Name: 为感觉运动整合与认知控制实验完全自动化的啮齿动物调理协议 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-15T18:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: 学习啮齿动物操作性条件反射的全自动化行为框架，采用五孔鼻触设计研究感觉运动整合与认知控制。该方法通过听觉指令提示精确控制任务时间，减少运动行为干扰，为工作记忆、决策制定和运动规划的神经机制研究提供新途径。

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本工作由 NINDS 资助项目 #NS054148 支持。

所有涉及动物的实验程序均经密歇根州立大学机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准。
1. 实验设置
<ol>
	<li>使用一个操作性条件反射箱，其一侧为五孔鼻触墙，另一侧为食物递送槽。
	<ol>
		<li>中间的鼻触孔被视为&#34;注视&#34;孔，其余四个孔（注视孔两侧各两个）被视为运动目标孔。每个孔均配备一个三色LED和一个红外光束发射-检测系统，用于检测动物进入和退出注视孔的行为。</li>
		<li>使用可编程音调发生器生成具有毫秒级精度的单频音调，并将其连接至安装在操作箱内部的扬声器。通过适当的行为追踪软件控制音调发生器和鼻触输入。使用能够以毫秒级时间尺度监测行为事件并控制提示和反应的硬件与软件系统。 
		注意：音调和噪声提示的强度应保持在约 60 ± 3 dB SPL。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 早期习惯化
<ol>
	<li>逐渐将受试对象的食物摄入量限制至约5 g&#160;每100克&#160;受试者正常体重的（例如 3天内）。受试者应保持其85-90%的 随意摄取 重量</li>
	<li>从食物剥夺方案的第一天起，让受试对象习惯实验人员的抓握操作，并使其熟悉实验装置。开始抓握动物并将其放入操作性条件反射箱中，同时在食丸槽内提供食丸，以鼓励受试对象探索箱体环境并熟悉奖励投放位置。</li>
</ol>
3. 受试者训练
<ol>
	<li>一般注意事项
	<ol>
		<li>此处建议的任务需要对听觉线索的感知、延迟期间的运动抑制以及运动执行进行精确协调。</li>
		<li>逐步对受试者进行渐进式训练，以使其为最终期望的行为做好准备。</li>
		<li>确保在每一步结束时，受试者保持 &#62;连续三个阶段中每个阶段的行为表现均达到75%或以上，方可进入下一阶段。</li>
		<li>当达到最终阶段后，让受试者继续遵循该方案一周，以确保其表现维持在理想水平。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>开始： 让受试者熟悉鼻触孔、食物递送口，以及闪烁孔与奖励之间的关联。
	<ol>
		<li>在随机安排下从四个目标中选择一个。</li>
		<li>播放“Go”提示音（白噪声），并保持孔内LED闪烁（脉冲持续时间0.3秒）。</li>
		<li>设置软件，当受试对象访问洞口时给予奖励。</li>
		<li>30 秒后终止试验&#160;如果未访问该孔，则开始新试验。</li>
		<li>不要奖励对错误孔位的任何访问。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>靶点选择： 惩罚对未选择孔洞的错误访问。
	<ol>
		<li>当动物探查错误的孔洞时，立即终止该次试验，随后进行5秒的间隔&#160;失明。 
		注意：在 blackout 时期，笼内的注视孔 LED 会关闭。这意味着受试者无法启动试验，必须等待注视孔 LED 开始闪烁。</li>
		<li>选择一个新的孔位并开始新的试验。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>鼻触 训练受试者将手指伸入固定孔以启动一次试验。
	<ol>
		<li>在注视孔内闪烁黄色LED。</li>
		<li>到达固定孔后立即播放“Go”提示音并开始新一次试验。</li>
		<li>错误访问将被罚时5秒&#160;失明。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>延迟： 训练受试者在固定时间内（延迟期）将鼻子保持在固定孔内，并随着训练的进展逐渐延长该时间。
	<ol>
		<li>等待受试者注视注视孔。</li>
		<li>若受试者在500毫秒内撤回，则终止试验；否则，播放Go提示。</li>
		<li>通过设置7秒的空白期来惩罚过早回缩。</li>
		<li>通过递送食物颗粒来奖励正确的访问行为。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>两个提示（带灯光）： 增加并随机化延迟期时长，同时引入听觉指令提示。
	<ol>
		<li>将延迟期的时长增加至平均1.5秒。</li>
		<li>每次试验中，根据1.3-1.8秒之间的均匀分布随机选择一个延迟时间段。</li>
		<li>以单频声音脉冲三联组形式呈现指令提示音，每个脉冲持续时间为150毫秒，脉冲间间隔为100毫秒。
		<ol>
			<li>在受试者进入注视孔后立即播放指令提示。</li>
			<li>为每个目标分配两个指令提示。</li>
			<li>此阶段每个目标仅使用一个相关线索。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>让受试者利用听觉和视觉线索选择目标孔。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>两个提示（无光照）： 训练受试者仅使用听觉线索。
	<ol>
		<li>关闭目标孔内的闪烁LED，使受试者仅依赖听觉指令线索。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>四个提示： 将另外两个提示加入随机呈现的指令提示序列中，并重复执行步骤 3.5.3–3.6.1。</li>
</ol>
4. 行为数据的分析
<ol>
	<li>成功率：将成功率定义为正确访问目标的次数占总试验次数的百分比。
	<ol>
		<li>在训练的每个阶段测量成功率。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>错误类型：
	<ol>
		<li>过早回撤：测量因过早从注视孔回撤而导致超时的试验所占的百分比。</li>
		<li>误报错误：计算受试者访问了未指示的目标而导致试验失败的百分比。</li>
		<li>遗漏错误：计算试验开始后受试者未访问任何目标所产生的错误所占的百分比。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>测量变量：
	<ol>
		<li>反应时间（RT）：在每次试验中，测量“开始”提示出现至受试者从注视孔回撤之间的时间延迟。</li>
