的气密性；若浓度在夜间下降，则需检查所有接缝并重新用硅胶密封胶密封，直至达到气密状态。</li>
	<li>对于适应高光照条件的某些植物，可在标记室外侧紧邻处安装连接定时器的补光灯，以增强光照穿透力和植物生产力。</li>
</ol>
2. 温度和湿度控制
<ol>
	<li>通过安装商用分体式空调来调节室内温度，将制冷（蒸发器）盘管置于室内，压缩机和冷凝器盘管置于温室外部以散发热量。将空调设定为维持所需温度。</li>
	<li>使用小型室内除湿机控制室内湿度。
	<ol>
		<li>在除湿机附近的室内地板上钻一个排水孔。</li>
		<li>拆除除湿机的冷凝水收集盒，并将排水管从除湿机引出，穿过地板上的排水孔。</li>
		<li>在室内下方放置一个装有水的敞口玻璃罐，使除湿机直接排水入罐中。这样可形成气密密封，同时允许压力平衡。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在控制中心安装控制器（例如 Omega iSeries 控制器），并在室内放置湿度传感器。
	<ol>
		<li>使用固态继电器将控制器连接至除湿系统，并设置湿度控制器的高限报警和波动范围，以维持室内最佳生长条件。不同植物种类所需的最适温度和湿度条件有所不同。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. CO2&#160;控制
<ol>
	<li>使用两个纯 CO2 气体钢瓶实现&#160;13C-CO2 富集，其中一个钢瓶内为 10 原子%13C-CO2 或更高浓度，另一个为 1.1 原子%13C-CO2（自然丰度）。</li>
	<li>通过隔膜泵持续将密闭室内的空气抽送至红外气体分析仪（IRGA），再将空气泵回密闭室，从而实时监测 CO2 浓度并维持封闭系统（图 1）。</li>
	<li>在 IRGA 软件中设置低浓度警报和死区带，以将 CO2 浓度维持在目标范围内。本实验中，低浓度警报设为 360 ppm，死区带为 40 ppm，从而将 CO2 浓度控制在 360–400 ppm 之间。</li>
	<li>将一个调节阀连接至每个气瓶，并仔细调节，以达到目标&#160;13C 富集水平。将气瓶减压阀设定为 20 psi。</li>
	<li>在每个气瓶的调节阀与减压阀之间安装一个电磁阀。将两个调节阀的出口连接在一起，并通过管道导入密闭室中心。将固态继电器连接至 IRGA 输出端，以控制电磁阀的开关（图 1）。</li>
</ol>
4. 基于网络的远程监测系统
<ol>
	<li>通过将数据每30秒记录到本地文件中，从红外气体分析仪（IRGA）软件监控CO2浓度。</li>
	<li>创建一个自定义工具（例如&#160;使用Perl或其他编程语言），从本地CO2记录文件中读取数据条目，并结合当前笔记本电脑的时间戳，将其上传至后端Web应用程序。</li>
	<li>设置Web应用程序以查询温度和湿度传感器的数据。</li>
	<li>使用监控系统每五分钟检查一次培养室内的温度状态，以防止空调系统故障时出现可能损害植物的温度骤升。</li>
	<li>在任何标准Web浏览器上监控CO2、温度和湿度数据，以便及时发现并处理任何异常的温度升高或CO2浓度下降。</li>
</ol>
5. 灌溉系统
<ol>
	<li>每个花盆对应的亚克力玻璃培养室壁上钻一个小孔。</li>
	<li>使用灌溉管为每个花盆制作一个滴灌环，并将灌溉管从培养室壁穿至外部。</li>
	<li>用硅胶密封剂密封灌溉管周围的孔洞，防止漏气。</li>
	<li>在培养室外侧，将灌溉管连接至蠕动泵的输液管路。</li>
	<li>使用小型软管夹夹紧所有灌溉管，以防止浇水间隔期间发生漏气。</li>
</ol>
6. 植物移栽
<ol>
	<li>选择适合所种植植物的花盆尺寸。此处使用 40 个 15 L 的花盆。</li>
	<li>通过混合沙子、蛭石和剖面多孔陶瓷制备无土栽培基质。</li>
	<li>通过称量装满基质但未加水的花盆重量，然后将花盆浸水并完全排水后再次称重，测定栽培基质的最大持水能力。利用该最大持水能力，确保在浇水过程中标记的肥料和水不会从花盆中过量渗出。</li>
	<li>在将种子种植到花盆前，先在育苗土中进行萌发。这可确保只有成功萌发的种子才会被移入标记培养室。</li>
