Name: 剖析非洲爪蟾神经嵴的在体外外植体培养或在体内移植 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-04T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 7 s
Description: 学习非洲爪蟾神经嵴的体外培养与体内移植技术，用于追踪细胞迁移和分化过程。该方法为研究脊椎动物胚胎发育提供了可靠的实验手段。

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作者感谢阿德琳·多莉（Adeline Dolly）提供纤维连接蛋白上外植体的照片，感谢埃里克·泰夫诺（Eric Theveneau）的有益讨论，以及感谢居里研究所动物实验中心的支持。C.M. 是法兰西岛大区（重点研究领域 Stem Pole）、巴黎第十一大学（临时教学与研究职位）和法国国家科研署的博士后研究员。本研究由巴黎第十一大学（2011 年吸引力计划）、法国国家科学研究中心（主题性与计划性激励行动）、法国癌症研究协会基金（SFI20101201882）、法国抗癌联盟以及法国国家科研署（法国国家科研署 blanc 计划）资助。

实验遵守国家和欧洲关于用于科学目的动物保护的法规，以及国际公认的替代、减少和优化原则。
1. 纤连蛋白包被培养皿的制备14
<ol>
	<li>将500 ml用1×&#160;磷酸盐缓冲液（PBS）稀释的10 mg/ml培养级纤维连接蛋白加入标准塑料培养皿（Ø 40 × 11 mm）中。37 °C孵育1小时。注意：若后续成像使用玻璃培养皿或盖玻片，请使用100 mg/ml的纤维连接蛋白溶液。</li>
	<li>用1×&#160;PBS冲洗三次。</li>
	<li>将PBS替换为500 ml含0.1%牛血清白蛋白（BSA）的1×&#160;PBS。37 °C孵育30分钟。</li>
	<li>用1×&#160;PBS冲洗三次。</li>
	<li>加入1×&#160;PBS并置于4 °C保存备用（通常为24–48小时）。</li>
</ol>
2. 神经嵴外植体的解剖
<ol>
	<li>配制 3/4 正常两栖类培养基（NAM）（110 mM NaCl，2 mM KCl，1 mM Ca(NO₃)₂，1 mM MgCl₂，5 mM HEPES，pH 7.5）3)2，1 mM MgSO₄4，0.1 mM EDTA，1 mM NaHCO₃3，0.2x&#160;PBS，50 mg/ml 庆大霉素10,15）。用于解剖的样品存放时间不要超过1周，需在4 °C保存。较老的NAM可用于制备琼脂糖包被的解剖培养皿（见下文）。</li>
	<li>准备用于解剖的60 mm培养皿，每皿中加入10 ml含2%琼脂糖的3/4 NAM培养基进行包被。</li>
	<li>收集解剖工具：塑料巴斯德吸管、固定在针座上的最细昆虫针（参见材料表参考）、一个 &#34;解剖刀&#34; （使用嵌有眉毛毛发的石蜡封于玻璃巴斯德移液管尖端制成）16），两把精细解剖镊、P1000移液器及吸头、放大倍数为8-40X至50X的双目立体显微镜、带光纤导光束的明亮光源。所有解剖工具应保持清洁；每次实验后，先用蒸馏水冲洗两次，再用100%乙醇冲洗一次，晾干后存放于无尘环境中。</li>
	<li>用新鲜的NAM将解剖皿几乎注满至顶部。</li>
	<li>获取 X. laevis 根据标准操作程序处理胚胎10 并培养至神经胚阶段16期（根据Nieuwkoop和Faber发育表）17).</li>
	<li>使用塑料巴斯德吸管将16期胚胎放入解剖皿中。</li>
	<li>在体视显微镜下进行后续所有步骤。使用两对镊子去除卵黄膜，注意不要损伤胚胎的背侧部分。</li>
	<li>等待胚胎发育至17期后再开始解剖。17期较为合适，因为此时神经嵴已明显与神经管分离，而早期阶段则尚未分离。17期之后，神经嵴细胞开始迁移并与周围的间充质细胞混杂。</li>
	<li>用镊子在琼脂糖中挖一个小孔，为胚胎创造一个容纳空间，以便在解剖过程中固定胚胎。将一个胚胎背侧朝上放置。注意：可使用模型黏土代替在琼脂糖中挖孔来固定胚胎。</li>
	<li>用眉刀和昆虫针在前神经褶的侧部做切口。注意不要切入胚胎过深：应仅切割2-3层细胞（切勿达到原肠深度！）。在整个解剖过程中， 切勿让解剖后的组织接触气液界面 因为 X. laevis 胚胎组织通过表面张力裂解。</li>
	<li>使用相同的工具，在神经褶更背侧的部分做第二条平行切口。</li>
	<li>如有需要，将培养皿旋转90°。使用眉刀和昆虫针在前两处切口的后方做第三个垂直切口。神经嵴位于外胚层色素化外层下方，呈较厚的细胞团块，位于神经管的外侧。</li>
	<li>使用眉刀的尖端从第三次切口边缘开始，将色素化的外胚层与下方的神经嵴分离。</li>
	<li>使用眉刀的侧面从第三个切口处开始分离神经嵴组织。神经嵴组织呈灰白色，而其下方的头端中胚层为白色。小心地将神经嵴组织与中胚层分离。</li>
	<li>将视泡前方的神经嵴组织分离，并在此水平切割以游离出外植体。作为初次实验的对照，进行检查 snail2 表达（一种典型的神经嵴标志物）在某些外植体中 原位 建议进行杂交.</li>
</ol>