		<li>到达目标时间（TT）：测量受试者从注视孔回撤至进入目标孔之间的时间持续时间。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Cisek, P., Kalaska, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+mechanisms+for+interacting+with+a+world+full+of+action+choices%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neural mechanisms for interacting with a world full of action choices.</a> Ann. Rev. Neurosci. 33, 269-298 (2010).</li>
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<li>Jaramillo, S., Zador, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+auditory+cortex+mediates+the+perceptual+effects+of+acoustic+temporal+expectation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The auditory cortex mediates the perceptual effects of acoustic temporal expectation.</a> Nat. Neurosci. 14, 246-251 (2010).</li>
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<li>Raposo, D., Sheppard, J. P., Schrater, P. R., Churchland, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multisensory+decision-making+in+rats+and+humans%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Multisensory decision-making in rats and humans.</a> J. Neurosci. 32, 3726-3735 (2012).</li>
<li>Bari, A., Dalley, J. W., Robbins, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+application+of+the+5-choice+serial+reaction+time+task+for+the+assessment+of+visual+attentional+processes+and+impulse+control+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">The application of the 5-choice serial reaction time task for the assessment of visual attentional processes and impulse control in rats.</a> Nat. Protoc. 3, 759-767 (2008).</li>
<li>Brasted, P. J., Dunnett, S. B., Robbins, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unilateral+lesions+of+the+medial+agranular+cortex+impair+responding+on+a+lateralised+reaction+time+task%5BTitle%5D)+AND+%22Behav.+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Unilateral lesions of the medial agranular cortex impair responding on a lateralised reaction time task.</a> Behav. Brain Res. 111, 139-151 (2000).</li>
<li>Gage, G. J., Stoetzner, C. R., Wiltschko, A. B., Berke, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+activation+of+striatal+fast-spiking+interneurons+during+choice+execution%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Selective activation of striatal fast-spiking interneurons during choice execution.</a> Neuron. 67, 466-479 (2010).</li>
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<li>Mohebi, A., Oweiss, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+ensemble+correlates+of+working+memory+in+the+rat+medial+prefrontal+cortex%5BTitle%5D)+AND+%2241+st+Ann.+Meet.+Soc.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neural ensemble correlates of working memory in the rat medial prefrontal cortex.</a> 41 st Ann. Meet. Soc. Neurosci. , (2011).</li>
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<li>Thorndike, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+intelligence%3A+An+experimental+study+of+the+associative+processes+in+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Psychol.+Monographs%3A+Gen.+Appl%22%5BJournal%5D)">Animal intelligence: An experimental study of the associative processes in animals.</a> Psychol. Monographs: Gen. Appl. 2, 1-109 (1898).</li>
</ol>