	<li>用新鲜土壤悬浊液接种幼苗，以引入有益微生物。</li>
	<li>种子萌发后，小心地将幼苗移栽至花盆中&#160;，数量按实验设计要求进行。</li>
	<li>移栽完成后，将花盆移入培养室，并为每个花盆连接独立的灌溉管路。</li>
</ol>
7. 密封反应室
<ol>
	<li>当首次封闭腔室门时，大量外部空气会充满腔室空间。需清除该外部 CO₂2 通过将苏打石灰洗涤器连接至空气泵以去除二氧化碳2 浓度降至至少200-250 ppm，然后通过使用将腔室重新充至400 ppm&#160;13C-CO2 桶混液</li>
	<li>在整个生长季节期间尽量保持培养室密闭，以尽量减少自然丰度CO₂的进入2 污染。</li>
	<li>通过目视监测植物生长情况，并根据需求调整施肥和灌溉。</li>
</ol>
8. 施肥与灌溉
<ol>
	<li>使用肥料溶液，例如改良的 Hoagland 溶液23通过灌溉系统为植物施肥。</li>
	<li>用标记肥料&#160;15N 通过使用一个&#160;15N-KNO3 目标原子百分比下的亚溶液15N水平通过混合98原子%15N-KNO3天然丰度&#160;15N-KNO3 （0.37 原子%）15N).</li>
	<li>根据盆栽基质的持水能力，在每次施肥时配制足量的肥料溶液，以满足整个培养箱的需求。将一盆所需量的肥料放入一个玻璃瓶中，并按盆数准备相应数量的玻璃瓶。</li>
	<li>松开灌溉软管，将每根软管放入装有肥料溶液的容器中，然后连接至蠕动泵。</li>
	<li>根据植物需求，定期通过蠕动泵将水抽送至各滴灌软管来浇灌植物。</li>
	<li>根据植物需求或实验设计，使用霍格兰营养液进行施肥，随着植物生产力的提高，养分需求相应增加，以最大化生产力。</li>
	<li>首先，通过灌溉管泵入霍格兰营养液，然后泵入清水冲洗，以尽量减少管道中藻类和细菌的生长。</li>
	<li>受精和灌溉后重新夹紧所有软管，以防止腔室漏气。</li>
</ol>
9. 均一标记与差异标记
<ol>
	<li>为实现结构组分与代谢组分的差异标记，应在收获前1至3周将植物从标记室中移出。需要进行均一标记的植物则可一直保留在密闭的标记室中直至收获，并持续用&#160;15N-Hoagland营养液灌溉。</li>
	<li>在此期间，将移出的植物置于温室中，使其接受充足的光照，并在自然丰度&#160;13C条件下获取CO2。</li>
	<li>对于差异&#160;15N标记，应继续按常规方式施肥和灌溉，但在Hoagland营养液中使用自然丰度&#160;15N-KNO3。</li>
</ol>
10. 收获
<ol>
	<li>收获前1周停止浇水，使植株开始衰老，盆栽基质逐渐干燥。</li>
	<li>打开培养室，将花盆移出，立即进行地上部分生物量的剪取和收获。</li>
	<li>将盆栽基质和根系倒在粗筛上。</li>
	<li>利用筛子将根系与盆栽基质分离，并轻轻摇动根系以去除附着的基质。</li>
	<li>将根系置于2 mm筛子上，用水冲洗以去除残留的盆栽材料。使用镊子清除附着在根系上的蛭石颗粒。</li>
	<li>让根系自然风干，以备后续实验使用。</li>
</ol>
11. 凋落物化学
<ol>
	<li>称取风干的植物材料质量，以确定标记室中的生物量。</li>
	<li>研磨一个子样品用于化学分析。</li>
	<li>将 2.0 g 烘干（60 °C）的凋落物放入经酸洗的 125 ml&#160;烧瓶中，并加入 50 ml&#160;去离子水。</li>
	<li>将样品置于预热（60 °C）的搅拌台上，并在烧瓶中放入搅拌子。设置搅拌速度为 200 rpm，使样品加热 30 分钟。</li>
	<li>30 分钟后，通过真空过滤系统，将凋落物溶液经 20 μm 尼龙滤网过滤。</li>
	<li>将滤液转移至已称重的酸洗离心管中并冷冻。</li>
	<li>将固体凋落物残渣转移至已称重的铝盒中，在 60 °C 下烘干。干燥后称量铝盒和残渣质量，以确定热水提取残渣质量。</li>
	<li>对热水提取液进行冷冻干燥，并称重以确定热水提取物质量。</li>
	<li>使用元素分析仪-同位素比值质谱仪（EA-IRMS）分析烘干（60 °C）的凋落物、冷冻干燥的热水提取物以及烘干的热水残渣。</li>
</ol>