3. 在纤连蛋白上接种外植体
<ol>
	<li>用改良Danilchick培养基（MDM，含53 mM NaCl、5 mM Na2CO3、4.5 mM K葡萄糖酸盐、32 mM Na葡萄糖酸盐、1 mM MgSO4、1 mM CaCl2、0.1% BSA，用1 M Bicine调节pH至8.318）填充纤维连接蛋白包被的培养皿。</li>
	<li>使用P1000移液器将外植体转移至纤维连接蛋白包被的培养皿中。切勿让外植体接触气液界面。首先在移液枪头中吸入部分液体，然后吸入外植体，再吸入部分液体。在将外植体转移至纤维连接蛋白包被的培养皿过程中，切勿让空气进入枪头。当枪头进入培养皿中的液体后，让外植体依靠重力缓慢沉降，或极其轻柔地推出。避免过快弹出外植体。</li>
	<li>使用眉刀将10–30个外植体放置于培养皿中。避免靠近培养皿边缘，因为这些区域不适合后续成像。</li>
	<li>在外植体附着于纤维连接蛋白之前（约需15–30分钟），尽量不要移动培养皿。如确需移动，应极其小心地进行。</li>
	<li>将培养皿置于冷藏培养箱中（温度控制在15–20 °C之间，温度参考图表见17）。在15 °C条件下培养约6小时后，细胞通常可有效迁移并发生散射（具体时间可能因实验而异）。</li>
</ol>
4. 将外植体移植到宿主胚胎中
<ol>
	<li>使用粗镊子将细玻璃盖玻片切割成非常小的碎片，碎片大小约为 1.5 mm2。用镊子将碎片浸入含有 3/4 NAM 或 PBS 的培养皿中。</li>
	<li>宿主胚胎的准备：在 3/4 NAM 中按照步骤 3) 所述方法小心分离宿主神经嵴组织，注意在去除卵黄膜和解剖神经嵴时不要损伤宿主胚胎。组织张力容易导致切除区域扩大：在解剖供体胚胎时，可让宿主胚胎部分愈合。</li>
	<li>在另一个涂有琼脂糖的培养皿中，或在同一培养皿的另一区域，按照方案&#160;3 所述方法从供体胚胎中分离出神经嵴外植体。按照方案&#160;3 所述方法，小心将神经嵴移植物转移至含有宿主胚胎的培养皿中。</li>
	<li>立即用镊子将神经嵴外植体放置到宿主被切除的区域，外植体应部分附着。将一小片玻璃盖玻片置于移植胚胎上，以固定移植物位置。选择比胚胎稍大的玻璃碎片，以避免损伤胚胎。此时胚胎会略微变扁。</li>
	<li>等待至少 15–20 分钟后，轻轻移除盖玻片。让胚胎再恢复约 10 分钟，然后使用塑料巴氏移液管小心将其移入盛有 3/4 NAM 的洁净培养皿中。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本方案描述了一种简便的技术，用于分离头颅部神经嵴前体细胞 X. laevis 胚胎。用于此类实验的胚胎必须健康且具有良好的愈合能力。弃用任何一批不健康的胚胎。此外，需在不同温度下（12至18-20 °C）培养胚胎，以便在发育第17期进行神经嵴切除，而不应晚于该时期。超过第17期后，神经嵴可能与头颅中胚层混合，无法完全分离。 非洲爪蟾 组织愈合迅速，随后会失去与其他组织的黏附性。因此，操作需迅速，将神经嵴外植体从供体切除后应立即植入宿主。
关于 体外 实验过程中，纤连蛋白培养皿在数天后可能受到细菌或真菌污染。应尽可能使用抗生素以及洁净或无菌的材料和溶液。
该实验方案已针对颅神经嵴细胞进行优化。实际上，这一细胞群体在17期的Xenopus胚胎中具有明确的定义和定位。遗憾的是，该模型不适用于对躯干神经嵴（NC）进行此类实验。对于希望操作躯干神经嵴细胞群体的研究者而言，鸟类胚胎是更为合适的模型。
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神经嵴（NC）是脊椎动物胚胎中一种短暂存在的胚胎细胞群体，于神经胚形成末期从神经管中产生。调控神经嵴细胞特化的信号通路和遗传事件早在原肠胚形成阶段即已启动。神经嵴细胞在神经外胚层与非神经外胚层交界处被确定，其特化过程受到周围背侧组织信号的调控。在神经胚形成结束时，神经嵴细胞经历上皮-间质转化（EMT），并沿着特定路径在胚胎内广泛迁移&#160;，这一过程依赖于对周围导向信号的响应。当它们到达最终目的地后，可分化为多种细胞类型，例如神经元、胶质细胞、骨、软骨以及色素细胞1-5。由于神经嵴细胞在多种细胞类型和胚胎组织的发育中发挥重要作用，从其诱导到终末分化的任一阶段发生异常，均可能导致一类被称为“神经嵴细胞病”的先天性综合征6。在不同发育阶段——包括特化、EMT、迁移和分化——对发育中的神经嵴进行实验性操控，将有助于加深我们对神经嵴细胞病的理解，并为设计潜在的治疗策略提供依据。
的 Xenopus laevis 胚胎是研究神经嵴发育的首选模型。胚胎易于大量获取，且体外受精使得研究者能够观察发育的最初阶段。已有多种实验工具可用于对其进行操作。 X. laevis 胚胎发育。通过显微注射早期囊胚的单个细胞，可轻松实现基因的过表达和基因敲降。胚胎组织可进行切割以 体外 再结合 7-11 或回移移植实验12,13.
在本方案中，我们描述了如何分离出迁移前的头部神经嵴 X. laevis 晚期神经胚，迁移前阶段。这些外植体可在纤连蛋白包被的培养板上培养，以在受控条件下研究细胞迁移与分化 体外 实验条件。神经嵴外植体也可移植到正常或经处理的宿主胚胎中，以研究其迁移与分化过程 体内.