作者声明&#160;不存在相互竞争的经济利益。

大鼠在神经科学研究中已广泛应用了一个多世纪。自桑代克在猫身上提出效果律概念以来34，操作性条件反射一直是测试动物行为不同方面的标准方法。许多涉及决策和运动准备的神经科学实验在指令线索和动作区间之间设置了延迟期。在这些延迟期间，最好尽量减少动物的运动，以降低对所获取神经数据的干扰。虽然传统的啮齿类动物迷宫导航实验利用了啮齿类动物强大的觅食能力，但这类实验受限于动物的实际运动，因此无法用于研究决策和运动规划等更复杂的问题。尽管迷宫任务易于实施——因为受试动物能快速学会导航——但在任务的每个阶段，外在行为均不受限制例如 T迷宫的中央臂
本文介绍了一种受啮齿类动物视觉注意研究启发的灵活实验框架。我们提供的代表性结果表明，即使多个感觉线索与单一运动目标相关联，动物仍能够学会该任务。选择此设计旨在检验工作记忆在指导运动行为中的作用能力。该实验方案中最关键的步骤是训练受试动物在整个延迟期间将鼻部保持在固定孔内。
由于额叶区域与许多皮层及皮层下区域存在相互连接，精确控制行为事件的时间进程，并将这些事件的...

研究神经生理学与行为之间的关系是系统神经科学的最终目标。从历史上看，动物模型的选择与行为谱之间存在权衡1-5。虽然像海蛞蝓6或鱿鱼7这样的简单生物已被广泛用于研究单个离子通道、神经元以及简单神经回路的特性，但研究更复杂的功能（如空间导航、决策8-11和认知控制12-14）则需要更高阶的物种。尽管非人灵长类动物是模拟人类行为的标准动物模型，但其使用涉及成本和伦理问题，限制了在单一实验室环境中开展广泛实验的可行性15-18。因此，通常更倾向于使用啮齿类等较简单的动物模型19，前提是它们在感兴趣的行为背后具有类似的神经基础。
大量证据表明，啮齿类动物具有与灵长类动物相似的大脑皮层和皮层下结构20-22。已知啮齿类动物能够整合多种感觉模态的信息以指导其行为23-25，例如在探索行为中协调触须运动与嗅探活动26，或整合听觉与视觉/嗅觉事件25,27。
本文描述了一种用于测试啮齿类动物认知任务的操作性条件反射框架28-32。在此框架中，实验动物需将鼻部固定于鼻触孔内，并在“开始”提示出现前始终保持鼻部位于孔中。该行为任务采用五孔鼻触设计，通常用于五选一序列反应时间任务的研究。在延迟期间，呈现一系列指导性提示，以引导动物执行相应动作。该框架可轻松修改，适用于多种需要训练动物在短时间内最小化明显运动的实验。这使得研究人员能够探究在此期间特定提示对单个神经元放电活动的影响程度。该方案可缩短训练时间，并减少个体间学习差异。任务的示意图流程见图1。