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</ol>

作者无披露内容。

用于连续同位素标记的装置设计被用来生成均匀且差异化的&#160;13C 和&#160;15N标记 A. gerardii 用于后续的田间和实验室实验。在连续三个生长季的运行中，该培养室已成功维持了温度、湿度和CO2 设定参数范围内的浓度（图2）。在夏季高温期，强烈的太阳辐射可能导致密闭室过热，此时温度控制系统的工作可靠性至关重要。消除植物蒸腾作用产生的多余湿度，可确保植物气孔保持开放，以利于光合作用的气体吸收。22 且确保水凝结不会阻碍光线穿透或损坏腔室结构。
近连续的 CO 监测2 由红外气体分析仪软件维持的浓度保持连续&#160;13C标记植物，同时植物在培养室中生长。由于植物具有较高的光合作用活性， A. gerardii 在此腔室中生长，CO2 在生长旺季的白天，光合作用活跃，当CO₂被大量吸收时，频繁向系统中注入2 浓度低至 360 ppm，约每 15–20 分钟一次。富集与天然丰度的计量&#160;13C-CO2 储罐实现了对4.4 atom%的精确控制13生长季节期间通过C大气实现植物组织标记的均一化。&#160;13C-CO2 生产也可以通过混合实现&#160;13C-碳酸氢钠或&#160;13C-碳酸钠和盐酸，然而此类系统更为复杂，需要更多的监测与维护，因此我们建议使用&#160;13C-CO2 气体。监测CO时需要考虑的一个重要因素2 使用红外气体分析仪（IRGA）测量浓度时存在的问题是，红外分析仪在测量时会损失三分之二的灵敏度&#160;13C-CO2. 我们对4.4%样品的低估约为2.9% ppm13C-CO2 混合物对我们而言并非主要关注问题，但在进行更高程度标记时可能成为更显著的问题&#160;13C 水平27.
A. gerardii 是一种暖季型多年生高草草原禾本科植物。本实验装置的设计针对 A. gerardii 的生长特性进行了优化（图1）。装置的尺寸和高度综合考虑了 A. gerardii 在野外条件下的最大生长高度，以及后续实验对植物生物量的需求。已知 A. gerardii 在野外生长受光照限制24,25。与室外相比，温室内的光合有效辐射（PAR）可能降低30–47%26。由于本实验中的植物种植于温室内的丙烯酸玻璃装置中，因此需关注 PAR 不足的问题。开启荧光灯后，装置内的 PAR 增加了9.5%，这可能有助于提高该光敏感物种的生产力。若采用此装置设计种植其他植物，应根据具体植物的生理需求，如植株大小、光照需求、养分需求、温度敏感性和土壤湿度等，仔细调整条件，以维持其最佳生长环境。
在使用昂贵的同位素标记化合物时，例如10 atom%13C-CO2 和 98 atom%15N-KNO3，标记效率是一个重要的考量因素。该培养室设计通过尽可能密封培养室并最大限度减少空气进出，从而优化&#160;13C标记效果。若在整个生长季节中培养室始终不开启，则培养室内&#160;13C标记的CO2不会泄漏到大气中。夜间呼吸作用积累的CO2并未对植物生长造成损害，并在日出后迅速被植物吸收（图2）。在进行差异标记时，曾短暂打开培养室以取出差异标记的盆栽，但这似乎并未稀释持续标记植株所目标达到的4.4 atom%13C标记水平（表1）。&#160;13C标记效率还通过在密封培养室时清除初始滞留的大气空气而进一步优化。在初步测试中，若未在封闭前清除培养室内的大气CO2，测得植物最初产生的叶片中&#160;13C丰度低于后期叶片。在关闭培养室时对大气CO2进行初始清除，可有效解决此问题，实现从幼苗到成熟期的连续&#160;13C标记。采用无土壤的栽培基质（如沙子、蛭石和黏土的混合物）还可避免土壤呼吸带来的天然丰度CO2污染。然而，系统中去除土壤后，需特别注意施肥和接种条件，这些条件可能因不同植物种类而异。&#160;15N标记通过目标为7 atom%15N的霍格兰营养液实现，最终获得的植物材料达到6.7 atom%15N的高标记水平（表1）。标记值略低于目标&#160;15N丰度，可能是由于栽培基质中残留的天然丰度氮或接种所用原位土壤中的氮所致。
在化合物生物合成过程中，天然的区分&#160;13C（或&#160;15N）是由于动力学分馏以及合成化合物中同位素的非统计分布而产生的。因此，在碳（C）的情况下，次级产物（例如&#160;脂质、酚类化合物）通常会减少&#160;13C 与初级产物（碳水化合物）相比。这种天然&#160;13C歧视现象在植物生长于富集环境中时似乎仍然存在&#160;13C气氛下，这可从原子百分比的微小差异中看出13C 的热水提取物及热水残留物的测定表1）。这种自然的动力学分馏效应相较于富集作用非常微弱，不会影响标记的均匀性。
对植物结构组织和代谢组织进行差异标记是一种新兴技术，有望推动凋落物分解、微生物生态学及土壤有机质形成等领域的深入研究。其差异在于&#160;13C 和&#160;15热水提取物和热水残留物的N表明存在显著稀释&#160;13C 和&#160;15N 在植物结构材料（热水残渣）中可浸提的低分子量化合物（热水提取物）中的含量，在差异标记 7、14 和 22 天后（P&#60;0.005）。这种对植物组织的差异性标记可用于在生态系统中分别追踪结构组分和代谢组分的去向。 13C差异标记更为显著&#160;15N 差异标记。这可能是由于其即时性&#160;13C稀释度，当将植物从&#160;13C-CO2 标记的大气环境中，而&#160;15氮标签在盆栽混合物中仍会保留一段时间&#160;15N稀释发生得更慢。对于更显著的差异标记&#160;15N，在植株移出培养室前的最后几周，可考虑在进行自然丰度施肥前用水冲洗培养容器。
该连续&#160;13C 和&#160;15N 标记系统的设计与运行，可用于均一或差异性的代谢与结构植物组织标记，为生产同位素标记的植物材料以开展前沿研究提供了一种新颖的方法。本装置的设计与操作细节针对 A. gerardii 实现 4.4 原子%13C 和 7 原子%15N 的标记水平而设定，但也可根据其他植物种类及同位素标记水平的需求进行调整。此处描述的生长条件应根据目标植物物种在尺寸、温度、湿度、光照、水分和营养方面的需求进行相应优化。通过标记灌溉系统所用水，还可实现&#160;18O 或&#160;2H 的标记。本文所述系统解决了植物材料均一及差异性&#160;13C 标记中的诸多挑战。其他研究团队亦可采用这一基础室体设计，制备高标记水平的植物材料，用于生态系统生物地球化学领域的深入研究。