<table><tbody><tr><td>牛血浆来源的纤连蛋白</td><td>Sigma</td><td>F4759-1MG</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白，第五组分</td><td>Euromedex</td><td>04-100-811-C</td><td>较低纯度级别可能&amp;nbsp;适用于此应用</td></tr><tr><td>不锈钢昆虫针，000号</td><td>FST</td><td>26001</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 镊子，0.05 mm × 0.02 mm</td><td>FST</td><td>11252-20</td><td></td></tr></tbody></table>

解剖 xenopus laevis 神经嵴用于 体外 组织块培养或 体内 移植

Dissection of Xenopus laevis Neural Crest for in vitro Explant Culture or in vivo Transplantation

神经嵴（NC）是一类短暂存在的背侧神经管细胞群，在神经管形成末期经历上皮-间质转化（EMT），广泛迁移至多种器官，并分化为多种衍生物（包括神经元、胶质细胞、软骨与骨、色素细胞及内分泌细胞）。在本方案中，我们描述了如何分离颅部神经嵴的迁移前细胞 Xenopus laevis 胚胎，用于研究神经嵴发育 体内 和 体外青蛙模型在研究早期发育方面具有诸多优势：可获得大量卵批次，胚胎发育迅速， 体内 功能获得与功能缺失策略可用于在供体和/或受体胚胎神经嵴（NC）解剖分离前调控基因表达。神经嵴外植体可接种于纤连蛋白（fibronectin）包被的培养板上，并用于后续实验。 体外 研究。它们可以在无血清的限定培养基中培养数天。我们还描述了如何将神经嵴（NC）外植体重新移植回宿主胚胎中，以研究神经嵴的迁移和分化 体内.