<table><tbody><tr><td>5孔鼻触响应箱（带3种刺激提示灯，大鼠用）</td><td>Coulbourn</td><td>H21-06M/R</td><td></td></tr><tr><td>测试箱</td><td>Coulbourn</td><td>H10-11R-TC</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>图形化状态控制软件</td><td>Coulbourn</td><td></td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>可编程音调/噪声发生器</td><td>Coulbourn</td><td>A12-33</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>无粉尘精密颗粒饲料</td><td>Bio-Serv</td><td>F0165</td><td></td></tr><tr><td>扬声器模块</td><td>Coulbourn</td><td>H12-01R</td><td>&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

一种用于感觉运动整合与认知控制实验的大鼠全自动条件化方案

A Fully Automated Rodent Conditioning Protocol for Sensorimotor Integration and Cognitive Control Experiments

啮齿类动物传统上被用作涉及多种感觉、认知和运动任务的实验室实验中的标准动物模型。然而，对于需要精确控制感觉运动反应的高级认知功能（如决策和注意力调节），通常在非人灵长类动物中进行评估。尽管灵长类动物行为丰富，可支持这些功能的多种变体研究，啮齿类动物模型仍是一种具有吸引力且成本效益高的替代方案。此外，在研究这些复杂功能的广泛范围时，能够完全自动化地对啮齿类动物进行操作性条件反射训练，相比耗时耗力的非人灵长类动物训练，具有独特的优势。
本文介绍了一种对大鼠进行操作性条件训练以执行工作记忆任务的实验方案。在任务的关键阶段，该方案要求动物“注视”直至接收到“开始”提示，从而最大限度地减少动物明显的身体移动，类似于非人灵长类动物的实验设计。我们采用一个简单的二选一迫选任务来展示其执行效果，并讨论了该范式在其他任务中的应用。

该建议的框架能够使受试者接受一系列认知任务的训练。在此，我们实施了一项指令延迟任务，旨在研究啮齿类动物前额叶皮层中目标导向行为的机制。图1展示了实验设计的流程图。
为了确保受试者在每个步骤中都能理解任务要求，应持续评估其表现。图2展示了某一位受试者在多次实验会话中的典型表现。当受试者掌握任务后，会在其前边缘区（对应于内侧前额叶皮层）植入一个32通道的微电极阵列。记录多单元放电活动和局部场电位（LFPs）。使用标准的脉冲波形分类技术33分离单个神经元的脉冲序列，并标记与任务不同阶段相关的事件。图3和图4展示了一些在任务关键阶段选择性调控多个单神经元活动的示例结果。
<img alt="行为任务流程图；实验示意图：试验启动、线索注意、目标选择过程。" fo:content-width="6in" fo...

提出了一种用于啮齿类动物操作性条件反射的全自动化实验方案。该方案依赖于对行为事件的精确时间控制，以研究这种控制在多大程度上影响感觉运动整合及认知控制实验中潜在的神经活动。