理解植物-土壤-大气过程的动态变化，对于准确预测全球碳（C）和氮（N）循环在当前及未来环境条件下的运行机制至关重要。稳定同位素是定量研究植物-土壤-大气系统中碳氮循环的有力工具。通过追踪植物材料中稀有稳定同位素在生态系统中的迁移路径，可为生物地球化学循环研究提供高灵敏度的信息，涵盖从CO2通量&#160;和土壤有机质形成到小尺度稳定同位素生物标志物探针分析等各个方面&#160;e.g.4,8,9。将&#160;13C标记与&#160;15N标记或其他稳定同位素（如&#160;2H或&#160;18O）在植物组织中的应用相结合，可为植物与土壤生物化学的耦合研究提供一种高检测灵敏度、可示踪但结构复杂的底物。能够对植物的结构组分和代谢组分进行均一或差异性标记，进一步增强了回答生态系统中碳氮循环复杂科学问题的能力。然而，在碳氮收支的定量研究中使用同位素标记植物材料的优势，取决于能否成功制备出具有均一或差异性标记的13C和15N标记材料。
同位素标记已用于植物碳和氮同化研究10分配11 和根际沉积12均匀地 13C 和 15N标记的植物材料为凋落物分解研究提供了复杂的标记底物1,4，土壤有机质形成2,6，土壤CO2 排放4，土壤食物网研究13以及土壤碳滞留时间的研究2,14. 利用以下方法的研究&#160;13由标记植物材料制备的C标记生物炭正开始揭示以往被忽视的土壤炭库的新信息15。尽管 15N, 2H，和 18O标记通过水和肥料处理相对容易实现，但挑战在于生产出均一的 13通过C标记的植物材料 13C-CO2 固定
从幼苗期到成熟期在密闭室中进行连续同位素标记，可实现植物体内同位素标记的均匀分布。其他方法，如重复脉冲标记16以及叶片施用或毛细管吸附17,18，均无法获得均匀的同位素标记植物材料，也无法实现特定碳化合物的明确差异标记（例如&#160;代谢物与结构物之间）19。在同位素标记过程中，标记效率是一个重要考量因素，因为标记所用的富集稀有同位素化合物成本较高。尽管过去已有连续13C标记的应用报道2-4,20，但据我们所知，目前尚无公开发表的技术细节详细描述一种能够实现高标记效率、并精确控制同位素标记量和均匀性的连续标记室系统。
在凋落物分解和土壤有机质形成研究的前沿，一个核心概念是：代谢性植物物质（即 可溶性、易降解、低分子量化合物）与结构性植物物质（即 木质素、纤维素、半纤维素）在微生物利用效率、土壤有机质形成以及长期土壤碳储存方面具有不同的转化途径5-7。因此，对其结构性和代谢性组分进行差异化标记的植物材料，成为推动凋落物分解和土壤有机质形成研究的有力工具。利用双同位素进行差异化标记，可借助多库同位素技术，分别追踪结构性和代谢性组分在生态系统中的转化过程21。
在密闭培养室中使用13C及其他同位素进行连续同位素标记时，必须仔细控制植物生理条件，以最大化植物生长效率和同位素标记效率。在密闭环境中培养植物时，必须控制白天的温度骤升，以防植物受损。需要保持适宜的湿度和温度范围，以维持植物气孔开放及对CO2的吸收22。过高的湿度会导致培养室壁面起雾，从而降低光照可用性，并可能损害培养室结构。在使用昂贵的重同位素标记化合物时，应充分考虑同位素标记效率，包括彻底清除培养室中天然丰度的同位素（例如&#160;来自含有机质土壤栽培引入的同位素），并防止外部空气进入。
本文介绍一种用于构建和运行连续双13C与15N同位素标记室的方法，用于生产植物材料，这些材料可实现整体均匀标记，或其结构与代谢组分达到不同水平的标记。13C标记在培养室层面进行控制，而施肥与15N标记则在单个花盆层面进行控制。文中展示了代表性结果，以证明该方法在整个生长季节中对温度、湿度和CO2浓度的调控能力。通过该方法培养Andropogon gerardii&#160;Kaw的结果也验证了其生产均匀标记或差异性标记植物材料的能力。所述特定的培养室设计与运行方案可进行调整，以适应不同植物物种的培养，也可用于2H或&#160;18O标记。