当接种在纤连蛋白上时，神经嵴外植体迅速贴附（15–30 分钟），并在 2 小时内展平（图 1A）。在 3–6 小时后，细胞开始分散。在 15 °C 培养 24 小时后，许多细胞已从外植体迁移出去（图 1B 和 图 1C）。卵黄使细胞在相差显微镜下显得非常明亮（图 1B）。经鬼笔环肽染色标记肌动蛋白细胞骨架后，细胞突起（丝状伪足和片状伪足）清晰可见（图 1C）。
在原位移植实验中，将GFP mRNA注射到供体胚胎中，以便在未标记的宿主胚胎中追踪移植的细胞。宿主胚胎的一侧颅神经嵴被消融；手术后30-60分钟，移植物已愈合，取代了被消融的宿主颅神经嵴（图1D，移植后2小时）。数小时后，GFP阳性细胞从外植体迁移出来，并沿神经嵴细胞典型的迁移路径向颅面部腹侧区域迁移（图1E）。在蝌蚪中，神经嵴来源的颅面结构已发育形成（图1G</strong...

本方案描述了如何从胚胎中分离出迁徙前的颅神经嵴（NC） Xenopus laevis 神经胚。这些外植体可接种于纤维连接蛋白上进行培养 体外或移植回宿主胚胎中。该技术可用于研究神经嵴上皮-间充质转化、迁移及分化的机制。

解剖 Xenopus laevis 神经嵴用于 体外 组织块培养或 体内 移植

神经嵴（NC）是一群短暂存在的背侧神经管细胞，在神经管闭合末期经历上皮-间质转化（EMT）过程……

以下实验的总体目标是追踪Lavis歌神经嵴细胞的迁移过程。该目标通过两个步骤实现：首先，在神经阶段从胚胎中分离出神经嵴组织；第二步，将这些组织外植体接种到经纤维连接蛋白包被的培养皿中，以研究其体外细胞迁移行为。或者，在从宿主胚胎中移除神经嵴后，可将外植组织重新移植回去，以追踪其在体内的迁移过程。最终，可以研究胚胎神经嵴细胞迁移在拉维斯作品发育中的作用。通常，刚接触该方法的人可能会觉得操作困难，因为早期胚胎较为脆弱。神经嵴是一个相对较小的细胞群体，你需要自己制作解剖工具。本方案的可视化演示至关重要。解剖过程中的每个步骤都经过优化，以确保干净地去除神经嵴。实验当天，取一个60毫米的解剖皿，皿底预先铺有约10毫升的2%琼脂糖，并加入正常两栖类培养液（nam），液面加至接近皿口的四分之三处。然后使用塑料移液管将处于16期的XUS lavis胚胎转移至解剖皿中，并将解剖皿置于体视显微镜下。用两套镊子小心去除胚胎的卵膜，注意避免损伤胚胎的背侧部分。然后将胚胎在室温下孵育，直至其发育至17期，即胚胎达到适当的发育阶段。在培养皿底部的琼脂糖中挖一个小孔，为解剖过程中的胚胎创造一个合适的凹槽，随后将胚胎放入孔中，背侧朝上。接下来，使用眉刀和昆虫针在神经褶侧部切开两到三层细胞。然后在神经褶更背侧的部分做一个第二条与第一条平行的中线切口。如有需要，将培养皿旋转90度，接着在前两条切口的后侧做第三条垂直切口。神经嵴位于外胚层色素化外层下方、神经管外侧、头段中胚层上方，呈白色，是一团致密的灰白色细胞团。确定神经嵴后，使用眉刀的刀尖从第三次切口边缘开始，将有色素的外胚层与下方的神经嵴分离。接着，再次从第三次切口处开始，小心地将组织与中胚层分离。然后，将神经嵴组织从视泡前部剥离，释放出外植体。初次学习使用C双杂交实验来检测至少部分外胚层是否表达蜗牛2（snail2），一种典型的神经嵴标志物，以确认正在分离的是正确的细胞群，用于外胚层（X explan）的体外迁移成像。首先，用改良的达纳尔鸡胚培养基填充经纤连蛋白包被的培养皿。接着，为防止外胚层组织接触液体与空气的界面，先用P1000移液枪吸取部分液体至枪头中。然后，将外胚层组织吸入枪头，再吸入更多液体。当移液枪头进入纤连蛋白包被培养皿中的培养基后，让X外植块依靠重力缓慢排出，必要时轻轻推动移液器活塞。接着，使用眉刀在外植块周围进行切割，并将其在培养皿中适当分散。注意避开培养皿边缘，将培养皿静置15至30分钟，期间避免移动，直至X外植块附着于纤连蛋白表面。然后将培养皿置于15至20摄氏度的冷藏培养箱中，直至在将供体神经嵴“茄子”移植到宿主胚胎之前进行成像。使用粗镊子将细小的玻璃盖玻片切割成1.5平方毫米的碎片。接着，解剖出四分之三的宿主神经嵴。如刚才所示，操作时需特别小心，避免损伤宿主胚胎。本实验中最困难的环节是去除宿主神经嵴时不能损伤胚胎