啮齿类动物传统上被用作涉及多种感觉、认知和运动任务的实验室实验中的标准动物模型。

以下实验的总体目标是建立一种用于啮齿类动物操作性条件反射的自动化行为学框架，以检测复杂的认知任务。该行为学任务采用五孔鼻触式设计，通常用于五选择序列反应时间任务研究。受试动物需在短暂的延迟期后，将鼻部保持在固定孔内，直至“开始”信号出现。在注视阶段期间，通过听觉指令队列引导受试者选择未来的运动目标以获得奖励。使用听觉队列可实现不同任务阶段之间明确的转换，并允许研究行为的多个方面，以及工作记忆、决策和运动规划的神经机制。与现有方法（如迷宫导航实验）相比，该技术的主要优势在于，在任务的关键时期，可能因受试者运动轨迹的系统性变化而产生混淆的明显运动行为被最小化。尽管该方法可用于研究运动控制，但也能够用于探究其他高级认知过程，例如感知、注意力以及记忆形成。本实验操作将由我实验室的本科生 Dylan Miller 进行演示。以下研究在操作条件箱中进行，箱体一侧设有五孔鼻触墙，相对一侧设有食物递送槽。中央的鼻触孔被视为固定孔，位于固定孔两侧、每侧各两个的其余四个孔则被视为运动目标孔。每个孔均配备了一个三色LED和一套红外光束发射-检测系统，用于检测动物进入和退出固定孔的动作。一个可编程音调发生器以毫秒级精度产生单一频率的音调，并连接至安装在操作箱内部的扬声器。声音发生器和鼻触孔通过行为追踪系统进行控制。在适应期使用专用软件，每天对动物进行操作，使其逐渐熟悉操作条件反射箱和食斗，并在三天内逐步限制其食物摄入量，使其体重达到原始体重的85%至90%。第一步是让受试动物熟悉鼻触孔、食物递送口，以及闪烁孔与奖励之间的关联。为此，需在两个目标中随机选择一个，并播放“go”提示音（一种白色听觉噪声），同时目标孔内的LED灯闪烁。将软件设置为当受试者访问目标孔时给予奖励。若在30秒内未发生访问，则将该次试验计为超时，并启动下一次试验以辅助目标选择。若动物探入错误的孔，则以终止试验并伴随五秒黑暗作为惩罚。随后，选择一个新的孔并开始下一次试验，直至达到预期的表现水平。通过此方法训练受试者将头部探入固定孔内。开始试验时，注视孔内会闪烁一个黄色LED。当受试者进入注视孔后，立即播放“开始”提示音并启动新试验。一旦受试者学会进入注视孔，即训练其将鼻部保持在孔内一段设定的时间。为此，需等待受试者访问注视孔并结束试验。如果受试者在500毫秒内回撤，则通过七秒的黑屏期惩罚过早回撤行为。否则，播放“开始”提示音，并通过递送食物颗粒奖励正确访问。下一步是引入听觉指令序列，即一个单频听觉音调，以脉冲形式呈现，每个脉冲持续150毫秒，脉冲间间隔100毫秒，且以三重脉冲组形式出现。此外，将延迟期的长度增加至平均1.5秒。在每次试验中，从1.3至1.8秒之间的均匀分布中随机选择一个延迟期长度。在受试者进入注视孔后立即播放指令提示音。为每个目标分配两个指令提示音。但在本阶段，每个目标仅使用其中一个关联的提示音，直到受试者对该任务更加熟悉为止。让受试者利用听觉和视觉线索选择目标孔，直至达到期望的性能水平。为了训练受试者仅使用听觉线索，关闭目标孔内的闪烁LED灯，使受试者只能依赖听觉指令线索。当达到期望的性能水平后，将另外两种线索引入随机呈现的指令线索序列中，并重复训练步骤。确保在每个步骤结束时，受试者在至少连续三个会话中的行为表现保持在75%以上，方可进入下一阶段。达到最终阶段后，让受试者继续执行该方案一周，以确保其表现维持在理想水平。将成功率定义为正确到达目标的次数占总试验次数的百分比。应在训练的每个阶段测量成功率。不同类型的错误包括：过早回撤，即由于受试者过早从注视孔撤回而导致试验超时的比例（任务错误）；受试者访问未构建的目标时导致试验失败的比例，以及任务错误；受试者在试验开始后未访问任何目标时出现错误的比例。每次试验中，测量反应时间，即从“开始”提示出现到受试者从注视孔移开之间的时间间隔。同时测量到达目标所需时间，即从受试者离开注视孔到进入目标孔之间的持续时间。此示例展示了单个受试者在14次记录会话中的成功率。错误类型主要为过早撤回，而出现指令错误和遗漏错误的频率较低。该直方图显示了不同试验中反应时间的分布情况。此处展示了不同试验中到达目标时间的分布。当受试者掌握任务后，将其植入一个32通道的微电极阵列。在前肢区域，显示的样本轨迹与22个同时记录的神经元的点阵图对齐。行为事件的标记叠加在轨迹上方。在尝试该操作过程中，重要的是每次训练前需检查Perus，并在训练后监测受试者的表现。行为评分的显著下降可能是设备故障所致。该技术将为认知神经科学领域的研究人员探索目标导向行为的自上而下调控机制提供途径。

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科研

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行为

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