<table><tbody><tr><td>40 英寸远程遥控塔扇</td><td>Living Accents</td><td>FS10-S3R-A</td><td></td></tr><tr><td>42 英寸带遥控的电塔扇</td><td>LASKO</td><td>2559</td><td></td></tr><tr><td>Mr. Slim 分体式空调</td><td>Mitsubishi Electric</td><td>R410A</td><td></td></tr><tr><td>电子式 24 小时定时开关</td><td>Intermatic</td><td>ET100C</td><td>用于控制荧光灯系统</td></tr><tr><td>iSeries 温湿度控制器</td><td>Omega</td><td>CHiTH-i8DV33-5-El</td><td></td></tr><tr><td>固态继电器</td><td>Omega</td><td>SSRL240</td><td></td></tr><tr><td>CKR 系列固态继电器</td><td>Crydon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>电磁线圈</td><td>Dayton</td><td>6X543</td><td></td></tr><tr><td>GasHound CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 分析仪</td><td>LI-COR</td><td>LI-800</td><td></td></tr><tr><td>除湿机</td><td>Dayton</td><td>1DGX4</td><td></td></tr><tr><td>专用气体减压阀</td><td>Airgas</td><td>CGA 580</td><td></td></tr><tr><td>T5 高输出商用荧光灯系统</td><td>Hydro Farm</td><td>FLT48</td><td></td></tr><tr><td>空气泵</td><td>Thermo Scientific</td><td>420-1901</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex 卡式泵头系统</td><td>Cole Parmer</td><td>7553-70</td><td></td></tr><tr><td>1900 系列网络交换机</td><td>Catalyst</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Profile 多孔陶瓷表层覆盖材料</td><td>Greens Grade</td><td></td><td></td></tr><tr><td>工业级石英砂，40 目</td><td>Unimin</td><td>4095</td><td></td></tr><tr><td>菌根真菌专业栽培基质</td><td>ProMix</td><td></td><td></td></tr><tr><td>蛭石和珍珠岩</td><td>Thermo-Ran</td><td>C633</td><td></td></tr><tr><td>硝酸钾- &lt;sup&gt;15&lt;/sup&gt;N，98 原子%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>335134</td><td></td></tr><tr><td>碳-&lt;sup&gt;13&lt;/sup&gt;C 二氧化碳，10 原子%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>600180</td><td></td></tr><tr><td>医用级 CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Airgas</td><td></td><td></td></tr><tr><td>减压阀</td><td>Airgas</td><td>CGA 350</td><td></td></tr><tr><td>4 英寸箱式风扇</td><td>Grainger</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Masterflex PharMed BPT 泵管</td><td>Cole Parmer</td><td>HV-06508-24</td><td></td></tr></tbody></table>

用于植物同位素均匀或差异性代谢与结构标记的连续13c和15n标记室的设计与操作

Design and Operation of a Continuous 13C and 15N Labeling Chamber for Uniform or Differential, Metabolic and Structural, Plant Isotope Labeling

通过生态系统追踪植物材料中的稀有稳定同位素，可提供关于生态系统过程最灵敏的信息，涵盖从CO2通量、土壤有机质形成到小尺度稳定同位素生物标志物探针等多个方面。将多种稳定同位素（如13C与15N、18O或&#160;2H）联用，有望揭示生物地球化学转化过程中更复杂的化学计量关系。同位素标记的植物材料已被用于多种关于凋落物分解和土壤有机质形成的研究1-4。然而，从这些及其他研究中已逐渐明确，植物材料的结构组分在微生物利用和长期碳储存方面，其行为与代谢组分（即可溶性低分子量化合物）显著不同5-7。能够分别研究结构组分和代谢组分，为推进生态系统生物地球化学研究前沿提供了强有力的新型工具。本文描述一种制备13C和15N标记植物材料的方法，该材料可为整株均匀标记，也可在结构组分与代谢组分中实现差异性标记。
本文介绍了可针对不同研究需求进行调整的连续13C 和 15N 标记室的构建与操作方法。通过从幼苗到收获的连续标记，可获得均一标记的植物材料；而通过在收获前数周将生长中的植物移出标记室，则可实现差异性标记。以种植Andropogon gerardii Kaw 的代表性结果为例，展示了该系统在目标水平上高效标记植物材料的能力。利用该方法，我们已获得具有 4.4 atom%13C 和 6.7 atom%15N 均一标记的植物材料，或其代谢组分与结构组分（分别为热水可提取组分和热水残留组分）中差异标记高达 1.29 atom%13C 和 0.56 atom%15N 的材料。该技术的关键挑战在于：在密闭的13C-CO2环境中，成功种植植物所需维持的适宜温度、湿度、CO2浓度&#160;以及光照水平。该标记室的描述代表了一种有效的研究工具，可用于制备均一或差异性多同位素标记的植物材料，服务于生态系统生物地球化学循环相关实验。