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科研

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生物学

剖析<em&gt;非洲爪蟾</em&gt;神经嵴的<em&gt;在体外</em&gt;外植体培养或<em&gt;在体内</em&gt;移植

培养表达荧光融合蛋白的分离非洲爪蟾（Xenopus...

Xenopus laevis 的神经外植体培养

颅部间充质经历显著的形态发生运动，这可能为神经褶的抬升提供驱动力1,2。在此，我们描述一种简单的ex...

一种用于评估颅部间充质细胞行为的组织块培养实验方法

Xenopus laevis 为研究视网膜细胞在原代细胞培养中的细胞命运决定及单个视网膜细胞的生理功能提供了一个理想的模型系统。本文介绍了一种分离视网膜组织并建立原代细胞培养的方法，该培养物可用于钙活性成像及后续分析 原位...

Xenopus laevis 胚胎视网膜组织的分离、培养与分析

在此，我们开发了所需的工具 离体...

ex vivo 活体成像小鼠神经上皮中的单细胞分裂

本视频展示了一种从鸡胚中脑区域分离颅神经褶的技术。该方法详细介绍了神经褶的解剖过程，以及如何将其放置并附着于纤维连接蛋白包被的盖玻片上，随后观察神经褶中神经嵴细胞的迁移过程。...

从鸡胚中分离颅部神经褶以培养神经嵴细胞

本方案描述了一种改进的器官块培养方法，涉及胚胎小鼠全脑半球的子宫外电穿孔、解剖与体外培养。ex utero...

Ex utero 电穿孔与全半球外植体：一种用于早期皮质发育研究的简单实验方法

Xenopus laevis 胚胎中的面部移植

在Xenopus胚胎中，囊胚腔顶壁的细胞具有多能性，可被诱导分化为多种组织。本文介绍了利用两栖类囊胚腔顶壁外植体作为实验体系，研究早期神经发育关键体内和体外特征的实验方案。...

干细胞样 非洲爪蟾 用于研究早期神经发育特征的胚胎外植体 体外 和 在体 内

上皮-间质转化（EMT）使癌症细胞获得侵袭能力。为研究EMT，可采用基于神经干细胞（NSC）的方法 体外...

一种适用于药物发现的无酶无血清神经干细胞培养模型用于EMT研究

本方案描述了从小鼠模型中分离和培养颅神经嵴细胞的方法，主要用于细胞迁移研究。我们介绍了所使用的活体成像技术，以及对细胞运动速度和形态变化的分析方法。...

小鼠颅神经嵴细胞的分离、培养及分析：用于研究神经嵴细胞脱离与迁移

我们提出了一项分为两个部分的实验方案，该方案结合了荧光钙成像与原位杂交技术，使实验人员能够在单细胞水平上将钙活动模式与基因表达谱相关联。...

荧光钙成像与后续原位杂交用于神经前体细胞表征 Xenopus laevis

学习非洲爪蟾神经嵴的体外培养与体内移植技术，用于追踪细胞迁移和分化过程。该方法为研究脊椎动物胚胎发育提供了可靠的实验手段。

解剖 Xenopus laevis 神经嵴用于体外组织块培养或体内移植

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