我们的标记室尺寸为 1.2 m × 2.4 m × 3.6 m，可容纳 40,15 L 的盆图1）。计算机化的红外气体分析仪（IRGA）控制系统维持 CO2 在白天光合作用活跃期间，浓度保持在我们设定的360至400 ppm之间（图 2a). 低 CO2 红外气体分析仪的警报功能触发电磁阀，以允许 CO2 来自 13当浓度降至最低阈值以下时，将富集碳和自然丰度碳的储气罐通入反应室例如 360 ppm）。当浓度达到上限设定值时，死区功能停止了气流。例如 400 ppm）。连接到空调和除湿机的iSeries温湿度监控系统在整个生长季节内将气候条件维持在设定参数范围内（图 2b我们使用了一台一吨（3.5 kW）的空调机组来保持室内温度凉爽。
远程监控系统允许通过标准网络浏览器随时查看记录的数据。网络应用程序对 CO2 浓度、温度和湿度值进行降采样，以 24 小时为增量显示过去 24 至 240 小时的图表。这提供了快速的可视化方式，以确认每日波动在预期范围内。查看网页界面还可了解当前培养室的状态，并对可能的问题（如未接收到最新数据）发出警报。在任何时间，也可通过该网页界面下载完整的数据集。
我们使用量子传感器，在夏季正午时分，分别在光照开启和关闭的条件下，测量了密闭舱室内内外四个位置的光合有效辐射（PAR）。当舱室灯光关闭时，舱内的PAR比外部低31.5%；当灯光开启时，舱内PAR比外部低22%。因此，舱室灯光可显著提高舱内PAR的穿透率，增幅达9.5%（P&lt;0.05）。
我们的连续标记系统共生产出 2759 克 A. gerardii 生物量，其中地上部分生物量占 37%，地下部分生物量占 63%。通过相应调节两个 CO2 气罐的电磁阀，我们在均一生长材料中实现了全植株 4.4 atom%13C 的标记水平（图 1，表 1）。通过在改良霍格兰溶液23 的 KNO3 子溶液中混合 98 atom%15N-KNO3 与 0.37 atom%15N-KNO3，我们在均一生长材料中实现了全植株 6.7 atom%15N 的标记水平（表 1）。在整个生长季节中，我们每周为 A. gerardii 浇灌 750 毫升总液体（水加霍格兰溶液）。根据植株生长情况，每周施用 200–500 毫升 15N 标记的霍格兰溶液进行施肥。
我们采用热水提取法，以检测均匀标记和差异标记的植物材料之间是否存在同位素差异。对于差异标记的植物，在收获时我们移除了完全死亡的叶片，并将其单独处理，因为这些叶片很可能未被有效差异标记。在分析13C含量时，无论是整株植物还是热水提取物，四个标记时间点之间的差异均达到显著水平；但对于热水残渣，第14天和第22天之间无显著差异（表1）。在比较每个时间点内不同植物组织组分时，热水提取物与残渣在全部四个时间点均存在显著差异，到第22天时，整株植物、提取物和残渣三者之间均达到显著差异（表1）。在植物组分中15N的掺入情况方面，不同标记时间点及植物组织组分之间均存在差异。对于热水提取物，四个标记时间点在15N含量上彼此之间均具有显著差异；而对于整株植物和热水残渣，较短标记时间与较长标记时间之间的差异显著（表1）。在均匀标记的植物中，不同植物组织组分间的15N含量无显著差异；但在差异标记的凋落物中，热水提取物与残渣之间的15N含量存在显著差异。
所有同位素值均采用原子百分比（atom %）表示法（公式 1），这种表示法在重同位素富集程度较高时比%更为准确21。例如：
<img alt="同位素丰度计算公式，用于化学研究分析的碳-13原子百分比方程。" height="54" src="/files/ftp_upload/51117/51117eq2.jpg" width="202" data-altupdatedat="1787630408000"> (1)
本研究使用 SAS 9.2 版本进行统计分析。采用配对 t 检验分析培养室内部与外部光照水平的差异。使用 PROC ANOVA 中的单因素方差分析（ANOVA）检验热水提取物与热水残留物中 13C 和 15N 标记的差异。多重比较分析采用邓肯多范围检验（Duncan's multiple range test）。显著性水平设定为 P = 0.05。采用 Wilcoxon 秩和检验验证数据是否满足分析的假设条件。
<img alt="温室CO₂控制系统示意图，包含红外气体分析仪、电磁阀和温度传感器。" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51117/51117fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51117/51117fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 图1. 40个花盆容量的连续多同位素标记室俯视示意图。虚线表示电线，实线表示气体或水管路。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51117/51117fig1highres.jpg" target="_blank">点击此处查看大图</a>
<img alt="CO2 浓度、温度、湿度随时间变化；双线图显示环境变化情况。" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51117/51117fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51117/51117fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 图 2. A) 一个生长季期间 24 小时内的平均 CO2 浓度（ppm）（± 标准误差）。 B) 一个生长季期间 24 小时内的平均温度（ºC，空心圆圈）和湿度（%，实心圆圈）（± 标准误差）。 
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51117/51117fig2highres.jpg" target="_blank">点击此处查看高清图像。</a>
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="559">
	<colgroup>
		<col>
		<col>
		<col>
		<col>
		<col span="2">
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:77px;"></td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:92px;">均一处理 (0)</td>
			<td style="width:97px;">差异处理 (7)</td>
			<td style="width:104px;">差异处理 (14)</td>
			<td style="width:104px;">差异处理 (22)</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="38" rowspan="2" style="height:38px;width:77px;">整窝样本</td>
			<td>13C 原子百分比</td>
			<td>4.46±0.02 Aab</td>
			<td>3.93±0.05 Ba</td>
			<td>3.64±0.03 Ca</td>
			<td>3.35±0.06 Db</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">15N 原子百分比</td>
			<td>6.69±0.07 Aa</td>
			<td>6.72±0.01 Aa</td>
			<td>6.33±0.06 Ba</td>
			<td>6.41±0.07 Ba</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="38" rowspan="2" style="height:38px;width:77px;">热水提取物</td>
			<td>13C 原子百分比</td>
			<td>4.59±0.04 Aa</td>
			<td>3.35±0.06 Bb</td>
			<td>2.79±0.06 Cb</td>
			<td>2.37±0.03 Dc</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">15N 原子百分比</td>
			<td>6.69±0.03 Aa</td>
			<td>6.43±0.01 Bb</td>
			<td>5.89±0.07 Db</td>
			<td>6.16±0.05 Cb</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="38" rowspan="2" style="height:38px;width:77px;">热水残渣</td>
			<td>13C 原子百分比</td>
			<td>4.37±0.06 Ab</td>
			<td>4.1±0.03 Ba</td>
			<td>3.79±0.10 Ca</td>
			<td>3.66±0.05 Ca</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">15N 原子百分比</td>
			<td>6.57±0.04 Ba</td>
			<td>6.71±0.02 Aa</td>
			<td>6.45±0.02 Ca</td>
			<td>6.44±0.03 Ca</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1. 均一标记与差异标记凋落物的同位素组成及化学性质。 括号内为在培养室外进行差异标记的天数。每项变量中，标记天数之间的比较以大写字母表示（横向），凋落物组分之间的比较以小写字母表示（纵向）。

本方法介绍了如何构建和操作一个连续的13C和15N同位素标记室，用于植物组织的均一或差异标记。文中讨论了对柳枝稷（Andropogon gerardii）进行代谢和结构标记的代表性结果。

用于植物同位素均匀或差异性代谢与结构标记的连续13C和15N标记室的设计与操作

通过生态系统追踪植物材料中的稀有稳定同位素，可提供关于生态系统过程的最敏感信息；从CO2通量……

本实验的总体目标是获得整株植物中碳13和氮15同位素高度富集的植物材料，这些同位素可在植物的结构组织和代谢组织中均匀分布，或呈差异性分布。实现该目标的第一步是构建一个密闭的植物生长室；第二步是调控生长室内的温度、湿度和二氧化碳水平，以维持植物生长所需的适宜条件。接下来，将植物种植在密闭的培养室中，供给含有¹³C的空气、二氧化碳，以及含¹⁵N的灌溉水和肥料。最后一步是在收获前数周将经过同位素标记的植物从培养室中移出，以终止标记过程，从而使植物体内的代谢物质中¹³C和¹⁵N的富集程度降低。在收获植物材料后，与结构性植物组分相比，采用热水提取法结合同位素比值质谱分析，测定整体同位素标记水平以及标记强度的差异。与叶面施用或重复脉冲标记等其他方法相比，连续标记的主要优势在于能够产生同位素标记均匀的植物材料，并且其代谢组分或结构组分可实现差异性标记。开始本实验前，按照配套文字方案所述构建标记室：将厚度为3.18毫米的透明丙烯酸树脂壁和厚度为6.35毫米的透明丙烯酸树脂顶板安装在铝制框架上，底部为涂有白色油漆的钢板。标记室的尺寸可根据特定的植物生长需求进行调整。本例所示标记室尺寸为1.2米×2.4米×3.6米，可容纳40个15升的花盆。为确保标记室气密性，需使用足量的硅酮密封剂覆盖所有接缝处。使用可拆卸的蝶形螺母将门安装到机用螺钉上，以便进行旋紧和拆卸。在紧邻标记室的区域，用密封条对门进行密封，以防止空气泄漏。将控制中心安装到显示器上，并调节室内的温度、湿度和二氧化碳浓度。确保通入舱室的电线和气体管路使用硅胶进行良好密封，以防止空气泄漏。可选择在舱室内增加照明设备，以增强光照渗透并控制光照时长，从而调节舱室温度。安装商用分体式空调，将蒸发器盘管置于舱室内，而压缩机和冷凝器盘管置于舱室外，以便散热。接下来，在腔室内安装一台小型除湿机。在除湿机附近的地板上钻一个孔，将除湿机的排水管穿过该孔并插入一个预先装有水的广口瓶中。这样可为排水管形成气密性密封，并通过连接带有湿度传感器的可编程控制器（如Omega Eye系列）至除湿机，实现腔室内的压力平衡，从而调节腔室湿度。然后安装一个红外气体分析仪或带有隔膜泵的ER a，该泵持续将空气从密闭室中抽出，经过ER A后再返回密闭室。这样可在持续监测密闭室内二氧化碳浓度的同时维持一个封闭系统。接下来，将两个纯二氧化碳气瓶连接到二氧化碳控制系统。其中一个气罐应含有10 atom percent的13C二氧化碳或更高浓度，另一个应含有天然丰度的13C二氧化碳。在气体管路中安装好调节阀后，通过Ergo软件控制的电磁阀来调控二氧化碳的注入，并将气罐调节阀设置为20 PSI。通过固态继电器程序将电磁阀连接至ER rga，以控制其开关；在ergas软件中设置低限报警，当密闭室内的二氧化碳浓度降至某一设定值以下时，触发电磁阀开启，并设置死区以在二氧化碳浓度达到上限设定值时关闭阀门。在电磁阀后，将计量阀分别连接至两个气瓶的气体管路，并仔细调节计量阀，使大气中的碳13富集度达到所需水平。此处我们使用碳13同位素富集度为4.4原子百分比的条件。将各出口连接在一起，最后将管道引至风扇之间的培养室中心，有助于将标记的二氧化碳均匀分布到整个培养室中，以建立灌溉系统。首先，每个花盆设置一个滴灌环，并将灌溉管通过培养室壁上的小孔引至外部。然后使用硅胶密封剂密封灌溉管周围的孔洞，以防止空气从培养室外部泄漏。将灌溉管连接到蠕动泵管上，并在其上放置一个小的软管夹，以防止在两次浇水之间发生漏气。在移栽至花盆前先将种子萌发，以确保其活力，并用新鲜的土壤泥浆接种幼苗。为引入有益微生物，应使用无土栽培基质装填花盆，以避免土壤中未标记的碳和氮进入实验体系。此处我们使用沙子、蛭石和多孔陶瓷颗粒的混合物。种子萌发后，将幼苗小心地移栽到含少量盆栽土的花盆中。然后将花盆移入培养室，并为每个花盆连接独立的灌溉软管。最后，关闭腔室门，并将苏打石灰吸收装置连接到空气泵，以清除外部二氧化碳，直至二氧化碳浓度降至至少200至250 ppm。在使用¹³C二氧化碳钢瓶混合气将腔室重新充气至400 ppm之前，尽量在整个生长季节期间保持腔室密闭，以最大限度减少天然丰度二氧化碳的污染。首先，通过将98原子百分比氮-15的硝酸钾与天然丰度氮-15的硝酸钾混合，标记海兰德型肥料溶液中的氮-15，然后将其加入其余的霍金溶液中。本实验中使用含7原子百分比氮-15的溶液进行施肥。使用蠕动泵将标记了氮-15的肥料溶液通过灌溉管输送。UNC 夹住灌溉软管，并根据需求和实验设计向各植株施加不同量的肥料。然后通过软管泵入水，以冲洗残留的肥料。加入的液体总量不应超过花盆的持水能力，以尽量减少肥料浪费。受精和灌溉后，关闭所有软管的夹子，以消除反应室的空气泄漏。对于结构和代谢组分的差异标记，应在收获前一至三周将植株从标记室中移出。需要进行均一标记的植株则保留在标记室内直至收获。为诱导衰老，只需在准备就绪时停止灌溉。收获植株时，首先剪下地上部分的生物量。收获地上部分生物量后，将盆栽基质和根系倒在6毫米孔径的筛网上，以分离根系与盆栽基质。随后在2毫米筛网上冲洗根系，去除残留的盆栽材料。根据需要使用镊子清除附着在根系上的盆栽基质，然后让根系自然风干，以备后续实验使用。在连续三个生长季的运行中，该培养室已成功将温度维持在26至29摄氏度之间，湿度维持在36%至56%之间，二氧化碳浓度维持在360至400 ppm之间，各项参数均按照控制中心的设定执行。图中显示的是2011年生长季Andra Pogon Girard di的代表性结果。夜间呼吸作用导致的二氧化碳积累未对植物生长造成明显损害，并在日出后迅速被植物吸收利用。通过使用目标为7.7%原子百分比氮15的霍格兰溶液进行氮15标记，获得了标记程度较高的植物材料，其氮15原子百分比达到6.7%；标记水平的轻微稀释可能是由于盆栽基质中存在部分天然丰度的氮，或来自土壤中原有微生物接种所致。使用目标为4.4%原子百分比碳13的二氧化碳进行碳13标记，最终获得的植物材料中碳13原子百分比为4.46%。在整个均匀标记的植物残体中，那些在收获前分别提前7天、14天或22天从培养室中移出的差异标记植株，其碳13和氮15的标记水平存在显著差异。代谢组分的含量通过热水提取物获得，而结构组分则通过热水提取残渣获得，表明植物代谢物质与结构物质存在差异性标记。该技术发展后，连续双同位素标记法为生物地球化学领域的研究人员探索植物组分在环境中的归趋及其在宏观和纳米尺度上的转化过程开辟了道路。

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设计一个连续和操作<sup&gt; 13</sup&gt; C和<sup&gt; 15</sup&gt;Ñ贴标商会统一或差分，代谢和结构，植物同位素标记

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